反相高效液相色譜測(cè)定動(dòng)物源食品中大觀霉素殘留

1、反相高效液相色譜測(cè)定動(dòng)物源食品中大觀霉素殘留(1)作者：苑麗 胡功政 肖傳斌 梁軍 李奎 司紅彬【摘要】 目的 建立反相高效液相色譜法配合電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定動(dòng)物源食品中大觀霉素殘留。方法 用三氯乙酸勻漿抽提以脫去試樣中的蛋白，然后用二氯甲烷去除試樣中的脂溶性物質(zhì)，再經(jīng)LCSCX陽離子固相萃取小柱凈化處理，產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相為離子對(duì)緩沖體系(0.02mol/L檸檬酸0.004mol/L庚烷磺酸鈉，50% NaOH調(diào)pH至6.10)乙腈(體積比為92.57.5)，流速0.6ml/min，工作電極電壓1.0V，柱溫35，檢測(cè)波長254nm。結(jié)果 大觀霉素在0.0110.0g/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，

2、相關(guān)系數(shù)R=0.99998。結(jié)論 該法簡便、直接、準(zhǔn)確。 【關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜 電化學(xué)檢測(cè)器 大觀霉素 殘留Determination of spectinomycin residues in animal food by RPHPLCABSTRACT Objective A reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method with electrochemical detector was established for the determination of spectinomycin res

3、idues in animal food.Methods The samples were deproteinized by trichloroacetic acid, and the fatty soluble substances were extracted with dichloromethane. Followed by cleanedup on a LCSCX positive ion solidphase extraction column, then the extracts were determined. The mobile phase was citric acid i

4、onpair buffer solution (0.02mol/L citric acid0.004mol/L sodium heptanesulfonate, the pH adjusted to 6.10 by 50% NaOH)acetonitrile (92.57.5, V/V). The flow rate was 0.6ml/min, the working electrode voltage was 1.0V, the column temperature was maintained at 35, and the detection wavelength was at UV 2

5、54nm. Results The linear relationship of the peak and concentration of spectinomycin was determined as 0.0110.0g/ml, with a regression coefficient of 0.99998. Conclusions The method is simple, direct,and accurate.KEY WORDS RPHPLC; Electrochemical detector; Spectinomycin; Residues大觀霉素(spectinomycin，曾

6、譯壯觀霉素)是氨基糖苷類抗生素，主要通過作用于細(xì)菌核糖體30S亞基來抑制其蛋白質(zhì)的合成，對(duì)革蘭陰性菌(如大腸埃希菌、沙門菌、布魯菌、變形菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌等)有較強(qiáng)作用，對(duì)革蘭陽性菌和支原體亦有一定作用。我國獸藥典獸藥使用指南(化學(xué)藥品卷，2005版)1及美國FDA均規(guī)定本品在牛、羊、豬、雞等食用組織中最高允許殘留量分別為：肌肉：500g/kg；脂肪、肝：2000g/kg和腎：5000g/kg。國外一些學(xué)者建立了各種HPLC法26來檢測(cè)動(dòng)物源食品中本品的殘留，但大觀霉素?zé)o紫外吸收，必須形成紫外可見光或熒光化合物后才能進(jìn)行HPLC分析7，8，即必須先進(jìn)行衍化生成相應(yīng)的衍化物。迄今為止，所

7、有這些方法即缺乏必要的靈敏度，亦有繁雜的衍化過程，難以推廣應(yīng)用。1994年美國農(nóng)業(yè)部又建立微生物學(xué)方法來檢測(cè)本品在食品中的殘留，但其靈敏度也低，且缺乏特異性。Elrod等9發(fā)現(xiàn)大觀霉素具有電化學(xué)活性，發(fā)展了一種使用離子對(duì)色譜電化學(xué)檢測(cè)器的方法測(cè)定大觀霉素，但并未用該法測(cè)定生物樣品。Schermerhorn等10報(bào)道用帶有電化學(xué)檢測(cè)器的HPLC來檢測(cè)牛奶中的大觀霉素殘留。我國進(jìn)出口商品檢疫局1997年發(fā)布了出口肉及肉制品中大觀霉素殘留檢測(cè)的HPLC電化學(xué)法，測(cè)定方法靈敏度高，但樣品提取步驟繁雜，不適用于脂肪組織，其凈化過程系用活性炭制柱，處理后的待檢液中的雜質(zhì)仍干擾測(cè)定結(jié)果。本方法采用三氯乙酸抽

