當(dāng)歸提取物的鑒定及鎮(zhèn)痛活性觀察

1、當(dāng)歸提取物的鑒定及鎮(zhèn)痛活性觀察         【摘要】  目的 鑒定當(dāng)歸提取物的主要化學(xué)成分，并觀察其鎮(zhèn)痛作用。方法 采用Molish反應(yīng)和Fehling實驗反應(yīng)對當(dāng)歸提取物進行鑒定，苯酚硫酸法測定其糖含量;采用小鼠扭體法和熱板法觀察當(dāng)歸提取物的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果 當(dāng)歸提取物的主要成分為多糖，其糖含量為81.4%，此提取物可明顯抑制醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)，提高小鼠痛覺反應(yīng)的痛閾。結(jié)論 此當(dāng)歸提取物主要成分為多糖，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。 【關(guān)鍵詞】  當(dāng)歸提取物;鑒定;多糖;鎮(zhèn)痛作用ABSTRACT ：

2、Objective To identify and analyze the main composition of Angelica Sinensis extract and to investigate its analgesic effect.Methods The identification test was processed with Molish test and Fehling test, the polysaccharide content analysis was processed by phenolsulfuric acid reaction. The analgesi

3、c effect was investigated by acetic acidinduced wringing test and hotplate procedure in mice.Results The main composition of Angelica Sinensis extract was polysaccharide, the polysaccharide content of Angelica Sinensis extract was 81.37%. The frequency of wringing reaction induced by acetic acid was

4、 obviously decreased, and the pain threshold of mice in the hotplate procedure was increased after the animals were administered with Angelica Sinensis extract.Conclusion The result indicates that the main composition of Angelica Sinensis extract is polysaccharide, and it possesses significant analg

5、esic effect.KEY WORDS：Angelica Sinensis extract; Identification; Polysaccharide; Analgesic effect當(dāng)歸Angelica Sinensis (Oliv.) Diels是祖國醫(yī)學(xué)中最常用的中藥材之一，可用于活血通經(jīng)、虛寒腹痛，亦可治跌打損傷。當(dāng)歸在歷代方劑中應(yīng)用頻度極高，已被證明具有復(fù)雜的生物活性13。我們從當(dāng)歸中提取到一種組分，對其主要成分進行了初步鑒定，并觀察了其鎮(zhèn)痛作用。1 材料和方法1.1 儀器與藥品Savant ecs100UVS400A 冷凍真空干燥機;RB200智能熱板儀，成都泰盟科技有限

6、公司。葡萄糖對照品，Amresco。阿司匹林片，昆明制藥廠，臨用前取研碎后配制成12g/L的濃度。1.2 實驗動物昆明小鼠50只，雌性，體質(zhì)量20±2g，購于湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。1.3 當(dāng)歸提取物的制備當(dāng)歸100g，切片，乙醇回流后100沸水提取，提取液60減壓濃縮至60ml，加入95%乙醇3200ml，充分攪拌，-20靜止48h后取上清，用乙酸乙酯萃取，收集水相，上大孔樹脂柱，分別用甲醇、乙醇、水過柱，收集水洗脫組分，60減壓濃縮后加入適量丙酮，4000rpm離心10min，收集沉淀，用水溶解后揮去溶劑，活性炭過濾，濾液-80冰箱預(yù)凍2天后于冷凍干燥機冷凍至干燥。1.4 試劑制備(1

7、)Fehling試劑：6.25g CuSO4加水定容至100.0ml，普通濾紙過濾;34.9g酒石酸鉀鈉與10.0gNaOH加水定容至100.0ml，普通濾紙過濾。臨用前兩濾液等體積混合。(2)5%苯酚試劑：取苯酚100.0g，加鋁片0.1g和NaHCO30.05g，蒸餾，收集182餾分，稱取7.5g，加水150ml溶解，置棕色瓶內(nèi)冷藏備用。(3)當(dāng)歸溶液：取凍干的當(dāng)歸提取物，分別配成9.0g/L、18.0g/L、36.0g/L的溶液，115滅菌30min后備用。1.5 當(dāng)歸提取物的鑒定(1)Molish反應(yīng)：取當(dāng)歸提取物10.0mg，加水1.0ml溶解，加2滴15%萘酚乙醇溶液，混合搖勻后，

