噪聲所致耳蝸毛細(xì)胞表達(dá)ＮＦ－κＢ中維生素Ｅ的調(diào)節(jié)

1、噪聲所致耳蝸毛細(xì)胞表達(dá)中維生素的調(diào)節(jié) 09-05-12 10:36:00 作者：鞠善德王蘋杜寶東編輯：studa20【摘要】 目的 探討維生素E在噪聲暴露引起的大白鼠聽力損傷有明顯的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 健康雄性純種Wistar大鼠9只，鼠齡23個月，體質(zhì)量180200 g,由長春市高新開發(fā)區(qū)實驗動物中心提供（清潔級）。無噪聲暴露及耳毒性藥物使用史，耳廓反射正常，實驗前清潔外耳道，顯微鏡下檢查均無中耳炎。以聽閾、耳蝸基底膜鋪片及免疫熒光染色為指標(biāo)，觀察大白鼠在穩(wěn)態(tài)噪聲持續(xù)暴露之前30 d至暴露后7 d，灌維生素E及生理鹽水，對大白鼠聽覺腦干電位分析和耳蝸外毛細(xì)胞（OHC）丟失率分析及NF-B在

2、耳蝸毛細(xì)胞中表達(dá)定量分析。結(jié)果 維生素E在噪聲暴露后大白鼠聽力閾值明顯低于單純噪聲組，OHC丟失率也明顯降低，免疫熒光染色結(jié)果顯示VE干預(yù)組的耳蝸細(xì)胞表達(dá)NF-B的強(qiáng)度低于單純噪聲組（P005）。結(jié)論 維生素E在噪聲暴露引起的大白鼠聽力損傷有明顯的保護(hù)作用，通過上調(diào)耳蝸毛細(xì)胞中NF-B的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】噪聲； 耳蝸; 毛細(xì)胞；維生素E；NF-B 【Abstract】 Objective To discuss the protection and mechannism ofvitamin Ein the rats hearing impairment induced by noise expo

3、sure.Methods Take the audibility thresholdbasilar membrane stretched preparation and immunofluorescence stain as the index, observing that the rats were put in the stationary noise before 30 days until after that for 7 days, have vitamin E and sodium chloride , check the auditory brain stem potentia

4、l and the lost rate and NF-B of the OHC in the cochlea hair cells expression quantitative analysis. Result After the noise exposure, the rats which have vitamin E have significant lower auditory acuity threshold than the purely noise exposure,and much lower lost rate of OHC. Lmmunofluorescence stain

5、 demonstrate that the group have vitamin Ehave lower intensity of NF-B expression in the cochlea hair cells,(P005).Conclusion vitamin E has obvious protection in the hearing impairment of rats ,working out by upregulation of NF-B expression in the cochlea hair cells. 【Key words】Noise; Cochlea; Hair

6、cell vitamin E; NF-B 噪聲可產(chǎn)生可恢復(fù)的暫時性閾移（TTS）或不可恢復(fù)的永久性閾移（PTS），甚至造成噪聲性耳聾。對噪聲性聽力損傷機(jī)制迄今尚無明確報道。本實驗在大白鼠噪聲暴露前30天至暴露后7 d灌胃維生素E，對其防止TTS轉(zhuǎn)變?yōu)镻TS及促進(jìn)聽力恢復(fù)有無保護(hù)作用進(jìn)行探討。分析維生素E干預(yù)噪聲聽覺損傷與耳蝸毛細(xì)胞中NF-B的表達(dá)的關(guān)系，確定VE減少噪聲引起的毛細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。 1 材料與方法 11 動物分組與處理 選擇鼓膜聽覺腦干電位儀測4000 Hz頻率雙耳聽閾在2328 dB的健康雄性大白鼠30只，體質(zhì)量180200 g；隨機(jī)分為3組；正常組12只（24耳）維生素E組

