單細(xì)胞顯微切割術(shù)在霍奇金淋巴瘤中的應(yīng)用

1、    單細(xì)胞顯微切割術(shù)在霍奇金淋巴瘤中的應(yīng)用        摘要目的:應(yīng)用單細(xì)胞顯微切割技術(shù)分離和研究霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma,HL)瘤細(xì)胞,并檢測(cè)其是否存在人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染。方法:采用單細(xì)胞顯微切割技術(shù)從HL組織切片中獲得其瘤細(xì)胞Reed-Sternberg/Variant (RS/V)細(xì)胞，提取DNA后,利用PCR擴(kuò)增HCMV立即早期基因片段。結(jié)果:單細(xì)胞顯微切割可將RS/V細(xì)胞從

2、HL淋巴組織中獨(dú)立分離出來(lái)，收集切割的瘤細(xì)胞可獲得用于PCR擴(kuò)增的模板DNA，在13例HL石蠟組織切片中有4例經(jīng)PCR擴(kuò)增出149bp的目的片段。結(jié)論:單細(xì)胞顯微切割技術(shù)適用于HL瘤細(xì)胞研究;部分HL組織的RS/V細(xì)胞中存在HCMV感染。關(guān)鍵詞顯微切割； 霍奇金淋巴瘤； 巨細(xì)胞病毒感染； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中分類(lèi)號(hào)R733文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1001-7399（2000）04-0310-03Application of microdissection technique in the research of Hodgkin's lymphomaYan Qingguo, Huang Gaos

3、heng, Zhu Desheng, Wang Zhe(Dept of Pathol, Fourth Military Medical University, Xi'an710033)ABSTRACTPurposeTo isolate and study the neoplastic cells of Hodgkin's lymphoma by microdissection technique,and to make clear whether human cytomegalovirus exists in the neoplastic cells. MethodsMicro

4、dissection for getting Reed-Sternberg/Variant(RS/V) cells from sections of Hodgkin's lymphoma and PCR for amplificating fragments of immediately early gene in human cytomegalovirus were employed. ResultsRS/V cells can be separated from their surrounding cells in tissues of Hodgkin's lymphoma

5、 after microdissection,and template DNA can be extracted from the microdissected cells. Out of 13 cases of Hodgkin's lymphoma, the expected 149bp fragments of HCMV were detected by PCR in 4 cases. ConclusionMicrodissection technique can be used in analysis of neoplastic cells in Hodgkin's ly

6、mphoma. Human cytomegalovirus infection exists in RS/V cells in some cases of Hodgkin's lymphoma.KEY WORDSmicrodissection; Hodgkin's lymphoma; cytomegalovirus infections; polymerase chain reaction霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma,HL）是惡性淋巴瘤的一個(gè)獨(dú)特類(lèi)型,其腫瘤異質(zhì)性表現(xiàn)明顯,瘤組織成分多樣,特征性的瘤細(xì)胞(R-S細(xì)胞及其變異型)占細(xì)胞成分的1%以下,

7、且呈散在性分布,這為對(duì)其瘤細(xì)胞進(jìn)行分析帶來(lái)一定困難,特別是在常規(guī)PCR檢測(cè)中,從組織中提取的DNA或RNA模板包含了來(lái)自R-S細(xì)胞及其變異型瘤細(xì)胞和來(lái)自淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、組織細(xì)胞等多種非瘤細(xì)胞成分,其結(jié)果不能反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的狀況。近年來(lái)的研究表明,單細(xì)胞顯微切割技術(shù)可特異地將欲研究的目的細(xì)胞從其它細(xì)胞中分離出來(lái)用于進(jìn)一步分析。該方法特異性強(qiáng), 并可將形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法很好地結(jié)合起來(lái),特別適于腫瘤異質(zhì)性的相關(guān)研究,其應(yīng)用日益廣泛1。我們應(yīng)用此技術(shù)結(jié)合PCR方法在HL瘤細(xì)胞中進(jìn)行了人巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)。1材料與方法1.1材料1.1.1標(biāo)本13例HL患者淋巴結(jié)來(lái)自我校3個(gè)附

8、屬醫(yī)院病理科，淋巴結(jié)經(jīng)常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋，HE染色并經(jīng)病理診斷證實(shí)。其中混合細(xì)胞型8例，結(jié)節(jié)硬化型4例，淋巴細(xì)胞消減型1例。1.1.2主要設(shè)備日本Narishige液壓顯微操作系統(tǒng)（Narishige Co,LTD），日本Olympus普通光學(xué)顯微鏡，PE-2400擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)PE公司。1.1.3主要試劑Taq DNA Polymerase為加拿大Sangon公司產(chǎn)品，礦物油及蛋白酶K為Sigma公司產(chǎn)品。1.1.4引物PCR引物根據(jù)HCMV立即早期第四外顯子設(shè)計(jì)，上游引物：5'-GTACTGGGCAAAGACCTTCA-3'；下游引物：5'-TAAGTGAG

