雙歧桿菌脂磷壁酸延緩細胞衰老的作用機制

1、雙歧桿菌脂磷壁酸延緩細胞衰老的作用機制        【摘要】目的 探討雙歧桿菌脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）在延緩H2O2誘導(dǎo)細胞衰老中的作用。方法 H2O2誘導(dǎo)WI38細胞衰老，半乳糖苷酶細胞化學(xué)染色計算衰老細胞百分率變化，RTPCR和Western印跡檢測衰老細胞p21、細胞周期蛋白E（cyclin E）和周期蛋白依賴性蛋白激酶2（CDK2）表達水平的變化。結(jié)果 雙歧桿菌LTA處理后，半乳糖苷酶細胞化學(xué)染色陽性細胞百分率較衰老模型組降低（P0.01)。與年輕對照組相比，衰老模型組細胞中

2、p21的表達增高，cyclin E和CDK2表達降低，而雙歧桿菌LTA能夠逆轉(zhuǎn)上述變化（P0.01)。結(jié)論 雙歧桿菌能延緩H2O2誘導(dǎo)的細胞衰老,機制可能與改變p21，cyclin E和CDK2表達水平有關(guān)。 Effect and mechanism of lipoteichoic acid of Bifidobacterium on delaying cell aing PENG YanHua, WANG Yue, LIU JianLong, et al. Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics of Ministry of Educ

3、ation, Department of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China 【Abstract】 Objective To explore the effect of lipoteichoic acid (LTA) of Bifidobacterium on delaying cell aging induced by H2O2. Methods WI38 cell aging was induced by H2O2. galactosidase (gal) cytochemis

4、try staining was used to evaluate the percent of aging cell and the mRNA and protein levels of p21, cyclin E and CDK2 were detected by RTPCR and Western blot. Results Treatment with LTA（5, 10 g/ml）led to a significant increase in the proportion of galpositive cells (P0.01) and markedly decreased the

5、 mRNA and protein levels of p21 and increased the mRNA and protein levels of cyclin E and CDK2 in WI38 cells in aging model group (all P0.01). Conclusions LTA of Bifidobacterium can delay cell aging induced by H202, whose mechanism may have relation with change the expressions of p21, cyclin E and C

6、DK2. 【Key words】 Bifidobacterium; Lipoteichoic acid; Cellaging; H2O2 在體外，人胚肺二倍體成纖維細胞已成為經(jīng)典的復(fù)制性細胞衰老模型，而多種刺激物能誘導(dǎo)年輕細胞出現(xiàn)與復(fù)制性衰老相似的特征，被稱為應(yīng)激誘導(dǎo)早熟性老化(stressinduced premature senescence，SIPS)，其中H2O2是最常用的氧化應(yīng)激引發(fā)細胞SIPS誘導(dǎo)劑1，2。雙歧桿菌的表面分子脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)已被證實具有抗氧化的作用，能夠有效延緩衰老3，但其機制并不是很清楚。本研究用H2O2誘導(dǎo)人胚肺成纖維細胞W

7、I38出現(xiàn)SIPS,觀察雙歧桿菌LTA是否具有抗細胞衰老的作用，以及WI38細胞中p21、CDK2和cyclin E mRNA和蛋白表達水平的變化，探討雙歧桿菌LTA抗細胞衰老的細胞周期調(diào)控機制。 1 材料和方法 1.1 材料 雙歧桿菌LTA由本實驗室參考Sutcliffe法4從兩歧雙歧桿菌中提取，人胚肺成纖維細胞WI38細胞（20代）購于中國科學(xué)院細胞庫，胎牛血清和MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，H2O2購自Sigma公司；p21、CDK2、cyclin E和GAPDH引物序列由Invitrogen公司合成，RTPCR試劑盒購自Promega公司，p21、cyclin E單克隆抗體和CD