7、12只（24耳），單純暴露組12只（24 耳）。維生素E組在暴露前30 d至暴露后7 d連續(xù)灌胃4 mg/（kgd）。單純暴露組在暴露前30 d至暴露后7 d連續(xù)灌胃 09生理鹽水5 ml/（kgd）。 噪聲暴露：連續(xù)用藥30天后即行噪音暴露，將動物置于小籠內(nèi)(40 cm30 cm30 cm )每籠2只，放入暴露艙（05 m15 m05 m）用UZ-3型噪聲發(fā)生器發(fā)生， A-K200功率放大器放大，有位于暴露艙四周的揚(yáng)聲器向暴露艙播放。暴露時用聲壓計進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，噪音保持在頻率為4000 Hz，平均聲強(qiáng)為116 dB SPL（sound pressure level）。動物暴露范圍內(nèi)聲揚(yáng)不均勻

8、度為2 dB。持續(xù)暴露6 h。 12 聽閾測試 測試在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，10水合氯醛（330 mg/kg）腹腔注射，麻醉生效后安插針式電極，記錄電極的安裝用不銹鋼針刺入前顱頂正中穿透皮膚至顱骨骨膜，置于冠狀縫中點處，同時給聲耳及對側(cè)耳后皮下分別刺入不銹鋼針，作為參考電極和接地電極。TDH-39型耳機(jī)給聲，聲源距耳廓1 cm，誘發(fā)電位用信號處理機(jī)疊加處理，進(jìn)行測試：刺激聲為交替短聲（clicks），重復(fù)率10次/s。實驗選用主要參數(shù)為：帶道濾波為323 KHz，掃描時間為10 ms，疊加為512次。測試聲強(qiáng)由110 dB SPL開始，接近閾值后按5 dBSPL漸檔遞減，電生理反射由針式電極引出，

9、經(jīng)放大及處理后以波形的方式顯示于熒光屏，閾值是以肉眼剛能辨認(rèn)的腦干電位波群中以波的聲強(qiáng)表示。 13 耳蝸基底膜鋪片 三組動物完成最后一次聽閾測試后(噪聲暴露停止后第7天)處死動物立即取出顳骨,打開聽泡,4%甲醛固定24 h,10%EDTA脫鈣1周,分離出基底膜, 三組動物隨機(jī)抽出各6只(12耳),在常規(guī)蘇木素染色,在放大400倍的光學(xué)顯微鏡下，以目鏡中024 mm顯微測微尺為測量尺度，逐個視野從蝸底向蝸頂進(jìn)行OHC記數(shù)。以O(shè)HC境界模糊或消失、細(xì)胞碎裂或缺失為OHC死亡標(biāo)志。鉤部和蝸尖各有4個視野不做記數(shù)。所得數(shù)據(jù)分析OHC損失分布情況。 14 免疫熒光染色 三組動物基底膜各6只(12耳)，用

10、01 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min，加入01% Triton X-100處理15 min，5%羊血清封閉1 h，加入一抗（NF-B 工作濃度1：100），室溫孵育1 h，用01 mol/L PBS洗滌3次，每次15 min，加入，Alexa Fluor555 Goat anti-rabbitIgG（工作濃度1：400），室溫、避光放置1 h，01 mol/L PBS洗滌3次，每次15 min，輕輕搖動。棄掉洗滌液，最后樣品均再用1 g/ml的Hoechst 33342室溫染色5 min，甘油封片。用Fluoview FV 1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察（PMT電壓值為650，C

11、A針孔值為160）。NF-B陽性表達(dá)為紅色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。陰性對照實驗中，用PBS代替第一抗體，排除非特異性的二抗結(jié)合。 09-05-12 10:36:00 作者：鞠善德王蘋杜寶東編輯：studa2015 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Fluoview FV 1000激光共聚焦顯微鏡分析軟件分析基因表達(dá)相對熒光強(qiáng)度，使用Sigma Stat203（sigma）統(tǒng)計軟件，采用one way ANOVA檢驗，P005認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。 2 結(jié)果 21 ABR閾值 暴露組在噪聲暴露前和噪聲暴露結(jié)束后不同時間的聽閾閾值見表;結(jié)果表明,單純暴露組和補(bǔ)VE、均有明顯聽力損失,表現(xiàn)為聽閾上移（P005），均有非常