8、沿管壁緩緩加入硫酸0.50ml，將試管靜置10min后50水浴5min觀察在兩液面交界處有無紫紅色環(huán)出現(xiàn)。(2)Fehling實驗：取當(dāng)歸提取物10.0mg，加水定容至200ml，取4.0ml置試管中，加5%鹽酸液1.0ml，沸水水浴15min，室溫靜止至冷，加酚酞指示劑1滴，用10%NaOH試液中和至中性，加Fehling試劑45滴，50水浴5min，觀察是否生成棕紅色沉淀。1.6 多糖含量測定按照文獻方法，精密稱取105干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品120mg，加水定容到100ml，得1.2mg/ml葡萄糖貯備液，分別精密吸取葡萄糖貯備液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml

9、、5.0ml，定容至100ml，搖勻，分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液1.0ml, 加入10ml試管中, 加入5%苯酚溶液1.0ml，旋渦混勻, 迅速滴加濃硫酸5ml，旋渦混勻，60水浴加熱20min，室溫冷卻，另取1ml蒸餾水作空白對照，在490nm波長處測定吸光值。精密吸取當(dāng)歸提取物6.0mg，用蒸餾水溶解定容至100ml，取該溶液100l加入900l蒸餾水使樣品液為1ml，加5%苯酚溶液1.0ml，旋渦振蕩，迅速加濃硫酸5.0ml，旋渦振蕩，60水浴20min，取出冷卻至室溫，于490nm處測定吸光度值。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出當(dāng)歸提取物中總糖含量。1.7 當(dāng)歸提取物的鎮(zhèn)痛作用(1)當(dāng)歸提取物對醋酸致

10、小鼠扭體的影響。小鼠隨機分成5組，空白組，陽性對照組，低劑量當(dāng)歸提取物組及中、高劑量組，每組10只。低、中、高劑量當(dāng)歸提取物組分別腹腔注射9g/L、18g/L、36g/L的當(dāng)歸提取物溶液0.5ml，陽性對照組按照300mg/kg給予阿斯匹林灌胃，空白組給予等量NS腹腔注射，給藥1h后，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml，記錄15min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)。(2)當(dāng)歸提取物對小鼠痛閾的影響。以熱板測痛儀測定動物在(55.0±0.5)的基礎(chǔ)痛閾，低于10s或高于30s以及入儀器跳躍的小鼠剔除不用，記錄動物放至熱板上至動物出現(xiàn)舔足反應(yīng)的時間記為基礎(chǔ)痛閾。各組小鼠給藥1h后測定動物痛閾

11、，若動物60s內(nèi)未出現(xiàn)舔足反應(yīng)，痛閾記為60s。         2 結(jié) 果2.1 當(dāng)歸提取物的鑒定結(jié)果Molish反應(yīng)：試液中有明顯紫紅色環(huán)出現(xiàn)，提示此當(dāng)歸提取物中含有糖類物質(zhì)。Fehling實驗：試液中生成棕紅色沉淀，提示當(dāng)歸提取物中含有糖類物質(zhì)。2.2 當(dāng)歸提取物糖含量測定以葡萄糖含量為橫坐標(biāo), 吸光度值為縱坐標(biāo), 得回歸方程為：A=0.0089C+0.0059 (r=0.9985),線性范圍660g/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。將當(dāng)歸提取物溶液的OD490值代入回歸方程，求得當(dāng)歸提取物的糖含量為81.7%。2.3

