宮頸鱗狀細胞癌局部淋巴管生成與浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系

1、宮頸鱗狀細胞癌局部淋巴管生成與浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系               作者：林岷, 江忠清, 連成瑛, 鄭秀, 吳桂珠, 曾賽凡【摘要】  目的 探討宮頸鱗狀細胞癌（SCC）局部淋巴管生成與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。 方法 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測28例正常宮頸上皮(NCE)、36例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和68例SCC中血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-3、微淋巴管密度(LMVD)、Ki-67增殖指數(shù)(PI)和CD34微血管密度(MVD)。

2、 結(jié)果 LMVD在NCE、CIN及SCC組分別為(2.24±3.82),(6.37±5.69)和(8.29±2.80)。從NCE,CIN到SCC,LMVD顯著升高(P0.01)。SCC組LMVD與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤及預(yù)后密切相關(guān)(P0.05),與年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級、脈管浸潤、PI及MVD無顯著相關(guān)(P0.05)。SCC有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及突破深肌層間質(zhì)浸潤者,其LMVD分別顯著高于無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未突破深肌層間質(zhì)浸潤者(P0.05)。高LMVD的SCC患者生存率顯著低于低LMVD者(P0.001)。 結(jié)論 SCC局部LMVD升高可能預(yù)示腫瘤進展及

3、不良預(yù)后。 【關(guān)鍵詞】  宮頸腫瘤,病理學(xué); 微淋巴管密度; 血管內(nèi)皮生長因子受體-3; 轉(zhuǎn)移; 預(yù)后; 免疫組織化學(xué)   ABSTRACT:  Objective  To investigate the association of regional lymphangiogenesis and clinico-pathologic characteristics and prognosis in cervical squamous cell carcinoma.  Methods  The lymphatic microv

4、essel density(LMVD) labeled by vascular endothelial growth factor receptor-3（VEGFR-3）, proliferation index(PI) of cancer cells labeled by ki-67 and microvessel density(MVD) labeled by CD34 in 28 cases of normal cervical epithelium(NCE), 36 cases of cervical intraepithelial neoplasm(CIN) and 68 cases

5、 of squamous cell carcinoma of cervix(SCC) were detected by immunohistochemistry SP method.  Results  The LMVD in NCE, CIN and SCC group were (2.24±3.82), (6.37±5.69) and (8.29±2.80), respectively. The LMVD increased remarkably from NCE to CIN and SCC accordingly(P0.01).

6、0; In SCC, the LMVD correlated with pelvic lymph node metastasis, stroma involvement and prognosis(P0.05), but not correlated with patients age, FIGO staging, histological grading, intravascular infiltration, PI and MVD(P0.05).  In the cases with pelvic lymph node metastasis and deeper stroma i

7、nvolvement, the LMVD were significantly higher than that in those without the conditions mentioned above(P0.05).  The patients with higher LMVD in SCC had significantly lower survival rate than that in those with the lower LMVD(P=0.001).  Conclusion  The higher LMVD in SCC may predict

8、 cancer progression and bad prognosis.   KEY WORDS:  cervical neoplasm,pathology; lymphatic microvessel density; vascular endothelial growth factor receptor-3; metastasis; prognosis; immunohistochemistry   血管內(nèi)皮生長因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3),又

9、稱Flt4(fms like tyrosine kinase 4),屬于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)酪氨酸激酶受體家族成員,是VEGF-和-D的特異受體,在胚胎發(fā)育期表達于能生成淋巴管的靜脈內(nèi)皮,隨著胚胎的發(fā)育,VEGFR-3在血管內(nèi)皮細胞的表達下降,主要表達于淋巴管內(nèi)皮細胞1。VEGFR-3與配體結(jié)合,引起胞內(nèi)區(qū)酪氨酸磷酸化,導(dǎo)致淋巴管內(nèi)皮細胞增殖、分化等一系列生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)生1。近年來研究表明,VEGFR-3在腫瘤淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用2-4。筆者采用免疫組織化學(xué)SP法檢測宮頸鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma of cervix,SCC）局部VEGF

10、R-3標記的微淋巴管密度(lymphatic microvessel density,LMVD),探討其與局部血管生成、癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。1  材料與方法1.1  對象 選擇1998年3月-2005年6月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)36例和SCC患者68例作為研究對象，年齡中位數(shù)45歲(2472歲),45歲30例,45歲38例。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療,均經(jīng)病理確診。選取正常宮頸上皮(normal cervical epithelium,NCE)28例作為對照。CIN和組織學(xué)分級及FIGO分期參照文獻5。