12、顯著的差異（P005）,表1-1為兩組動物在噪音暴露后閾值的恢復(fù)曲線示意圖,可見噪聲暴露后1 h差異不顯著，外補(bǔ)VE組ABR閾值恢復(fù)明顯高于單純暴露組。見表1，圖1。 22 耳蝸基底膜鋪片毛細(xì)胞變化 耳蝸基底膜鋪片蘇木素胞核染色顯色結(jié)果：正常組耳蝸HC形態(tài)正常，其3排OHC和內(nèi)毛細(xì)胞（IHC）排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，無缺失。補(bǔ)VE在噪聲暴露第7天OHC有散在缺失，且以第三排為主，單純暴露組出現(xiàn)細(xì)胞境界模糊或消失，且在3排OHC中以第三排OHC損傷為重，缺失明顯，第二排、第一排均有不同程度的缺失，IHC也有丟失。對耳蝸基底膜鋪片進(jìn)行全長OHC記數(shù)，繪制耳蝸圖，觀察其OHC損失分布情況，補(bǔ)VE組OHC

13、缺失率明顯底于單純暴露組（P005）。見圖2-1、2-2。 23 耳蝸毛細(xì)胞NF-B的表達(dá) 單純噪聲組以及VE干預(yù)組在暴露后7 d處死動物，分離耳蝸基底膜，進(jìn)行NF-B表達(dá)定量分析。結(jié)果見表3-1，圖3-2。VE干預(yù)組的耳蝸毛細(xì)胞表達(dá)NF-B的強(qiáng)度低于單純噪聲組。 3 討論 噪音對聽覺的損傷是一個復(fù)雜的多因素的機(jī)制，各種因素又相互關(guān)聯(lián)，相互影響。目前傾向于將噪聲對聽覺的損傷歸納為機(jī)械性、血管性和代謝性三個方面。超高強(qiáng)度130 dB NHL以上的噪聲對HC的損傷主要以機(jī)械損傷為主，中高強(qiáng)度110-130 dB NHL噪聲暴露以血管性和代謝性損傷為主。已經(jīng)證實，強(qiáng)噪聲刺激作用下耳蝸血管可發(fā)生一系列

14、改變：血管痙攣收縮或擴(kuò)張，血流速度變慢，局部血液灌注量減少；內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、通透性增加，血液濃縮粘滯度顯著增高，血小板和紅細(xì)胞聚集、血栓形成1-5；這些變化導(dǎo)致微循環(huán)障礙，耳蝸血流下降,內(nèi)耳供血不足,內(nèi)外淋巴液氧張力下降6，7。血管改變引起的局部缺血缺氧，造成了耳蝸內(nèi)環(huán)境的代謝紊亂，HC代謝障礙，酶系統(tǒng)的功能障礙，從而細(xì)胞出現(xiàn)包括Corti器形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷和聲電轉(zhuǎn)換的功能障礙等一系列病理生理改變。最近研究表明8，噪聲引起代謝性損傷首先對兩個結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，一是可影響靜纖毛結(jié)構(gòu)，從而造成耳蝸微機(jī)械結(jié)構(gòu)的改變，二是使IHC過量釋放神經(jīng)介質(zhì)，從而影響神經(jīng)傳導(dǎo)。有研究表明，噪聲暴露可破壞耳蝸的抗氧化體系，

