哮喘兒童外周血T淋巴細(xì)胞FasFasL的表達(dá)及其意義

1、哮喘兒童外周血T淋巴細(xì)胞Fas/FasL的表達(dá)及其意義                   作者：袁岳沙  陳杰 王琳 周少華 【摘要】  目的探討哮喘兒童外周血T淋巴細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)及其意義。方法21例哮喘發(fā)作期患兒、15例哮喘緩解期患兒及25例正常兒童作為研究對象；密度梯度法分離外周血淋巴細(xì)胞；免疫熒光抗體法檢測淋巴細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)陽性率；用t檢驗(yàn)和直線相關(guān)分析進(jìn)行資料統(tǒng)計(jì)處理

2、。結(jié)果發(fā)作期患兒淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)明顯下降，與正常對照組和緩解期患兒組比較差異均有非常顯著意義（t=5.914 2， 3.108 4, P0.01）；緩解期患兒淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)比發(fā)作期患兒有明顯提高，但與正常組相比仍有顯著降低（t=2.338 8, P0.05）；淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)總體均較低，但在發(fā)作期患兒仍明顯高于正常對照組（t=2.186 1, P0.05），在緩解期患兒FasL表達(dá)雖高于正常對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.772 4, P0.05）；發(fā)作期患兒外周血中表達(dá)Fas的淋巴細(xì)胞陽性率與淋巴細(xì)胞比率呈明顯的負(fù)相關(guān)（r=-0.632, P0.05），而表達(dá)FasL的淋巴細(xì)胞陽性

3、率與淋巴細(xì)胞比率間無明顯相關(guān)性。結(jié)論哮喘發(fā)作期和緩解期兒童存在淋巴細(xì)胞凋亡下降，這可能是哮喘患兒氣道慢性炎癥持續(xù)存在的原因；同時(shí)提示在緩解期患兒仍需繼續(xù)維持治療。 【關(guān)鍵詞】  哮喘 兒童 淋巴細(xì)胞 Fas(CD95) FasLAbstract：ObjectiveTo investigated the expression of Fas/FasL on peripheral blood T cells in asthmatic children and  to explore the relationship between its clinical significanc

4、e. MethodsLymphocytes were isolated with ficoll-hypaque gradient method and T lymphocytes were further purified with nylon pili. Expression of Fas/FasL was detected by immunofluoresence technology.ResultsExpression of Fas on T cells in 21 cases of the stage of attack (5.81±3.29) and in 15 cases

5、 of remission stage (9.86±4.54) were remarkably lower than those in 25 healthy children (13.72±5.33) (P0.01). Expression of FasL on T cells in the stage of attack (3.22±1.74) was significantly increased compared with normal control group (2.31±1.05) (P0.05) but those in remission

6、 patients (2.97±1.28) was not significantly changed. There was a remarkable negative relationship between expression of Fas and percentages of peripheral blood lymphocyte (r=-0.632, P0.01).ConclusionThe apoptosis of peripheral blood T lymphocytes from the children with asthma both in stage of a

7、ttack and remission are decreased. The inhibited apoptosis might be one of reasons for the chronic persistent inflammation in the airways in asthmatic children and suggests that it is necessary to continue therapy in remission stage.Key words： Asthma；   Child；   Lymphocyte ； 

8、; Fas；  FasL   支氣管哮喘以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥為其三大主要特征，其中以氣道炎癥為最主要的病理變化，并決定氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性的程度1。這種氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥是以嗜酸細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤為主的。最近研究表明，淋巴細(xì)胞凋亡與激活的調(diào)節(jié)失衡可能起到重要作用2。本課題組近期對哮喘兒童外周血T淋巴細(xì)胞Fas/FasL表達(dá)的變化進(jìn)行了研究，以探討其在哮喘中的作用。 1   對象與方法1  對象哮喘發(fā)作期21例，男14例，女7例，年齡312歲；緩解期15例，男9例，女6例，年齡312歲；所有

