大鼠全腦缺血再灌注時細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

1、大鼠全腦缺血再灌注時細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用與Bad蛋白在海馬表達的關(guān)系研究西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院麻醉科 西安 710004何家璇 薛榮亮吳剛【摘要】目的：觀察全腦缺血再灌注時ERK信號通路與Bad蛋白在大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元表達的變化和細胞凋亡及相互關(guān)系。方法：90只健康雄性SD大鼠隨機分為3組（n30）：假手術(shù)組（PO組）、全腦缺血再灌注組（IR組）、抑制劑pd98059干預(yù)組+全腦缺血再灌注組（PD組）。采用4血管法建立大鼠全腦缺血再灌注模型，在各個時間點分別用免疫組化法檢測磷酸化ERK和磷酸化Bad 蛋白在大鼠海馬區(qū)的表達，TUNEL染色觀察海馬神經(jīng)元存活和凋亡

2、的變化。結(jié)果：IR組TUNEL陽性細胞于缺血再灌注6h后開始出現(xiàn)，24h至48h達高峰，PD組TUNEL陽性細胞表達最強；IR組磷酸化ERK于缺血組再灌注2h后在海馬CA3區(qū)可見表達，再灌注6h后逐漸下降，至再灌注后48h未見表達；IR組磷酸化 Bad蛋白于再灌注后2h在海馬CA3區(qū)可見表達, 之后逐漸減弱，再灌注后24h后未見；二者在CA1區(qū)的表達均弱于CA3區(qū)。二者的表基金項目：國家自然科學基金資助項目（30571790）通訊作者：薛榮亮，TelE-mail：xuerl達下降變化與凋亡發(fā)生的高峰時間一致。 結(jié)論：磷酸化ERK和磷酸化Bad在腦缺血再灌注時表達下降

3、且變化一致，ERK信號通路可通過抑制Bad的磷酸化抗凋亡形式向去磷酸化促凋亡形式的轉(zhuǎn)變，發(fā)揮抗調(diào)亡機制，參與腦缺血再灌注時神經(jīng)細胞的保護。【關(guān)鍵詞】腦；缺血再灌注損傷；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶；Bad蛋白；細胞凋亡Relationship between effect of MAPKERK1/2 signal transduction pathway and expression of Bad in rat hippocampus after global cerebral ischemia reperfusionHE Jia-xuan, XUE Rong-liang, WU Gang.Depart

4、ment of Anesthesiology, Second Affiliated Hospital, Xi，an Jiaotong University, Xi，an 710004, China【Keywords】cerebral ischemia/reperfusion injury; hippocampus; extracellular signal regulated kinase；Bad；apoptosis【Abstract】Objective:To investigate the ERK signal transduction pathway expression of the p

5、hosphorylation forms of Bad(p-Bad) in hippocampus of SD rats after global cerebral ischemia/reperfusion and the relationship of their expression and cell apoptosis. Methods: Ninety healthy male SD rats were divided into 3 groups randomly: pseudo operation group (PO group, n=30), ischemia/reperfusion

6、 group(IR group, n=30) and Pd98059+IR group(PD group, n=30). Global cerebral ischemia/reperfusion model was produced by 4-VO method. The rats were injected Pd98059 20mins before global cerebral ischemia/reperfusion, then subjected to 5mins ischemia followed by 2, 6, 12, 24h, 48h, 72h reperfusion and

7、 all rats were executed at corresponding time points HE staining, immunohistochemical staining, and TUNEL staining of brain tissue section were performed. Results: Cell apoptosis detection showed in IR group, cell apoptosis start increase in CA1 and CA3 6 hours after ischemia-reperfusion. It reach a

8、pex in 24 to 48 hours and start reduce in 72 hours. The number of apoptosis cell in CA1 was more than it in CA3. Cell apoptosis in PD group was most obvious. In CA3 of IR group, the phosphorylation forms of ERK (p-ERK) was weakly expressed 2h after ischemia/reperfusion, reached apex in 6 hours and l

9、asted to 24h and the expression of PD group was negative; p-Bad was expressed 2h after ischemia/reperfusion and gradually decreased, not seen in 24 hours. The expression of p-ERK and p-Bad in CA1 was weaker than them in CA3. Conclusion: The inhibition of ERK induced the expression of p-Bad in hippoc