9、TTCTGTCGGGTG-3'。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149 bp。1.2方法1.2.1待切割組織片的制備經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋的組織塊依病理學(xué)常規(guī)方法制備7 m連續(xù)切片，貼于載玻片置烤片機(jī)上70烤2 h，依下列步驟處理后不封片用于顯微切割：二甲苯浸泡2次，5min/次，100%、95%、80%、70%乙醇及去離子水各2 min，10滴蘇木精染液1 min后置于去離子水洗，5滴返藍(lán)液（0.2% Na2CO3,0.04% Li2CO3）5 min后去離子水洗；10滴伊紅染液1 min后去離子水洗；甘油緩沖液（2.5% glycerol; 0.05 mol/L Tris/HCl,pH 8.

10、9;2 mmol/L EDTA;1 mmol/L NaCl）2 min后冷風(fēng)機(jī)吹干。1.2.2顯微切割根據(jù)Moskaluk等2介紹的方法并作部分改進(jìn)，將直徑0.5 mm的空心玻璃微管先用顯微操縱系統(tǒng)中的拉針器制成用于切割細(xì)胞和吸取細(xì)胞兩種類(lèi)型尖端大小不同的玻璃針，切割用針尖端約1 m，吸取用針尖端約10 m；將與顯微操縱機(jī)械手通過(guò)液壓相連的持針器固定于顯微鏡操作平臺(tái)，再將玻璃針固定于持針器，玻璃針尾部與充滿(mǎn)礦物油的摸針器相連。在顯微鏡下找到待切割細(xì)胞的視野后，滴加去離子水，在x、y、z軸3個(gè)方向上精巧控制顯微操縱機(jī)械手，用切割針將切割的細(xì)胞與周?chē)?xì)胞分割開(kāi)，使其游離聚集，再用吸取針吸取并吹打入

11、EP管中。1.2.3DNA提取將含切割的RS/V細(xì)胞的EP管12.000 g離心，每10個(gè)細(xì)胞加入5 l TK消化液（0.5% Tween 20,0.02%蛋白酶K），Vortex混勻后短暫離心，置55水浴過(guò)夜；再置100烤箱中烤10 min；Vortex混勻后短暫離心供PCR用。1.2.4PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定PCR反應(yīng)總體積為50 l，循環(huán)參數(shù)為：95 5 min;94 1 min,52.5 1.5 min,72 1.5 min,35個(gè)循環(huán)；72延伸10 min。在PCR反應(yīng)中設(shè)立用去離子水替代擴(kuò)增模板的陰性對(duì)照及用人HCMV立即早期基因?yàn)閿U(kuò)增模板的陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。2

12、結(jié)果通過(guò)顯微操縱系統(tǒng)精細(xì)控制下的單細(xì)胞顯微切割，可將R-S及其變異型細(xì)胞同周?chē)姆橇黾?xì)胞精確分離。13顯示了單個(gè)R-S細(xì)胞變異型陷窩細(xì)胞在顯微切割前后的狀況。在13例福爾馬林固定石蠟包埋的HL組織切片中，用顯微切割技術(shù)每例獲得1530個(gè)不等的單個(gè)R-S或其變異型細(xì)胞用于PCR擴(kuò)增，所收集細(xì)胞經(jīng)采用蛋白酶K消化，100 10 min滅活蛋白酶K后獲得的DNA模板行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果在13例中有4例擴(kuò)增出預(yù)期的149 bp片段，其中3例為混合細(xì)胞型，1例為結(jié)節(jié)硬化型，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照結(jié)果明確（4）。3討論顯微切割技術(shù)在生物學(xué)研究中的應(yīng)用經(jīng)歷了顯微組織切割、細(xì)胞群切割、單個(gè)細(xì)胞切

13、割、單細(xì)胞內(nèi)組分切割、染色體切割等階段，隨著技術(shù)方法的不斷改進(jìn)，顯微切割的區(qū)域不斷變小，而應(yīng)用的領(lǐng)域則不斷擴(kuò)大1。目前應(yīng)用最為廣泛的是旨在分離單個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞顯微切割，該技術(shù)具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它一方面可在細(xì)胞層次上使研究定位清楚，排除周?chē)渌?xì)胞在分析中的干擾，另一方面又可與分子克隆、PCR、免疫組織化學(xué)等多種分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究方法相結(jié)合，而且研究取材廣泛，培養(yǎng)細(xì)胞、常規(guī)制備的染色體、石蠟切片、冷凍切片、細(xì)胞鋪片等均可采用，因此其應(yīng)用十分廣泛。目前在新基因的發(fā)現(xiàn)、基因突變研究、染色體畸變、細(xì)胞局部病變病因?qū)W研究等多種領(lǐng)域均有研究應(yīng)用3,4。1陷窩細(xì)胞（）顯微切割前。×4002陷