12、 當(dāng)歸提取物的鎮(zhèn)痛作用熱板法觀察當(dāng)歸提取物對小鼠痛閾的影響，結(jié)果顯示高劑量當(dāng)歸提取物可明顯提高小鼠對熱刺激致痛的痛閾(P0.01)，痛閾提高百分率為48.3%，中劑量當(dāng)歸提取物雖可提高小鼠對熱刺激致痛的痛閾(痛閾提高百分比為37.1%)但給藥前后配對檢驗，不具有統(tǒng)計學(xué)意義。阿司匹林對動物痛閾提高率百分比為39.2%，900mg/kg的當(dāng)歸提取物對動物痛閾提高率雖較阿司匹林為高，但此兩組的組間比較沒有顯著性差異，結(jié)果見表1。表1 熱板法觀察當(dāng)歸提取物對小鼠痛閾的影響2.4 當(dāng)歸提取物對小鼠扭體反應(yīng)的影響中、高劑量當(dāng)歸提取物可明顯減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)(P0.05、P0.01)，高劑量當(dāng)歸提取

13、物的扭體抑制率為54.4%，接近阿司匹林(57.5%)，高劑量當(dāng)歸提取物的抑制率雖高于中劑量當(dāng)歸提取物組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.159)。低劑量的當(dāng)歸提取物并未對動物的扭體反應(yīng)產(chǎn)生明顯影響。結(jié)果見表2。表2 當(dāng)歸提取物對醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響與空白組比較，*P0.05，*P0.013 討 論多糖是廣泛存在于自然界的天然高分子化合物，由單糖通過糖苷鍵連接而成。根據(jù)植物多糖溶于水、遇乙醇沉淀的性質(zhì)采用水提醇沉法提取植物多糖是最常用的提取方法57。從當(dāng)歸中提取多糖常用的方法是乙醇處理當(dāng)歸水提液，在水提液中含醇量達到80%時，幾乎可除去全部的蛋白質(zhì)和多糖、無機鹽類，對所得沉淀中進行純化、分離，即

14、可獲得當(dāng)歸總多糖(或稱當(dāng)歸粗多糖)。本文所涉及的當(dāng)歸提取物為當(dāng)歸水提液經(jīng)乙醇處理(含醇量80%)后的上清中提取到的組分，此提取物在Molish反應(yīng)中的二層界面出現(xiàn)紫色環(huán)，在Fehling實驗中生成了棕紅色沉淀，均提示此當(dāng)歸提取物中含有糖類物質(zhì)。提取當(dāng)歸多糖時乙醇濃度一般控制在60%80%,不同提取、分離方法從當(dāng)歸水提醇沉的沉淀中獲得的當(dāng)歸多糖組分的化學(xué)屬性存在很大差別。本文的當(dāng)歸提取物來源于當(dāng)歸水提組分中可溶解于80%的乙醇溶液的部分，而非來源于當(dāng)歸醇沉物，實驗結(jié)果提示在傳統(tǒng)的水提醇沉法的上清液中仍含有多糖組分，這一部分當(dāng)歸多糖組分的分子量、單糖組成等化學(xué)屬性以及藥理學(xué)活性與來自于醇沉的沉淀中

15、的多糖組分是否存在差別，尚待進一步研究。實驗結(jié)果表明此當(dāng)歸提取物能明顯提高小鼠對熱刺激致痛的痛閾，抑制小鼠對化學(xué)刺激致痛的扭體反應(yīng)。有研究報道從水提醇沉的沉淀中得到的當(dāng)歸總多糖也具有鎮(zhèn)痛效應(yīng)，當(dāng)歸中的這兩個組分的藥理學(xué)活性是否存在差異，鎮(zhèn)痛機理如何，尚待進行相關(guān)實驗研究比較?！緟⒖嘉墨I】  1左增艷，柳鐘勛，李健蕊，等.新型生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、當(dāng)歸多糖(ASDP)抗腫瘤作用及其對荷瘤小鼠免疫功能的影響J.中國免疫學(xué)雜志，2000，16(10)：545洪艷，張渝侯，王紅玲，等.當(dāng)歸多糖對60Co照射小鼠免疫功能影響的研究J.華中醫(yī)學(xué)雜志，2000，24(6)：291凌小曼，丁虹，羅順德，等.當(dāng)歸多糖對血瘀癥動物免疫功能和抗氧化功能的影響J.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2002，22(10)：584董群，鄭麗伊，方積年.改良的苯酚硫酸法測定多糖和寡糖含量的研究.中國藥學(xué)雜志