10、ampus after global cerebral ischemia/reperfusion. Expression of ERK after global cerebral ischemia/reperfusion in brain may depress the apoptosis of neurons, perform a protective function on neurons after ischemia/reperfusion.【Keywords】cerebral ischemia/reperfusion injury; hippocampus; extracellular

11、 signal regulated kinase；Bad；apoptosis目前研究認為，腦缺血再灌注損傷仍是多種因素或機制共同或先后作用的結(jié)果，其具體機理非常復(fù)雜。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinase，MAPK)家族成員是連接細胞膜表面受體與決定性基因表達之間重要調(diào)節(jié)酶，對其成員之一細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (extracellular signal regulated kinase, ERK) 在腦缺血再灌注損傷中作用的研究結(jié)果不完全一致，在腦缺血再灌注致神經(jīng)元凋亡中ERK通路是何作用尚未定論。Bad（Bcl-xL/ Bcl-2 associat

12、ed death promoter, Bad）是B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia-2, Bcl-2) 蛋白家族中的促凋亡蛋白的一員，穩(wěn)定狀態(tài)的磷酸化Bad蛋白發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，而去磷酸化的游離Bad蛋白通過易位和一系列細胞活動促進凋亡的發(fā)生。但Bad與ERK信號通路之間的關(guān)系如何目前尚未見報道。本實驗建立大鼠全腦缺血再灌注模型，應(yīng)用特異性抑制劑對ERK通路進行干預(yù)，檢測磷酸化ERK 和磷酸化BAD的表達變化及與神經(jīng)細胞凋亡的關(guān)系，探討ERK在大鼠全腦缺血再灌注損傷中致神經(jīng)元凋亡的可能機制及其是否及如何參與影響了凋亡調(diào)控蛋白BAD的表達。1 材料與方法1.1材料與試劑小鼠抗

13、磷酸化Bad(Ser112)單克隆抗體(Cell Signaling Technology 公司，美國，兔抗ERK單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國)，Pd98059購于美國Cell Signaling公司，TUNEL試劑盒購自德國寶靈曼公司，SP法免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司。1.2動物分組及模型的建立采用健康雄性SD大鼠90只，由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供，體重為300g20g。隨機分成三組，假手術(shù)組（PO，n30）、全腦缺血再灌注組（IR，n30）和pd98059干預(yù)組（PD，n30），每組各設(shè)6個時間點，每組各時間點均為5只。采用大

14、鼠4血管結(jié)扎法建立全腦缺血模型，大鼠全腦缺血5min后進行再灌流。IR組：所有動物均以1%戊巴比妥鈉40mg/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉，待翻正反射消失后俯臥固定于手術(shù)臺上，在大鼠枕頸正中切開皮膚顯露枕后三角，在顯微鏡下于枕后三角外側(cè)與第一橫突之間找到椎動脈博動后，以25mV電凝器凝斷雙側(cè)椎動脈，逐層縫合，術(shù)畢回籠,使其體溫維持37左右。24h后先將SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水（每只鼠給予0.3mgkg）20mins后進行夾閉頸總動脈處理。以同樣方法麻醉，在胸鎖乳突肌后氣管旁，顯露頸總動脈，用無創(chuàng)動脈夾同時夾閉5min，期間密切觀察其瞳孔變化，無瞳孔散大者予以剔除，逐層縫合后回籠，分別于再灌注后2，

15、6，12，24，48，72h，以4%多聚甲醛灌注處死。PD組：將SD大鼠經(jīng)尾靜脈注射抑制劑pd98059（每只鼠給予0.3mgkg）20mins后進行夾閉頸總動脈處理，其他操作同IR組。PO組：除不凝斷椎動脈和夾閉頸總動脈外，其他處理同IR組。1.3組織學檢查到要求時間時麻醉后于劍突下橫向剪開腹壁顯露膈肌，將其沿胸壁左右向剪開,將胸前壁離斷掀起，顯露心臟，用9號針從心尖插入心室，剪開右心房，先用生理鹽水然后再用4%多聚甲醛200mL灌注至肝臟變白、四肢僵硬，斷頭取腦，在視交叉后1mm及4mm處冠狀切面切開，取中間塊，固定后石蠟包埋，在海馬齒狀回互包平面連續(xù)冠狀切片，片厚4m.。HE染色光鏡(&

