天花粉蛋白體外抗人白血病和淋巴瘤細(xì)胞的作用機制

1、天花粉蛋白體外抗人白血病和淋巴瘤細(xì)胞的作用機制              作者：王媛媛，歐陽東云，鄭永唐 【摘要】  本研究的目的是探討天花粉蛋白(TCS)對人白血病和淋巴瘤細(xì)胞系的殺傷作用機制。用臺盼藍染色法檢測TCS對細(xì)胞生長的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測TCS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況及對細(xì)胞生長周期的影響。結(jié)果表明：12.5 g/ml濃度的TCS可以顯著抑制各種白血病細(xì)胞系的增殖，但對T淋巴細(xì)胞系和巨噬細(xì)胞細(xì)胞系表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，而對B淋巴瘤細(xì)胞系則表現(xiàn)為生長抑

2、制效應(yīng)。通過細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，TCS可以將B淋巴瘤細(xì)胞系細(xì)胞阻滯在S期，從而抑制細(xì)胞增殖，但對T淋巴細(xì)胞系則無明顯影響。結(jié)論：TCS以不同的作用機制殺傷白血病細(xì)胞，根據(jù)不同的細(xì)胞類型分別表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞生長周期的作用。 【關(guān)鍵詞】  細(xì)胞凋亡   Mechanism of Trichosanthin Against Human Leukemia/Lymphoma Cells In Vitro   Abstract   The study was aimed to investigate the mechanism

3、 of cytotoxic effect of trichosanthin (TCS) on leukemia or lymphoma cell lines. Trypan blue exclusion was used to measure the effect of TCS on cell growth and flow cytometry was used to detect the effects of TCS on cell apoptosis and cell cycle. The results indicated that the TCS could inhibit proli

4、feration of various leukemia/lymphoma cell lines at 12.5 g/ml  concentration, but the effect of TCS on Tlymphocyte and macrophage cell lines showed inducing cell apoptosis and the effect of TCS on B lymphocyte  cell line showed inhibiting cell growth. Detection  of  the cell cycl

5、e revealed  that TCS could arrest B lymphocytes at S phase, but not had this  effect on T lymphocytes at the same condition. It is concluded that  TCS can kill leukemia/lymphoma cells through different mechanisms such as  inducing cell apoptosis or arresting  cell cycle 

6、; according to cell types.   Key words   trichosanthin; apoptosis; cell cycle; leukemia; lymphoma   血液系統(tǒng)惡性腫瘤是一類常見病和多發(fā)病，發(fā)病年齡小，死亡率高，嚴(yán)重危害人類健康。目前的化療藥物存在毒副作用大的弊端，從天然藥物中尋找有效的抗腫瘤藥物是國內(nèi)外研究的熱點之一。天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是我國創(chuàng)制的為數(shù)不多的一類新藥之一1。TCS是從葫蘆科植物栝樓(trichosanthes kirilowii)球根中提取

7、的一種由247個氨基酸組成的型核糖體滅活蛋白(ribosome inactivating Protein, RIP),具有多種生物學(xué)和藥學(xué)活性，包括免疫抑制作用、中期引產(chǎn)、抗腫瘤及抗病毒作用2，3。我們還首次發(fā)現(xiàn)TCS具有體外抗白血病和淋巴瘤的作用，并且針對不同的細(xì)胞系分別表現(xiàn)為直接殺傷細(xì)胞和抑制細(xì)胞生長的作用，TCS抗HIV1作用可能與其選擇性的細(xì)胞毒性有關(guān)，但具體機制尚不清楚4，5。在本研究中，我們檢測了TCS對各種白血病和淋巴瘤細(xì)胞系的誘導(dǎo)凋亡的作用及對細(xì)胞周期的影響，以期發(fā)現(xiàn)TCS抗白血病和淋巴瘤的作用機制，探討其用于治療血液腫瘤的可行性。   材料和方法 

