大蒜、枸椽酸和雙氧水對口腔厭氧菌的超微結(jié)構(gòu)影響

1、大蒜、枸椽酸和雙氧水對口腔厭氧菌的超微結(jié)構(gòu)影響提要目的探討大蒜、枸椽酸和雙氧水對口腔厭氧菌的殺菌機(jī)制。方法采用透射電鏡，觀察藥物對核梭桿菌、牙齦卟啉菌和脆弱類桿菌的直接影響。結(jié)果觀察到3種藥物對各種細(xì)菌作用的超微結(jié)構(gòu)改變不盡相同，藥物在37作用15分鐘后，可破壞細(xì)菌的胞壁結(jié)構(gòu)，可見壁破裂、變薄或消失，胞漿變性，核糖體聚集成塊狀沉淀，或胞漿內(nèi)容物溶解呈空泡變性等。結(jié)論觀察藥物對細(xì)菌的超微結(jié)構(gòu)影響，可為研究口腔厭氧菌的生理、病理關(guān)系以及藥物的解毒殺菌機(jī)制等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)鍵詞大蒜枸椽酸雙氧水口腔厭氧菌超微結(jié)構(gòu) The effects of garlic, hydrogen peroxide and

2、 citric acid on the ultrastructure of oral anaerobes Li Deyi, etal. The Ninth Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai(200011)AbstractAimIn order to investigate the bactericidal mechanism of garlic (G), hydrogen peroxide (H) and citric acid (C). MethodsTheir effects on the ultrastructu

3、re of porphyromonas gingivalis (Pg), Bacteroides fragilis (Bf) and Fusobacterium nucleatum (Fu) were observed by scanning electron microscopy. Resuts After oral anaerobes were exposed to G, H and C at 37 for 15 minutes, the ultrastructure changes of anaerobes differed in degree. Their cell wall, mem

4、brane were ruptured, thinned or disappeared, and the cell plasma was degenerated, such as ribosome aggregation, enzyme precipitation or plasma solution etc. ConclusionsThis study observed the effects of G, H and C on the ultrastructure of oral anareobes and supplied bactericidal mechanisms of drug.K

5、ey wordsgarlichydrogen peroxidecitric acidoral anaerobe ultrastrcture大量研究表明牙周病是一種感染性疾病，革蘭陰性厭氧菌是其重要病原菌，一些抗菌藥物或防腐消毒劑如枸椽酸、雙氧水和大蒜等處理牙周袋或病變根面，在牙周病領(lǐng)域受到高度評價和廣泛應(yīng)用13。但它們的殺菌機(jī)制,特別是對口腔厭氧菌超微結(jié)構(gòu)的直接影響卻報道極少。本研究采用透射電鏡觀察它們對核梭桿菌、牙齦卟啉菌和脆弱類桿菌的超微結(jié)構(gòu)影響，旨在探討藥物解毒殺菌機(jī)制。材料與方法1.實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)條件選擇與牙周病關(guān)系密切的3種口腔厭氧菌，為標(biāo)準(zhǔn)化起見，均采用國際參考菌株作為試驗(yàn)菌株，包

6、括：核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum, 簡稱Fn） ATCC 10953；牙齦卟啉菌（Porphyromonas gingivalis, 簡稱Pg） ATCC 33277；脆弱類桿菌（Bacteriodes fragilis, 簡稱Bf) ATCC 25285。各菌株活化鑒定后，分別接種于CDC厭氧血瓊脂平皿上，其主要成分為胰蛋白胨、大豆胨、氯化鈉、酵母浸出粉、L半胱氨酸、氯化血紅素、維生素K1和瓊脂，放入?yún)捬跏痔紫渲校?6厭氧培養(yǎng)72小時，用棉簽將細(xì)菌移入生理鹽水，洗滌2次（3000rpm, 離心10分鐘）， 棄去上清液，細(xì)菌沉淀備用。2.實(shí)驗(yàn)藥物大蒜：取去皮新鮮大蒜