16、#215;400)觀察海馬CA1/CA3區(qū)神經(jīng)元細胞形態(tài)。 1.4 TUNEL染色采用德國寶靈曼公司的TUNEL試劑盒染色，參照試劑盒方法并做部分修改，同時設(shè)立陽性(加DNaseI,1mg·L-1)和陰性對照(不加TdT)組。光鏡觀察顯示細胞核有明顯的黃棕色顆?；虬咂瑸殛栃约毎?，即凋亡細胞。定量分析方法為：光鏡下計算凋亡指數(shù).凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)計算方法：每只動物隨機兩張切片，每張切片觀察CA1或CA3區(qū)，分別計算各區(qū)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)：AI=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。1.5免疫組化染色鼠抗磷酸化Bad單克隆稀釋度為1150，兔抗ERK單

17、克隆稀釋度為1100。等稀釋度的兔抗IgG做陰性對照。切片依次脫蠟至水，3%過氧化氫孵育10min，三蒸水洗5min×3次。PBS(pH7·4)浸泡5min，微波爐抗原修復(fù)15min。自然冷卻至室溫。滴加封閉血清，室溫孵育1h，傾去勿洗。滴加1100的p-ERK、p-Bad抗體，放入4冰箱過夜。PBS沖洗5min×3，擦干組織周圍水分，滴加生物素標記的二抗，60孵育30min；三蒸水洗5min×3次，擦凈切片周圍水分后，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，放入37溫箱孵育20min。三蒸水洗5min×3次，DAB顯色，脫水、透明、封片。1.6圖象分

18、析切片采用Leica Qunatimet570圖像分析系統(tǒng)進行圖象分析。取每張切片CA1區(qū)、CA3區(qū)各測5個相同單位面積取平均灰度值。1.7統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均以 X±s表示, 應(yīng)用SPSS10.0軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，多樣本中兩組均數(shù)及多時間點的比較采用t檢驗。 2 結(jié) 果2.1 HE染色高倍鏡下假手術(shù)組大鼠海馬錐體細胞排列整齊，形態(tài)完整；缺血組,神經(jīng)元細胞腫脹,分布不均,細胞周圍間隙增寬,有的細胞體積縮小,核固縮深染。2.2 TUNEL TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)IR組于在缺血再灌注后6h凋亡細胞開始增加，主要位于CA1區(qū)，24h至48h為高峰，至72h明顯減少。

19、各時間點CA1區(qū)凋亡細胞數(shù)多于CA3區(qū)(P<0.05)。PD組于各時間點各區(qū)凋亡細胞計數(shù)多于IR組(P<0.05)。見表1。2.3 免疫組化染色p-ERK染色陽性表達于細胞核內(nèi),呈現(xiàn)淺棕黃色顆粒狀。p-ERK在PO組海馬CA3區(qū)細胞核內(nèi)無表達，胞漿內(nèi)極少表達，CA1區(qū)表達弱于CA3區(qū)(P<0.05)；IR組各時間點在海馬CA1區(qū)p-ERK均未見表達，CA3區(qū)于再灌注后2h可見細胞核內(nèi)有微弱的表達，于再灌注6h后逐漸下降，至再灌注后48h未見表達。PD組CA1區(qū)、CA3區(qū)均未見著色。見表2。p-Bad在PO組各時間點可見表達；IR組于再灌注后2h在海馬CA3區(qū)可見p-Bad表達

20、，之后逐漸減弱，再灌注后24h后未見，CA3區(qū)表達均強于CA1區(qū)(P<0.05)；IR組各時間點表達均弱于PO組(P<0.05)； PD組p-Bad各時間點表達均弱于IR組(P<0.05)，再灌注后2h及6h可見微弱表達，之后時間點未見表達，CA3區(qū)表達均強于CA1區(qū)(P<0.05)。見表3。3.討論MAPK家族成員是哺乳動物細胞內(nèi)一組進化保守的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶類，作為重要的信號傳遞途徑之一，其連接細胞膜表面受體與決定性基因的表達，被認為是任何胞外刺激由胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜信號通路的交匯點。ERK是MAPK家族的一員, 引起ERK激活的細胞外信號主要是生長因子等有絲分裂刺