9、患兒均符合全國哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)3，均于采血前1周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素。同期體檢健康兒童25例作為對照，男14例，女11例，年齡312歲。2  方法 外周血淋巴細(xì)胞分離：無菌取靜脈血肝素抗凝，加等量Hanks液稀釋，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離，用含10%胎牛血清（FBS, Sigma產(chǎn)品）的RpMI 1640培養(yǎng)液（GIBCO產(chǎn)品）配成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×109/L，于培養(yǎng)瓶中37 貼壁培養(yǎng)2 h，用無菌尼龍棉柱37 作用30 min，分離出T淋巴細(xì)胞，其純度90%，錐蟲藍(lán)拒染試驗(yàn)活細(xì)胞數(shù)90%。   淋巴細(xì)胞Fas/FasL的表達(dá)：重懸的淋巴細(xì)胞離心

10、，去上清，分別與鼠抗人Fas、FasL單克隆抗體于4 孵育，以非免疫鼠IgG作為陰性對照，45 min后洗滌細(xì)胞，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（抗體均為phar Mingen產(chǎn)品），于4 避光孵育45 min，洗滌細(xì)胞，檢測陽性細(xì)胞率。3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 淋巴細(xì)胞Fas、FasL陽性率用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組與組的比較采用t檢驗(yàn)，F(xiàn)as、FasL陽性率與外周血淋巴細(xì)胞比率的相關(guān)性比較采用直線相關(guān)分析。         2  結(jié)果  

11、; 患兒與正常兒童淋巴細(xì)胞Fas、FasL陽性率的比較：從表1可以看出，哮喘發(fā)作期患兒淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)明顯下降，與正常對照組和緩解期患兒組比較差異均有非常顯著意義（t=5.914 2， 3.108  4, P0.01）；緩解期患兒淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)比發(fā)作期患兒有明顯提高，但與正常組相比仍有顯著降低（t=2.338 8, P0.05）；淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)總體均較低，但在發(fā)作期患兒仍明顯高于正常對照組，差異有顯著意義（t=2.186 1, P0.05），在緩解期患兒FasL表達(dá)雖高于正常對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.772 4, P0.05）。表1  哮喘患兒與正常兒外周

12、血淋巴細(xì)胞Fas、FasL陽性率比較（略）與對照組比較，P0.01；與緩解期比較，P0.01；與對照組比較，P0.05     表達(dá)Fas、FasL的淋巴細(xì)胞陽性率與外周血淋巴細(xì)胞比率的相關(guān)性比較：哮喘發(fā)作期患兒外周血中表達(dá)Fas的淋巴細(xì)胞陽性率與淋巴細(xì)胞比率呈明顯的負(fù)相關(guān)（r=-0.632, P0.05），而表達(dá)FasL的淋巴細(xì)胞陽性率與淋巴細(xì)胞比率間無明顯相關(guān)性。3   討論   人的Fas（即CD95）屬于TNF和NGF受體家族，包含325個(gè)氨基酸，其基因位于第10號染色體的長臂上。Fas抗原主要在外周血CD4+、CD

13、8+、B細(xì)胞、少數(shù)NK細(xì)胞、骨髓細(xì)胞系和部分組織上表達(dá)。而Fas抗原配體（FasL）是一種分子量為40KD的II型跨膜糖蛋白，也屬于TNF家族成員，它主要在激活的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞上表達(dá)。Fas和FasL結(jié)合可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡。首先使Fas形成能傳遞信號的活性形式三聚體，其在胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)（Death Domain）與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（Fasassociated Death Domain, FADD）形成二聚體而相互作用，該結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)將凋亡信號傳遞至一種凋亡蛋白酶Caspase8，使其激活，于是細(xì)胞發(fā)生凋亡。4   疾病狀態(tài)可影響Fas的表達(dá)，使細(xì)胞凋亡過程發(fā)生改變