7、（山東省龍口市復(fù)發(fā)中記工業(yè)園）1000g，用雙蒸水選2遍，粉碎機(jī)榨汁,4層消毒紗布過濾，再用濾紙過濾，得淡黃色澄清的大蒜汁（pH5.5),放入4冰箱備用。50枸櫞酸：天平稱取藥用枸櫞酸50g，加入100ml雙蒸水（pH1.0)3雙氧水：上海桃浦化工廠（滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字95第0490號098）3.藥物處理洗滌干凈的3種純菌，當(dāng)即用生理鹽水制備成109ml的細(xì)菌懸液，每種菌分裝4根試管，每管菌液10ml，3000rpm離心10分鐘，棄去上清液，在細(xì)菌沉淀中分別加入50枸櫞酸、3雙氧水和大蒜汁10ml，對照管加生理鹽水10ml，37下混勻，處理15分鐘。4.電鏡標(biāo)本制備上述藥物處理組和對照組菌液，3000

8、rpm,離心10分鐘，棄去上清液，將細(xì)菌立即放入2戊二醛前固定，二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，1鋨酸后固定，酒精系列脫水后常規(guī)包埋，作超薄切片，在HITACHIH500透射電鏡下觀察并攝片。結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)菌株特性和掃描電鏡下形態(tài)3種國際參考菌株進(jìn)行復(fù)蘇、純培養(yǎng)后，經(jīng)菌落形態(tài)、菌體染色及生化反應(yīng)鑒定，結(jié)果均符合VPI厭氧菌手冊鑒定特性4，對照組3種細(xì)菌的超薄切片，在透射電鏡下可觀察到細(xì)胞壁（CW）和細(xì)胞膜（CM）：因?yàn)檫@3種菌均為G-菌，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，可見24個致密層及中間透明區(qū)結(jié)構(gòu)，Pg菌表面還可見到毛狀外膜；細(xì)胞漿和核區(qū)（P，Nr）：大部分細(xì)菌在均質(zhì)結(jié)構(gòu)中可見散在的核糖體顆粒，有的細(xì)菌在中心部分

9、可見核區(qū)，無核膜核仁(13）。2.藥物處理后細(xì)菌的超微結(jié)構(gòu)變化黑色的Pg經(jīng)50枸櫞酸處理后變?yōu)榈稚?，?jīng)3雙氧水處理，黑色的Pg很快變?yōu)榘咨?，并可見大量氣泡，而?jīng)大蒜汁處理Pg仍為黑色，F(xiàn)n和Bf在3種藥物處理前后顏色未見明顯變化。在透射電鏡下的超微結(jié)構(gòu)改變（表1）（312）。表1藥物處理組的細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)變化組別細(xì)菌FnPgBf大蒜組胞壁失去原有結(jié)構(gòu)而明顯變薄，大部分胞漿溶解消化，少數(shù)變性，可見黑色沉淀（4）許多細(xì)菌破碎崩解，有的胞漿變性，有的出現(xiàn)空泡（5）胞壁消失或變薄，胞漿高度變性，核糖體聚集成深黑色團(tuán)塊沉淀，少數(shù)細(xì)胞內(nèi)容物破壞出現(xiàn)空泡（6）50枸櫞酸組細(xì)胞變形，胞壁變薄失去原有結(jié)構(gòu)，有的

10、胞漿內(nèi)可見黑色沉淀，有的消化呈空泡（7）可見細(xì)胞集聚融合成片和空泡變性，有些胞漿內(nèi)可見黑色沉淀顆粒（8）大部分胞壁不完整，破裂呈不連續(xù)狀態(tài)，胞漿內(nèi)可見大量顆粒樣黑色沉淀（9）3雙氧水組胞壁與胞漿間隙明顯擴(kuò)大，胞漿內(nèi)容物溶解漏出呈空泡，少量變性（10）細(xì)胞可融合聚集成片，胞壁與胞漿間隙明顯擴(kuò)大，胞漿萎縮，出現(xiàn)較多空泡（11）可見細(xì)胞破裂，部分胞漿內(nèi)容物溶解呈空泡（12）討論1.藥物對口腔G-厭氧菌的超微結(jié)構(gòu)影響G-厭氧菌的胞壁結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，它在較薄的粘肽層外面還有脂蛋白、外膜和脂多糖內(nèi)毒素。它是細(xì)菌對外界的物理性、功能性保護(hù)屏障，一切生物活性物質(zhì)的功能如物質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞，均在生物膜上