21、激,它的信號傳遞途徑是涉及調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育及分裂的信號網(wǎng)絡(luò)的核心。研究表明ERK途徑在多種疾病包括腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，在重要臟器的缺血/再灌注損傷研究中，均發(fā)現(xiàn)在損傷早期伴有ERK蛋白激酶的激活。但其在腦缺血中的表達及作用研究結(jié)果不一。Pd98059是作用于ERK通路中ERK上游的蛋白激酶MEK(MAPK/ERK激酶)的特異性抑制劑，其特異性地抑制ERK的磷酸化而阻斷此通路的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。腦缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，并激活一些基因及其表達產(chǎn)物，通過對促細胞凋亡基因和抑制細胞凋亡基因的調(diào)控發(fā)揮作用5。從目前巳知的細胞凋亡機制看，線粒體功能異常是重要的通路，而該

22、通路與Bcl-2家族蛋白(包括BAD，Bcl-XL和Bcl-2等)有著密切關(guān)系6。在凋亡誘導(dǎo)因素的刺激下，細胞的跨膜或者胞內(nèi)信號通路將被啟動，此時相對線粒體來說，BAD蛋白的磷酸化和非磷酸化將成為一個檢查點(check piont)。線粒體膜表面分別存在著BAX同型二聚體，非磷酸化的BAD將直接導(dǎo)致BAX的單聚化，從而形成線粒體的Ca2+內(nèi)流和細胞色素C（cytC）外流的交換通道，這將導(dǎo)致膜電勢降低、ATP形成不足及下游的caspapse活化7；而磷酸化的BAD則可能誘導(dǎo)BAX的單聚化，從而失去作為凋亡誘導(dǎo)信號的功能8。據(jù)報道9地塞米松刺激下，ERK通路被顯著抑制。其結(jié)果是，Bcl-2等抗凋亡

23、活性蛋白失去ERK的磷酸化激活，從而加速了凋亡過程的發(fā)生，且由于BAD蛋白不能被磷酸化，故導(dǎo)致下游的線粒體膜電勢的崩潰和ATP形成不足，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等Ca2+庫不能維持正常的功能,游離Ca2+流入胞漿,從而誘發(fā)細胞凋亡。 Bad是Bcl-2 蛋白家族中的促凋亡蛋白的一員，正常生理狀態(tài)下磷酸化的Bad與其分子伴侶蛋白14-3-3結(jié)合組成無活性的復(fù)合物1,2。接受凋亡刺激后，Bad去磷酸化，去磷酸化的Bad與分子伴侶蛋白解離，Bad從構(gòu)成性結(jié)合的Bcl-XL-Bax二聚體中置換并釋放促凋亡的Bax3，Bax 移位到線粒體，促使線粒體釋放cytC，引起caspase 級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡4?？傊?，穩(wěn)定狀態(tài)

24、的磷酸化Bad蛋白發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，而去磷酸化的游離Bad蛋白通過易位和一系列細胞活動促進凋亡的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后ERK在SD大鼠海馬缺血耐受區(qū)CA3區(qū)表達而缺血敏感區(qū)CA1區(qū)未見表達，應(yīng)用ERK通路抑制劑后，CA1區(qū)凋亡神經(jīng)細胞數(shù)目增加，同時發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)的磷酸化Bad蛋白在CA1區(qū)表達減弱，這一結(jié)果更加支持了ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抗凋亡作用。王耀岐10等實驗發(fā)現(xiàn)5min腦缺血使對缺血敏感的海馬CA1區(qū)p-JNK表達增加，p-ERK無明顯表達,CA3區(qū)存活的神經(jīng)元上有p-ERK的表達，而p-JNK的表達較弱，他們認為CA1區(qū)缺乏保護信號而增強有害信號的表達可能是腦缺血后神經(jīng)元延

25、遲性死亡的的重要機制。研究結(jié)果與我們一致，提示ERK可能參與了腦缺血后的細胞保護，因此缺血敏感的CA1區(qū)缺乏保護性信號，應(yīng)用抑制劑后保護性信號表達更加減少，凋亡細胞增加；對缺血耐受的CA3區(qū)保護性信號表達強于CA1區(qū)，應(yīng)用抑制劑后保護性信號表達也減輕。Hu等11用Western blotting和激光共聚焦顯微鏡在大鼠腦缺血模型上觀察15min腦缺血后MAPK的活性變化，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后30min和4h在耐受缺血的CA3/DG區(qū)細胞核有p-ERK表達，在死亡的CA1區(qū)神經(jīng)元無表達。而JNK的底物c-Jun卻在CA1區(qū)選擇性表達，提示ERK參與缺血后的細胞保護，JNK介導(dǎo)了神經(jīng)元損傷。另外，有研