8、提去除樣品中的蛋白、二氯甲烷去除試樣中脂溶性物質(zhì)，經(jīng)LCSCX陽離子固相萃取小柱凈化處理，再用反相高效液相色譜配合電化學(xué)檢測(cè)器直接檢測(cè)動(dòng)物源食品中殘留的大觀霉素，結(jié)果表明，本方法簡單、直接，且回收率、檢測(cè)限和準(zhǔn)確度均可達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。1 儀器和試藥1.1 儀器帶515泵、2465電化學(xué)檢測(cè)器的高效液相色譜儀(美國Waters公司)、電子天平(感量0.0001g)、高速組織搗碎機(jī)、回旋式振蕩器、高速冷凍離心機(jī)和Supelclean LCSCX SPE陽離子固相萃取小柱(500mg/3ml，含碳量14%)。1.2 試藥大觀霉素為山東魯抗生產(chǎn)，含量不少于99.0%；乙腈(色譜純，Baker公司)，庚烷

9、磺酸鈉(色譜純，Sigma公司)；水為色譜級(jí)超純水(采用Millipore公司純水系統(tǒng)自制)；帶一個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸、甲醇、氫氧化鈉、氯化鈉、三氯乙酸和二氯甲烷均為分析純?cè)噭? 方法與結(jié)果2.1 色譜條件色譜柱：C18柱(瑞典AKZO NOBEL Kromasi C18，250mm4.6mm，5m)；保護(hù)柱(LabALLianceTM C18)；流動(dòng)相為檸檬酸離子對(duì)緩沖體系(0.2mol/L檸檬酸0.004mol/L庚烷磺酸鈉，50% NaOH調(diào)pH至6.10)乙腈(體積比為92.57.5)，流速為0.6ml/min，工作電極電壓1.0V，柱溫35，檢測(cè)波長254nm，進(jìn)樣量20l，分離結(jié)果見

10、圖1。2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取大觀霉素0.0298g，加水溶解并定容為100ml，配成濃度為200g/ml的儲(chǔ)備液(按有效量計(jì))，置4冰箱中保存，一周內(nèi)用完。臨用前， 取此儲(chǔ)圖1大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖(20g/ml)備液用純水稀釋成0.01、0.02、0.05、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0g/ml濃度的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣，經(jīng)電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)，按其所得峰面積與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程為：A=0.75468 16.53266C R=0.999976表明大觀霉素在0.0110.0g/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.3 樣品

11、處理2.3.1 抽提 稱取(15g0.05g)試樣，轉(zhuǎn)至一個(gè)50ml的離心管中，加入12ml超純水，在1800r/min條件下用高速組織搗碎機(jī)搗1min，取粘稠液18g加50%三氯乙酸2ml和二氯甲烷10ml，在回旋式振蕩器上高速振搖30min。然后在4 3800RCFRCF=0.0000118RN2，R為離心半徑(cm)，N為轉(zhuǎn)速(r/min)條件下離心30min，取上清10ml，加二氯甲烷2ml，在回旋加速器上振蕩混合20min，再在4 12000RCF條件下離心30min，上清液即為藥物的抽提液。 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，

12、請(qǐng)不要用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。2.3.2 凈化 采用LCSCX陽離子固相萃取小柱凈化。首先LCSCX小柱用甲醛活化，再用純水平衡后，將經(jīng)“2.3.1”法制得的備用液過柱，起始2ml棄去，收集隨后3ml，經(jīng)水性濾膜(0.45m)過濾，濾液供HPLC測(cè)定。對(duì)肌肉和脂肪內(nèi)本藥的殘留測(cè)定，可取“2.3.1”法制得的抽提液直接過0.45m水性濾膜即可。2.4 試樣中藥物殘留量計(jì)算經(jīng)“2.3”方法處理過的組織待測(cè)試樣在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣，經(jīng)電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)，空白雞脂肪組織、雞肉組織、雞肝臟組織和雞腎臟組織HPLC雜質(zhì)峰不干擾加藥(加

13、藥量為最高殘留限量)后試樣的HPLC色譜圖(圖2)，大觀霉素峰依次位于10.43、10.63、10.62和10.54min。將其所得峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，可求出試樣中殘留的藥物濃度或藥物含量。2.5 靈敏度、回收率和精密度試驗(yàn)圖2加藥雞脂肪組織的高效液相色譜圖(2g/g)用添加法測(cè)定。分別取豬、雞空白肌肉、脂肪、肝、腎組織各15.0g，添加適量的大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”方法處理后在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣，經(jīng)電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)，將其所得峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算大觀霉素含量，以加入量與測(cè)得量之比計(jì)算回收率。每種組織各測(cè)定包括最高殘留限量和靈敏度在內(nèi)的三種添加濃度，每個(gè)濃度各測(cè)3