11、進(jìn)行。從藥物作用細(xì)菌后的超微結(jié)構(gòu)變化來看，大蒜、枸櫞酸、雙氧水可不同程度地破壞Fn、Pg和Bf這3種口腔厭氧菌表面結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂、變薄，有的甚至消失，這與我們以前證實(shí)這3種藥物有降解內(nèi)毒素作用相一致1。此外，還可觀察到這些藥物可影響到菌體內(nèi)的胞漿，在胞漿內(nèi)出現(xiàn)高電子密度呈深黑色團(tuán)塊或顆粒樣沉淀，或使胞漿溶解出現(xiàn)空泡。這些內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，可導(dǎo)至細(xì)菌的死亡。2.藥物作用的可能機(jī)制大蒜系百合科蔥屬植物，是我國民間常用中藥之一，味辛、性溫，有殺蟲、消腫、抗菌及消炎等作用，因此大蒜被譽(yù)為“天然廣譜抗生素”。它的抗菌機(jī)制可能是由于：大蒜含有的大蒜辣素分子中的氧原子，可與細(xì)菌生長繁殖所必需的半

12、胱氨酸分子中的-SH結(jié)構(gòu)；大蒜汁pH為5.5，偏酸性；大蒜中所含的蒜酶、過氧化酶、磷酸酯酶及水解酶等，有氧化和水解作用5。因此大蒜作用下的3種細(xì)菌變形及破裂較明顯，可見胞壁消失或變薄，核糖體聚集成團(tuán)塊（46），對Bf作用較強(qiáng)。50枸櫞酸，其pH為1.0， 呈強(qiáng)酸性，可與細(xì)菌表面的P0-33，OH-1等基團(tuán)作用，破壞組織結(jié)構(gòu)，使胞壁不完整或破裂，增強(qiáng)通透性、干擾分解代謝，可溶解胞漿或使菌體蛋白和酶變性或沉淀6（79），以Pg和Bf較為典型。3雙氧水為一種常用的強(qiáng)氧化劑，是一種非特異性的抗菌物質(zhì)，具防腐、滅菌、除臭及清潔等作用，它與Pg接觸，能很快氧化其黑色素，使菌體變成白色。雙氧水可與細(xì)菌的SH

13、、NH2作用，破壞組織結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)通透性，加之其分子量小，易透入菌體使蛋白質(zhì)或酶變性，或使胞漿內(nèi)容物氧化溶解，出現(xiàn)較多空泡（1012），對Fn、Pg作用較Bf明顯。透射電鏡觀察證實(shí)不同藥物對各種細(xì)菌的超微結(jié)構(gòu)影響不盡相同，提示它們的抗菌機(jī)制也不相同。1核梭桿菌（TEM20000）2牙齦卟啉菌（TEM20000）3脆弱類桿菌（TEM20000）4大蒜處理的核梭桿菌（TEM20000）5大蒜處理的牙齦卟啉菌（TEM20000）6大蒜處理的脆弱類桿菌（TEM20000）7枸櫞酸處理的核梭桿菌（TEM20000）8枸櫞酸處理的牙齦卟啉菌（TEM20000）9枸櫞酸處理的脆弱類桿菌菌（TEM20000）1

14、0雙氧水處理的核梭桿菌（TEM20000）11雙氧水處理的脆弱類桿菌（TEM20000）12雙氧水處理的脆弱類桿菌（TEM20000）*國家自然科學(xué)基金資助課題，（39570763）作者單位：李德懿陸衛(wèi)青210011上海，上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院參考文獻(xiàn)1李德懿、黃宗仁.病變牙骨質(zhì)內(nèi)毒素的研究.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，1985，20（4）：1931962Chaves E, Cox CF, Morrison E, et al. The effect of citric acid application on periodontally involved root surfaces. II. A

15、n in vitro scanning eectron microscopic study. Int J Periodontics Restorative Dent. 1993;13(2): 1881963Kersten BG, Chamberlain AD, Khorsandis, et al. Healing of the intrabony periodontal lesion following rootconditioning with citric acid and wound closure insluding an expanded PTFE membrane. J Periodontol 1992, 63(11): 8768824Ho