26、究表明，ERK激活后，可降低腦缺血再灌注損傷NMDA受體活性，抑制Ca2+內(nèi)流，具有神經(jīng)元保護作用12-13；而抑制腦缺血再灌注損傷后ERK表達，可促進短暫局灶腦缺血后神經(jīng)元的凋亡13-14，我們的研究結(jié)果也與這些報道一致。ERK激活后通過信號傳導(dǎo)，活化細胞核內(nèi)不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，進而使細胞出現(xiàn)增殖、分化或凋亡。本實驗中IR組較PO組ERK表達增強，也提示我們?nèi)毖俟嘧⒑驟RK活性的增加參與了促進細胞存活的保護性機制，可能是缺血刺激引起的膠質(zhì)細胞釋放生長因子等機制（生長因子是激活ERK通路的胞外刺激信號）所致。綜上所述，通過本實驗研究我們認為ERK通路是神經(jīng)元的存活通路，ERK參與了缺血后神經(jīng)

27、元的保護；特異性抑制劑使得ERK通路發(fā)生變化并影響凋亡調(diào)控蛋白BAD的表達，抗凋亡效應(yīng)的磷酸化Bad蛋白表達減少，也從另一方面說明ERK參與了缺血后神經(jīng)元的保護。磷酸化ERK和磷酸化Bad在抑制劑組表達下降且變化一致，同時細胞凋亡增加并達到高峰，說明ERK信號通路可能通過抑制Bad的磷酸化抗凋亡形式向去磷酸化促凋亡形式的轉(zhuǎn)變，參與到細胞凋亡的線粒體途徑中發(fā)揮抗調(diào)亡機制，參與腦缺血再灌注時神經(jīng)細胞的保護。參考文獻1 Datta SR, Dudek H, Tao X, et al. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the

28、 cell-intrinsic death machinery. Cell, 1997, 91(2): 231-41.2 Tan Y, Demeter MR, Ruan H, et al. BAD Ser-155 phosphorylation regulates BAD/Bcl-XL interaction and cell survival. J Biol Chem, 2000, 275(33): 25865-25869.3 Yang E, Zha J, Jockel J, et al. Bad, a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2,

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34、ion against ischemic brain injury by inhibition of MEK1 protein kinase in mice Exploration of potential mechanism associated with apoptosis. J Pharmacol Exp Ther, 2003, 304(1):172-178.14 李 軍, 曹 紅, 曾邦雄審校. MAPK級聯(lián)僅反應(yīng)與缺血性腦損傷. 國外醫(yī)學麻醉學與復(fù)蘇分冊, 2002, 24(4): 232-235.（附表13見下頁）表1 SD大鼠缺血再灌注后各時點CA1區(qū)和CA3區(qū)凋亡指數(shù)的變化（&

35、#177;s）組別2h6h12h24h48h72hCA1區(qū)PO0.25±0.501.49±0.671.51±0.651.57±0.782.14±0.481.65±0.63IR2.54±0.3814.42±4.2529.24±6.0841.32±7.3038.94±7.3221.36±5.07 PD5.63±0.8429.76±5.1343.57±7.1160.08±7.6853.31±7.36 31.06±6.56C

36、A3區(qū)PO0.25±0.501.49±0.671.51±0.651.57±0.782.14±0.481.65±0.63IR1.33±0.299.05±3.1220.57±6.0833.75±6.1230.13±6.3415.03±4.22PD4.04±0.7023.32±6.0231.26±6.1049.87±7.2642.82±7.2122.64±6.10P<0.05 vs PO, P<0.05 vs PO, P<0.05 vs IR，P<0.05 vs CA1表2SD大鼠缺血再灌注后各時點CA1區(qū)和CA3區(qū)p-ERK灰度值組別2h6h12h24h48h72hCA1區(qū)PO190.26±21.12196.75±19.65196.46±25.63205.39±21.58206.52±26.33207.64±26.63IR210.41±29.67209.63±24.38209.82±23.91209.70±24.87207.34±21.6