8、;  天花粉蛋白   TCS購自上海金山制藥廠，從葫蘆科植物栝樓（trichosanthes  kirilowii）球根中分離純化所得。   試劑   臺盼藍購自上海化學(xué)試劑站(進口分裝)。RPMI 1640和新生牛血清均購自Gibco公司。AnnexinV凋亡檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Costar公司。碘化丙錠購自Sigma公司。   中國實驗血液學(xué)雜志  J Exp Hematol 2007; 15(4)天花粉蛋白體外抗人白血病和淋巴瘤細(xì)胞的作用機

9、制   細(xì)胞   人淋巴細(xì)胞系Hut78和Raji由P. Marx博士(California Primate Research Center，University of California，USA)惠贈；Molt4細(xì)胞由日本國立衛(wèi)生研究院筑波醫(yī)學(xué)靈長類研究中心R.Mukai 惠贈；Jurkat、CEM由英國Medical Research Council(MRC)，AIDS Reagent Project惠贈；Daudi細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所；U937細(xì)胞購自美國American Type Culture Collection (ATCC)

10、。以上細(xì)胞均在含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。   細(xì)胞死亡率的臺盼藍染色法檢測   將2 ml細(xì)胞懸液(3×105/ml)接種至24孔平底培養(yǎng)板，分別加入終濃度為12.5、2.5、0.5、0.1 g/ml的TCS，同時設(shè)置不含TCS的空白對照孔。37、5 CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后收集細(xì)胞，加入0.4%的臺盼藍染色后，在顯微鏡下用計數(shù)板記數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞并計算其死亡率。   細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測   將2 ml細(xì)胞懸液(3×105/ml)接種至24孔平底培養(yǎng)板

11、，分別加入終濃度為12.5、2.5、0.5、0.1  g/ml的TCS，同時設(shè)置不含TCS的空白對照孔。37、5 CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的AnnexinV和PI溶液，上流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson Calibur）檢測。Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算細(xì)胞凋亡率。   細(xì)胞周期檢測   將2 ml細(xì)胞懸液(3×105/ml)接種至24孔平底培養(yǎng)板，加入終濃度為12.5  g/ml的TCS，同時設(shè)置不含TCS的

12、空白對照孔。37、5 CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)調(diào)整到1×106/ml。收集的細(xì)胞懸液用PBS洗2次，再用70%的冷乙醇在-20下固定過夜。用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入RNase A(10 mg/ml in 1 mol/L TrisCl, pH 7.4) 37處理1小時。隨后加入碘化丙錠 (100 g/ml  phosphatebuffered saline, pH 7.4)對細(xì)胞進行染色。室溫放置1小時后，上流式細(xì)胞儀檢測6，應(yīng)用Cellquest軟件獲取數(shù)據(jù)，Modfit軟件分析細(xì)胞周期。   統(tǒng)計學(xué)處理  

13、; 數(shù)據(jù)用±SD表示，采用SPSS  11.5統(tǒng)計軟件作t檢驗分析。比較不同處理的參數(shù),以p0.01表示有顯著差異。            結(jié)   果   天花粉蛋白對各種白血病細(xì)胞的殺傷率   TCS對各種腫瘤細(xì)胞系均有一定的殺傷作用，并且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，但TCS對不同的細(xì)胞系的殺傷作用又有著明顯的差異。在相同作用條件下，TCS對T淋巴細(xì)胞系細(xì)胞 (HUT78、Molt4、Jurkat、CEM)和巨噬細(xì)胞系U9

14、37細(xì)胞的殺傷率較高，而對B淋巴瘤細(xì)胞(Raji、Daudi)的殺傷率很低。通過臺盼藍染色發(fā)現(xiàn)，TCS對T淋巴細(xì)胞系和巨噬細(xì)胞系   中醫(yī)藥應(yīng)用天花粉具有悠久的歷史，TCS應(yīng)用于臨床引產(chǎn)和抗腫瘤也有多年的歷史，對其臨床應(yīng)用背景很清楚。研究發(fā)現(xiàn)，TCS可以用于抗絨癌及葡萄胎的治療7，并對多種腫瘤細(xì)胞有顯著的殺傷作用，是一種有前途的抗腫瘤藥物和免疫毒素彈頭1。本實驗室曾用MTT方法檢測發(fā)現(xiàn)，多種人的白血病和淋巴瘤細(xì)胞系細(xì)胞對TCS均十分敏感，TCS對T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來源的細(xì)胞系細(xì)胞有明顯的殺傷作用，而對人正常外周血淋巴細(xì)胞影響極小，這提示TCS可能對某些白血病細(xì)胞和淋巴瘤有