11、CIN，級分別為12,11和13例(其中原位癌4例)。FIGO分期期32例,期36例;SCC，級分別2,19和47例;脈管浸潤34例(脈管浸潤的判斷標準參照文獻6),盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例;鏡下早期浸潤癌5例,浸潤癌63例(淺、深肌層浸潤分別15,48例)。截止到2006年12月底,對本組68例患者進行隨訪,共隨訪53例,隨訪率77.94%,隨訪時間平均54.8月（593月）。隨訪中死亡14例,3年生存率74.51(38/51),5年生存率67.44(29/43)。1.2  試劑 濃縮型兔抗人VEGFR-3多克隆抗體(ZA-0267,工作濃度1100,北京中杉金橋生物技術(shù)有限

12、公司)。即用型鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號MIB1)、即用型鼠抗人CD34單克隆抗體(克隆號QBEnd/10)、超敏免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB染色劑（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。1.3  方法 所有新鮮標本均經(jīng)4%甲醛溶液固定,48 h內(nèi)取材,石蠟包埋,連續(xù)35 m切片。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測CIN和SCC組織中VEGFR-3，Ki-67和CD34的表達情況。步驟按說明書操作。VEGFR-3，Ki-67和CD34均采用枸櫞酸緩沖液高壓熱力修復(fù)抗原,DAB顯色,蘇木精對比染色。用已知陽性片作為陽性對照,用PBS代替第一抗體作為陰性對照。1.4  結(jié)果判

13、斷 VEGFR-3陽性染色主要位于腫瘤邊緣及間質(zhì)微淋巴管內(nèi)皮細胞質(zhì),呈棕黃色染色,可見微淋巴管內(nèi)皮細胞圍成壁薄、形態(tài)不規(guī)則的管腔結(jié)構(gòu),內(nèi)無紅細胞。低倍鏡下觀察4個淋巴管密集區(qū)域,200倍視野下計數(shù)淋巴管數(shù),取其平均數(shù)作為LMVD7。Ki-67標記的增殖指數(shù)(proliferation index,PI):Ki-67在細胞核表達,陽性染色者呈棕黃色。在光鏡下隨機觀察10個高倍視野(×400),每個視野記數(shù)100個腫瘤細胞,計算總陽性標記細胞數(shù)。CD34標記的微血管密度(microvessel density,MVD):CD34表達于血管內(nèi)皮細胞質(zhì),呈棕黃色染色。MVD記數(shù)判斷

14、標準參照文獻6。1.5  統(tǒng)計學(xué)處理 定量資料以x±s表示,采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包,方差分析,變量間的關(guān)系采用相關(guān)分析,生存情況采用Kaplan-Meier曲線表示,Log rank檢驗。檢驗水準=0.05,以P0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。2  結(jié)  果2.1  NCE、CIN及SCC組LMVD 在NCE、CIN和SCC組,VEGFR-3標記的LMVD分別為(2.24±3.82),(6.37±5.69)和(8.29±2.80)。NCECINSCC,LMVD顯著升高(P0.01,表1)。

15、CIN,的LMVD顯著高于CIN(P0.01,表1)。NCE和CIN組VEGFR-3主要表達于基底膜附近微淋巴管內(nèi)皮細胞質(zhì)。SCC組VEGFR-3主要表達于腫瘤組織周邊或間質(zhì)淋巴管內(nèi)皮細胞質(zhì),部分表達于腫瘤細胞質(zhì)(圖1A)。表1  NCE、CIN及SCC組LMVD（略）2.2  Ki-67和CD34在NCE，CIN及SCC組的表達 NCE，CIN及SCC組Ki-67標記的PI分別為(96.04±54.60),(300.03±157.13)及(378.72±199.56)。NCECINSCC,PI顯著升高(P0.001)。Ki-67在N

16、CE主要表達于上皮基底層細胞核,在CIN主要表達于異形細胞核,在SCC主要表達于癌細胞核（圖1B）。CD34標記的MVD在NCE，CIN及SCC組分別為(6.3±2.9),(18.0±4.7)及(58.2±19.6)條。NCECINSCC,MVD顯著升高(P0.001)。CD34在NCE和CIN主要表達于上皮基底膜附近微血管內(nèi)皮細胞質(zhì),在SCC主要表達于癌巢間質(zhì)微血管內(nèi)皮細胞質(zhì)（圖1C）。2.3  CIN及SCC組LMVD與PI及MVD的關(guān)系 將CIN及SCC組LMVD以中位值為界分為高水平和低水平組。在CIN組,LMVD高水平者PI與低水平者