14、窩細(xì)胞（）顯微切割中。×4003顯微切割后陷窩細(xì)胞被去除（）。×4004RS/V細(xì)胞顯微切割后HCMV的PCR檢測(cè)結(jié)果1：123 bp 梯度Marker; 2:陽(yáng)性對(duì)照；3：陰性對(duì)照； 416 ：13例檢測(cè)樣本，其中4、5、8、9擴(kuò)增出149 bp HCMV片段單細(xì)胞顯微切割的具體方式有多種,各具特色,不同實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)各自條件進(jìn)行選擇。Lee等1所報(bào)道的采用30G1/2注射用針替代需要專(zhuān)用拉絲設(shè)備制作的玻璃微針,再利用普通光學(xué)顯微鏡的微調(diào)旋鈕控制切割單個(gè)細(xì)胞,此方法簡(jiǎn)單易行、低耗,尤其適合基層，但切割精度的控制較低；采用液壓式顯微操縱系統(tǒng)配合倒置顯微鏡進(jìn)行顯微切割是很多實(shí)驗(yàn)

15、室常用的方法2。本研究即根據(jù)此方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)而來(lái)的，它可以利用一些實(shí)驗(yàn)室原有的顯微操作裝置,但不能自動(dòng)化,要收集較大量細(xì)胞時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)；激光捕獲式顯微切割是目前最為先進(jìn)的方法,它快速方便,可從大量的研究材料中迅速捕獲較多的目的細(xì)胞,自動(dòng)化程度高,但這需要昂貴的專(zhuān)用設(shè)備3。單細(xì)胞顯微切割用于基因組DNA分析所需的單個(gè)細(xì)胞數(shù)，依研究目的、切割組織的固定方式而有差異，Dietmaier等5比較了用流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞和用顯微切割從冰凍切片和石蠟切片上切割單個(gè)細(xì)胞用于突變分析所需的最少細(xì)胞數(shù)，結(jié)果冰凍切片與流式細(xì)胞儀相同，至少需要10個(gè)細(xì)胞，而石蠟切片一般需要30個(gè)細(xì)胞。因不同組織類(lèi)型的HL瘤細(xì)胞數(shù)差異較

16、大，本研究中每例獲得了1530個(gè)不等的單個(gè)瘤細(xì)胞用于PCR分析，其中4例PCR陽(yáng)性所獲細(xì)胞分別是18、25、26、28個(gè)；此外，切片厚度也是影響單細(xì)胞顯微切割分析的一個(gè)因素，在不影響形態(tài)觀(guān)察的前提下，作為顯微切割的組織切片越厚越好，本研究中我們?cè)? m的連續(xù)石蠟切片上進(jìn)行單細(xì)胞切割，獲取滿(mǎn)意結(jié)果。在HL的病因研究中，從瘤細(xì)胞中直接檢測(cè)出致病因子是十分重要的,最近我室利用PCR和原位雜交的方法直接檢測(cè)到在HL淋巴組織中存在HCMV的感染6。為進(jìn)一步明確瘤細(xì)胞中是否存在HCMV的感染,我們又采用單細(xì)胞顯微切割技術(shù)進(jìn)行了深入分析。從結(jié)果看,采用液壓式顯微操縱系統(tǒng)可以方便地將R-S及其變異型細(xì)胞與其它

17、非瘤細(xì)胞分離,切割下來(lái)的R-S及其變異型細(xì)胞用于PCR分析,在13例中有4例擴(kuò)增出預(yù)期的149 bp片段，其結(jié)果表明在HL瘤細(xì)胞中確實(shí)存在HCMV感染。綜上所述,單細(xì)胞顯微切割技術(shù)可從多種細(xì)胞類(lèi)型的組織中獲得單一的細(xì)胞類(lèi)型,用于針對(duì)該型細(xì)胞的特異性分子生物學(xué)分析,從而將形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合,已成為對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行研究的一個(gè)重要工具?；痦?xiàng)目：全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（No 98D046）和陜西省自然科學(xué)基金(No 98M38)資助課題作者簡(jiǎn)介：閆慶國(guó)，男，31歲，博士。研究方向：淋巴造血組織腫瘤閆慶國(guó)(第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室)黃高?(第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室)朱德生(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心， 西安7

18、10033)王哲(第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室)參考文獻(xiàn)1，Lee JY,Dong SM,Kim SY et al. A simple,precise and economical microdissection technique for analysis of genomic DNA from archival tissue sections. Virchows Arch, 1998;433(4):3053092，Moskaluk CA,Kern SE. Microdissection and polymerase chain reaction amplification of genomic DNA from histological tissu