14、。支氣管哮喘是兒科較常見的疾病，其病理過程是以嗜酸細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤為主的氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥。國內(nèi)外最近已有報(bào)道，哮喘患者淋巴細(xì)胞凋亡與激活的調(diào)節(jié)失調(diào)可能在病理方面起著重要作用。T淋巴細(xì)胞是體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用最重要的細(xì)胞成分，支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制主要與T1/T2型細(xì)胞因子比例密切失衡相關(guān)5，近年來許多學(xué)者對淋巴細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究的也較為深入。劉春濤等6研究發(fā)現(xiàn)白三烯受體拮抗劑和糖皮質(zhì)激素均通過Fas和caspase3途徑誘導(dǎo)EOS和淋巴細(xì)胞凋亡，提示在抑制氣道炎癥中兩者的活性有部分重疊。而Spinozzi及其同事們在對哮喘患者的研究中發(fā)現(xiàn)，無論是在發(fā)作期還是在緩解期，其淋巴細(xì)胞

15、CD95的表達(dá)均顯著低于正常對照，其BALF中T淋巴細(xì)胞幾乎無CD95表達(dá)。近來也有學(xué)者通過基因工程技術(shù)表達(dá)FasL的樹狀細(xì)胞來調(diào)節(jié)哮喘的表現(xiàn)，結(jié)果證明可明顯減少AHR 7 。本研究結(jié)果顯示：在發(fā)作期和緩解期患兒外周血淋巴細(xì)胞Fas陽性率均明顯低于正常兒童（P0.01），緩解期雖有所回升，但仍明顯低于正常對照組（P0.05），表達(dá)Fas的淋巴細(xì)胞陽性率與外周血淋巴細(xì)胞比率間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（P0.01）。這提示在哮喘患兒淋巴細(xì)胞增多是由于淋巴細(xì)胞CD95介導(dǎo)的凋亡減少所致。   有學(xué)者報(bào)道哮喘患者和健康者外周血中淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)均較低。淋巴細(xì)胞的凋亡受到凋亡相關(guān)基因

16、及細(xì)胞內(nèi)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的調(diào)控，但對Fas介導(dǎo)的凋亡最為敏感。有資料顯示，T細(xì)胞Fas表達(dá)水平低下，F(xiàn)as/Fasl相互作用減弱，可導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡障礙2。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在哮喘發(fā)作期和緩解期以及正常兒童外周血淋巴細(xì)胞FasL表達(dá)均較低，但是，在發(fā)作期患兒仍明顯高于正常對照組（P0.05），緩解期患兒雖比正常兒增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Krug等證實(shí)FasL表達(dá)增加是致敏淋巴細(xì)胞受到變應(yīng)原刺激后的反應(yīng)8。以上結(jié)果同時(shí)也提示，即使在緩解期，患兒淋巴細(xì)胞Fas/FasL的表達(dá)改變?nèi)晕椿謴?fù)到正常，臨床上繼續(xù)維持治療是必要的?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Haley KJ, Drazen JM. Infla

17、mmation and airway function in asthma: what you see is not necessarily what you get. J .Am J Respir Crit Care Med. 1998 Jan;157(1):1.2 Spinozzi F, Fizzotti M, Agea E, et al. Defective expression of Fas messenger RNA and Fas receptor on pulmonary T cells from patients with asthma. J .Annal Intern Med

18、, 1998,128(5):363.3 全國兒科哮喘防治協(xié)作組. 兒童哮喘防治常規(guī). J . 中華兒科雜志，1998，36(12)：747.4 袁 紅. Fas/FasL與凋亡研究進(jìn)展. J .國外醫(yī)學(xué)，生理病理科學(xué)與臨床分冊，2000,20(1):26.5 Varga EM，Wachholz P，Nouri AK，et al.T cells from human allergeninduced late asthmatic responses express IL12 receptor beta 2 subunit mRNA and respond to IL12 in vitro. J . J Immunol,2000,165(5):28776 劉春濤,羅鳳鳴,冼樂武,等.支氣管哮喘患者外周血炎性細(xì)胞凋亡的研究. J . 中華結(jié)核和呼吸雜志,2003,26(10):613.7 7. Chuang YH, Suen JL, Chiang BL. Fasligandexpressing adenovirustransfected dendritic cells decrease allerg