17、比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但LMVD高水平者MVD與低水平者比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,表2);在SCC組,LMVD高水平者PI及MVD分別與低水平者相比均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,表2)。相關(guān)分析顯示,CIN組LMVD與PI無顯著相關(guān)性(r=0.099,P=0.567),但與MVD有顯著相關(guān)性(r=0.373,P=0.025）;SCC組LMVD分別與PI及MVD均無顯著正相關(guān)(PI:r=0.159,P=0.196;MVD:r=0.114,P=0.354)。表2  CIN及SCC組LMVD與PI及MVD的關(guān)系（略）     &

18、#160;   2.4  SCC組LMVD與臨床病理特征的關(guān)系 SCC組LMVD與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及間質(zhì)浸潤密切相關(guān)(P0.05),而與年齡、FIGO分期、組織學(xué)分級及脈管浸潤無關(guān)(P0.05,表3)。SCC有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及突破深肌層間質(zhì)浸潤者,其LMVD分別顯著高于無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未突破深肌層間質(zhì)浸潤者(P0.05)。表3  SCC組LMVD與臨床病理特征的關(guān)系（略）2.5  SCC的LMVD與預(yù)后的關(guān)系 SCC組高水平和低水平組Kaplan-Meier生存曲線見圖2。LMVD高水平組的生存率顯著低于LMVD低水平組,L

19、og rank檢驗,P=0.0009。3  討  論3.1  VEGFR-3表達升高可能參與SCC的發(fā)展 VEGFR-3是淋巴內(nèi)皮細胞上第1個被克隆的分子標志物,其基因定位于5q33-35,編碼產(chǎn)物在人類有兩種剪接異構(gòu)體,長異構(gòu)體末端有額外65個氨基酸殘基,在組織中檢測到的主要類型為長異構(gòu)體,參與淋巴內(nèi)皮細胞活化后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。糖基化VEGFR-3相對分子質(zhì)量為195 ku,胞外第5個Ig結(jié)構(gòu)域被蛋白酶分解為相對分子質(zhì)量分別為120 ku和75 ku的兩條肽鏈,鏈間以二硫鍵連接。在胚胎淋巴管出現(xiàn)以前,VEGFR-3是心血管系統(tǒng)發(fā)育所必需的;在稍后的發(fā)育中,

20、VEGFR-3則主要表達于淋巴管內(nèi)皮細胞上;在成人淋巴管生成受到抑制,但在惡性腫瘤病變中淋巴管生成再次被激活,腫瘤細胞分泌VEGF-C,后者誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細胞表達VEGFR-3,進而形成淋巴管,在此環(huán)境下腫瘤細胞易于進入增生擴張的淋巴管中,最終產(chǎn)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8。近年發(fā)現(xiàn),淋巴管生長因子VEGF-C和VEGF-D通過作用于淋巴管內(nèi)皮細胞上的特異受體VEGFR-3,引起淋巴管內(nèi)皮細胞分化和增殖,導(dǎo)致淋巴管生成,而VEGFR-3是較特異的淋巴管內(nèi)皮細胞標記物1。有文獻報道,可依據(jù)VEGFR-3陽性染色計數(shù)淋巴管8。有研究報道,宮頸癌VEGFR-3表達顯著升高9-11。筆者研究顯示,NCECINSCC,

21、LMVD顯著升高(P0.01)。VEGFR-3表達升高可能參與SCC的發(fā)展過程。筆者的結(jié)果與上述文獻報道一致。Van等報道在SCC形成的不同時期,VEGFR-3表達具有顯著差異,CIN及CIN與CIN 比較差別顯著(P0.001),而CIN與SCC比較卻無明顯差別,在SCC發(fā)展過程中,淋巴管形成的表型可能發(fā)生在CIN期12。筆者發(fā)現(xiàn),CIN和CIN的LMVD顯著高于CIN(P0.01),而CIN的LMVD與CIN比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。筆者結(jié)果與Van等的結(jié)果不一致12,可能與樣本量少、判斷標準不同等有關(guān),有待進一步研究。3.2  VEGFR-3表達與SCC血管生成及癌細胞增