15、一定的治療價值4,隨后其他學(xué)者也對TCS殺傷白血病和淋巴瘤細(xì)胞作用進行了研究8，9。為了進一步探討TCS選擇性殺傷某些白血病和淋巴瘤細(xì)胞的機制，我們在本研究中檢測了TCS對7種不同來源的白血病和淋巴瘤細(xì)胞系的殺傷作用。結(jié)果表明TCS對T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞系的殺傷作用主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。在12.5  g/ml的藥物濃度下，TCS可以誘導(dǎo)40%以上的各種T淋巴細(xì)胞系細(xì)胞的凋亡和49.5%的U937細(xì)胞凋亡，而對B淋巴瘤細(xì)胞則影響較小，僅誘導(dǎo)15%左右的細(xì)胞凋亡，但TCS可以明顯地抑制B淋巴瘤細(xì)胞的生長，提示TCS可能通過其他的機制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。我們檢測了TCS對

16、Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，在12.5 g/ml的藥物濃度下，TCS可以將Raji細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期的S期，從而達到抑制細(xì)胞生長的作用。但在相同條件下，雖然TCS可以誘導(dǎo)較多的Jurkat細(xì)胞凋亡，但對其細(xì)胞周期卻無明顯影響。實驗結(jié)果提示TCS的抗腫瘤細(xì)胞的作用是與細(xì)胞類型相關(guān)的，并且針對不同類型的細(xì)胞有其不同的機制。   TCS可能通過與受體結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)信號途徑的激活或抑制，從而啟動細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；或者通過受體介導(dǎo)的方式進入胞質(zhì)溶膠，發(fā)揮其核糖體滅活蛋白的活性；或通過抑制蛋白質(zhì)的合成，引起細(xì)胞生長周期的阻滯，從而抑制細(xì)

17、胞的生長2，10，11。但這些僅僅是一些推論，而針對不同的細(xì)胞，其具體的作用機制并不十分清楚。我們的試驗結(jié)果證實，即使對于TCS敏感的細(xì)胞，其損傷的機制也不同，對于T淋巴細(xì)胞系和巨噬細(xì)胞來源的U937細(xì)胞系的細(xì)胞是通過誘導(dǎo)凋亡的方式進行殺傷，并且具有劑量依賴性，而對于B淋巴瘤細(xì)胞，雖然臺盼藍染色與凋亡檢測均未發(fā)現(xiàn)明顯的殺傷和誘導(dǎo)凋亡的作用，但我們的結(jié)果顯示TCS可以使Raji細(xì)胞阻滯在S期，從而達到抑制其生長的作用。此外，與通常的化療藥物對于腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞兩敗俱傷的殺傷作用相比，TCS可以選擇性的作用于白血病細(xì)胞，而對于人的正常外周血淋巴細(xì)胞的影響極小，這是其優(yōu)勢。  

18、 從天然動植物中尋找毒副作用小、安全有效的抗腫瘤藥物是極有前景的研究領(lǐng)域。TCS通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，提示其在抗腫瘤方面具有一定的應(yīng)用前景。因此，有必要深入對TCS抗腫瘤作用機理進行研究，為TCS的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供更有力的實驗依據(jù)。【參考文獻】  1汪猷.天花粉蛋白.第二版，北京:科學(xué)出版社，20002Shaw PC, Lee KM, Wong KB. Recent advances in trichosanthin, a ribosomeinactivating protein with multiple pharmacological

19、 properties. Toxicon, 2005; 45:683-6893Zheng YT, Chan WL, Chan P, et al. Enhancement of the antiherpetic effect of trichosanthin by acyclovir and interferon. FEBS Lett, 2001; 496: 139-1424Zheng YT, Zhang WF, Ben KL, et al. In vitro immunotoxicity and cytotoxicity of trichosanthin against human normal immunocytes and leukemialymphoma cells. Immunopharmacol Immunotoxicol, 1995;17:69-795Wang YY, Ouyang DY, Huang H, et al.