14、批樣品計(jì)算批間變異系數(shù)，每批樣品各進(jìn)行5個(gè)重復(fù)計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。結(jié)果表明，豬、雞肌肉、脂肪中本品的檢測(cè)限為100g/kg，肝臟、腎臟中的檢測(cè)限為200g/kg，均低于最高允許殘留量1。各濃度點(diǎn)回收率均在71.38%94.81%范圍內(nèi)。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)在4.19%9.86%范圍之內(nèi)，批間變異系數(shù)在4.86%12.99%范圍之內(nèi)。2.6 抗干擾試驗(yàn)鑒于大觀霉素在畜禽疾病防治中多與林可霉素復(fù)配使用，故進(jìn)行了林可霉素對(duì)大觀霉素在本實(shí)驗(yàn)條件下的干擾試驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)用同時(shí)含10g/ml林可霉素和10g/ml大觀霉素的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液按上述方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，無林可霉素色譜峰，僅有大觀霉素峰，且其保留時(shí)間及峰

15、面積與單獨(dú)測(cè)定10g/ml大觀霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)一致，說明林可霉素對(duì)大觀霉素的測(cè)定無影響。3 討論(1)抽提液的選擇 氨基糖苷類抗生素與組織成分結(jié)合較緊密，從組織樣品(尤其是腎)中抽提本品要比從體液中困難的多，迄今為止，報(bào)道的方法不多5，7，11，且靈敏度不高，只適于測(cè)定氨基糖苷類抗生素殘留量高的樣品(如腎)。Schermerhorn等10報(bào)道先用三氯乙酸沉淀試樣中的蛋白質(zhì)，再用二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯按順序液液萃取，但此試樣中的共萃物對(duì)色譜柱的分離有干擾，影響了檢測(cè)的靈敏度，且步驟復(fù)雜，回收率低。本方法采用三氯乙酸勻漿抽提以脫去蛋白，然后再加二氯甲烷以除去脂溶性物質(zhì)，結(jié)果表明本抽提方法簡單可行

16、，回收率較高，且能保證檢測(cè)的靈敏度。(2)凈化方法的選擇 由于Hornish等使用的自動(dòng)凈化系統(tǒng)7不符合國內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室配置條件，且CBA陽離子固相萃取柱在萃取操作過程要求精確調(diào)節(jié)pH值、溫度及離子強(qiáng)度，所需條件難以掌握，且樣品回收率較低，故本試驗(yàn)采用LCSCX陽離子固相萃取小柱凈化，其僅能保留試樣中的干擾成分，而不能保留試樣中的殘留藥物，并使之濾過流出，起到較好的凈化作用。為盡可能多的除掉試樣中的雜質(zhì)，以免進(jìn)樣后堵塞HPLC系統(tǒng)或污染色譜柱，本方法在試樣經(jīng)LCSCX陽離子固相萃取小柱凈化后采用水性濾膜進(jìn)一步過濾，結(jié)果證實(shí)本處理對(duì)保護(hù)色譜柱是有利的，也是可行的。(3)流動(dòng)相的選擇及工作電極電壓的

17、確定 本方法經(jīng)多次重復(fù)證明，大觀霉素的保留時(shí)間與離子對(duì)緩沖液中庚烷磺酸鈉(在其濃度不大于檸檬酸濃度范圍內(nèi))濃度成正相關(guān)，與流動(dòng)相中乙腈的濃度成負(fù)相關(guān)。當(dāng)采用檸檬酸離子對(duì)緩沖體系(0.02mol/L檸檬酸0.004mol/L庚烷黃酸鈉，50% NaOH調(diào)pH至6.10)乙腈(體積比為92.57.5)為流動(dòng)相時(shí)，大觀霉素有適宜的保留時(shí)間(保留時(shí)間為915min)，與雜質(zhì)能完全分離，并能達(dá)到基線分離，且峰形良好。為提高選擇性及信燥比，必須優(yōu)化電化學(xué)檢測(cè)器工作電極的電壓，過高外加電壓使電化學(xué)檢測(cè)器噪聲增加且干擾嚴(yán)重；如外加電壓不足，則又使信號(hào)變小，電化學(xué)檢測(cè)器靈敏度降低。本方法選擇1.02.0V的工作

18、電壓來分析大觀霉素經(jīng)證實(shí)是恰當(dāng)?shù)摹? 結(jié)論根據(jù)我國HPLC及凈化系統(tǒng)的配置情況，并結(jié)合離子對(duì)色譜及電化學(xué)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，該分析方法為一種簡單的直接測(cè)定動(dòng)物源食品中大觀霉素殘留的方法，其檢測(cè)限、回收率、重復(fù)性和線性范圍均能滿足現(xiàn)行獸藥殘留分析的要求?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 中國獸藥典委員會(huì). 中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南化學(xué)藥品卷S. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：322 Burton S D, Hutchins J E, Fredericksen T L, et al. Highperformance liquid chromatographic method for the determination of spectinomycin