22、殖的關(guān)系 筆者研究結(jié)果顯示,CIN組LMVD高水平者MVD顯著高于低水平者(P0.05),LMVD與MVD顯著正相關(guān);而SCC組LMVD高水平者MVD與低水平者相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),LMVD與MVD無顯著相關(guān)性。丁國芳等報道,前列腺癌VEGFR-3表達與CD31標記的MVD顯著正相關(guān)13。周瑩等報道,乳腺癌VEGFR-3表達與MVD無顯著相關(guān)性(P0.05),VEGFR-3可能對血管生成無特異的促進作用14。筆者認為,VEGFR-3在腫瘤組織的表達和血管生成關(guān)系的研究可能有不同結(jié)果,有待進一步探討。在CIN和SCC組,LMVD高水平者PI與低水平者相比均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.

23、05),兩者也均無顯著相關(guān)性。該結(jié)果提示,在SCC發(fā)展過程中,VEGFR-3可能不直接參與癌細胞增殖。Leu等報道,腫瘤淋巴管主要位于癌旁組織15。筆者也有相同的發(fā)現(xiàn)。劉琰等應(yīng)用VEGFR-3反義核酸轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細胞,發(fā)現(xiàn)其蛋白表達顯著下降,宮頸癌細胞凋亡顯著增加,應(yīng)用VEGFR-3反義核酸可能通過降低宮頸癌細胞VEGFR-3表達,繼而抑制VEGFR-3所介導(dǎo)的信號通路而發(fā)揮作用,既可阻斷腫瘤的淋巴管轉(zhuǎn)移,又可促使腫瘤細胞凋亡,不失為未來臨床抗腫瘤治療的一個新選擇16。間接提示VEGFR-3有可能促進宮頸癌細胞增殖。3.3  VEGFR-3表達與SCC浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系

24、60;國外多項研究表明,VEGF-C/VEGFR-3在腫瘤周邊的新生淋巴管內(nèi)皮細胞呈高表達,與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān);VEGF-C可通過與VEGFR-3結(jié)合而促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,阻斷VEGF-C或VEGFR-3的作用,能夠抑制腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移2-4。Birner等報道,宮頸癌VEGFR-3表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)9。VEGF-C和VEGF-D是目前已知的VEGFR-3的兩種特異配體,二聚化的VEGF-C或VEGF-D與VEGFR-3同源二聚體結(jié)合后可誘導(dǎo)淋巴管生成1。促進腫瘤淋巴管生成的機制可能是淋巴管生長因子與VEGFR-3結(jié)合后,通過MEK/ERK和PI3-激酶/Akt途徑促進淋巴管

25、內(nèi)皮增殖,引起淋巴管管腔增大和數(shù)目增多,并可能改變原有和新生淋巴管內(nèi)皮的通透性,改變腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)的黏附性,從而有利于腫瘤細胞向相鄰淋巴管內(nèi)轉(zhuǎn)移17。筆者的結(jié)果顯示,SCC LMVD與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及間質(zhì)浸潤密切相關(guān)(P0.05)。SCC有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及突破深肌層間質(zhì)浸潤者LMVD顯著高于無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未突破深肌層間質(zhì)浸潤者(P0.05)。筆者將SCC組LMVD以中位值為界分為高水平和低水平兩組,兩組患者生存率比較差別顯著,LMVD高水平組患者的生存率顯著低于低水平組。因此,筆者認為,SCC局部VEGFR-3高表達通過與其配體結(jié)合而促進淋巴管內(nèi)皮細胞增殖,引起淋巴管增多,同時可能改

26、變原有和新生淋巴管內(nèi)皮的通透性,改變腫瘤細胞和細胞外基質(zhì)的黏附性,從而有利于SCC細胞向深層間質(zhì)浸潤和向相鄰淋巴管內(nèi)轉(zhuǎn)移,使患者生存率降低。【參考文獻】  1Clarijs R,Schalkwijk L,Hofmann U B,et al. Induction of vascular endothelial growth factor receptor-3 expression on tumor microvasculature as a new progression marker in human cutaneous melanomaJ. Cancer Res, 2002,62(23):7059-7065.2He Y,Karpanen T,Alitalo K. Role of lymphangiogenic factors in tumor metastasisJ. Biochim Biophys