15、導(dǎo)致氧化和抗氧化失衡，從而在耳蝸產(chǎn)生大量活性氧自由基。過量的氧自由基可以攻擊生物膜，使膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化（LPO），誘發(fā)LPO的大量產(chǎn)生，影響細(xì)胞內(nèi)的重要生化反應(yīng)，對耳蝸組織產(chǎn)生損傷。VE通過自身被氧化成生育醌，從而將ROO-轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)性質(zhì)不活潑的ROOH，中斷脂類過氧化的連鎖反應(yīng)，有效抑制脂類過氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的傷害，在防止衰老，抗腫瘤等方面起著重要的作用。VE本身具有產(chǎn)生酚氧基的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的酚氧基能夠猝滅并能同單線態(tài)氧反應(yīng)，保護(hù)不飽和脂肪酸免受單線態(tài)氧損傷。還可以被陰離子自由基和羥自由基氧化，使不飽和脂肪酸免受自由基攻擊，從而抑制脂肪酸的自動氧化。VE不僅

16、對生物膜的結(jié)構(gòu)和功能有較好的保護(hù)作用9，還能迅速捕捉自由基，生成的生育酚自由基又可進(jìn)一步與另一個分子自由基反應(yīng)生成非自由基生育醌，故抗氧化能力較強(qiáng)10。 NF-B是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，存在于多種組織的多種細(xì)胞中，具有廣泛的生物學(xué)活性激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在感染、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增生等過程中發(fā)揮作用。近年的研究表明NF-B與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切，其參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。多種細(xì)胞外刺激信號可激活NF-b，如細(xì)胞因子IL-1 TNF-a及活性氧自由基等11，12席愷等13采用豚鼠耳蝸缺血-再灌注損傷模型，觀察耳蝸組織形態(tài)功能

17、變化與NF-B、TNF-表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血組及缺血再灌注各組的NF-B在耳蝸各轉(zhuǎn)SV，IHC，OHC和SGC各部位表達(dá)隨時間延長逐漸增強(qiáng)，再灌注24 h組達(dá)高峰。而TNF-a表達(dá)水平與NF-B表達(dá)一致。認(rèn)為耳蝸缺血過程中大量產(chǎn)生的活性氧刺激，NF-B被激活，誘導(dǎo)TNF-分泌增加，而缺血再灌注各組TNF-水平加強(qiáng)，反過來會進(jìn)一步激活NF-B，形成惡性循環(huán)，加重缺血損傷的程度。Fujioka 等14采用RT-PCR方法分析噪聲暴露后大鼠耳蝸組織細(xì)胞因子表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后早期TNF-a、IL-1a和IL-6表達(dá)急劇增加。筆者的實驗結(jié)果顯示，噪聲暴露后7 d的耳蝸毛細(xì)胞中表達(dá)NF-B的熒

18、光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于正常耳蝸。筆者推測噪聲引起TNF-a增高，TNF-a與其特異性跨膜受體TNFR結(jié)合后，在胞質(zhì)中形成腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（TRADD）受體，作用蛋白（RIP）腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF2）的復(fù)合物，誘導(dǎo)NIK表達(dá)，作用于IB同時激酶IKK。在蛋白酶的作用下，磷酸化的IB從p50/p65異源二聚體上降解進(jìn)而p50/p65異源二聚體活化進(jìn)入胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。筆者發(fā)現(xiàn)NF-B高峰表達(dá)時期，毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)主要特征是核腫脹，而且有文獻(xiàn)證實，此刻發(fā)生的細(xì)胞學(xué)改變，部分可逆，基于NF-B與細(xì)胞死亡存在雙向調(diào)節(jié)關(guān)系: 既可抑制細(xì)胞死亡也可促進(jìn)細(xì)胞死亡，筆者推測早期的NF-B增高可能具有抑制細(xì)胞死亡作用，而耳蝸組織中持續(xù)高表達(dá)NF-B則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Carcamo等15的研究發(fā)現(xiàn)，VE能夠抑制培養(yǎng)的人類多種組織來源的細(xì)胞系NF-B活性，通過抑制TNF誘導(dǎo)的NIK激