8、K2多克隆抗體購自北京中山公司，衰老特異性半乳糖苷酶原位染色試劑盒，購自上海杰美公司，Western印跡化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自美國KPL公司。 1.2 方法 1.2.1 細胞培養(yǎng) WI38細胞接種于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(另外加入2 mmol/L谷氨酰胺，1.0 mmol/L丙酮酸鈉，0.1 mmol/L非必需氨基酸)，置37，5% CO2條件下培養(yǎng)至2235代用于實驗。 1.2.2 細胞處理5和分組 模型組將細胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔2?05個細胞，待細胞長滿培養(yǎng)板的70左右（避免細胞匯合），加160 mol/L H2O2作用2 h，用無血清培養(yǎng)基清洗3次，再加入10%胎牛血清的培

9、養(yǎng)基培養(yǎng)72 h；雙歧桿菌LTA處理組在加160 mol/L H2O2同時分別加入5、10、20 g/ml LTA, 同時做年輕對照組。 1.2.3 半乳糖苷酶細胞化學(xué)染色 按照說明書操作，染成藍色的細胞為半乳糖苷酶染色陽性細胞,每組同時做4個復(fù)孔，每孔計數(shù)400個細胞，計算半乳糖苷酶染陽性百分率。 1.2.4 p21、cyclin E和CDK2 mRNA表達水平 逆轉(zhuǎn)錄參閱Promega RT說明書:2 g RNA0.5 g olig（dT）無RNAase水，終體積15 l，70 變性5 min，立即放進冰中冷卻，隨后在上述體系中加入MMLV 1 l，dNTP 1.25 l，RNAase 0

10、.6 l，MMLV 5緩沖液 5 l，加水至25 l，42 60 min，95 5 min，冰浴5 min。PCR的反應(yīng)體系：PCR緩沖液5 l,MgCl2 1.8 l,滅菌水19.4 l, Promega Taq酶0.2 l,上游引物1 l,下游引物1 l, dNTP 0.6 l,cDNA 2 l,共30 l。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：為94 3 min預(yù)變性；94 35 s，59     35 s(p21，cyclin E和CDK2), 61 30 s(GAPDH),72 45 s,32個循環(huán)；72 5 min；取PCR擴增產(chǎn)物5 l上樣于10

11、 g/L瓊脂糖電泳，在BioRad凝膠成像儀上觀察并保存結(jié)果,光密度分析。表1 引物序列及擴增產(chǎn)物大?。裕?1.2.5 p21、cyclin E和CDK2蛋白表達水平 處理后的細胞用預(yù)冷的細胞裂解液提取蛋白,用蛋白提取液樣品作SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉, 轉(zhuǎn)至PVDG膜，室溫下封閉2 h后，一抗(1200稀釋)4下孵育過夜，0.01 mol/L PBST洗滌5次，每次5 min，與二抗(11 000稀釋)室溫下孵育2 h，洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測，待條帶顯示清楚后終止反應(yīng)。結(jié)果用quantity one軟件分析。 1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以x眘表示，采用SPSS 12.0軟件分

12、析，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析。 2 結(jié) 果 2.1 雙歧桿菌LTA對H2O2誘導(dǎo)細胞衰老的影響 衰老模型組的半乳糖苷酶陽性細胞率(71%)明顯高于青年對照組(10%)和5 g/ml LTA處理組(21%)及10 g/ml LTA處理組(35%)(P0.01)，表明雙歧桿菌LTA能夠延緩由H2O2誘導(dǎo)的細胞衰老，但20 g/ml LTA處理組(69%)無明顯作用。見圖1。 2.2 雙歧桿菌LTA對WI38細胞中p21、cyclin E和CDK2 mRNA表達的影響 與年輕對照組比較，模型組WI38細胞的p21 mRNA表達顯著增加（P0.01），cyclin E和CDK2 mRNA表達明顯

13、下降（P0.01）；經(jīng)5 g/ml和10 g/ml雙歧桿菌LTA處理后，其細胞內(nèi)p21 mRNA表達較模型組明顯下降（P0.01），cyclin E和CDK2 mRNA表達較模型組明顯增高（P0.01），其中尤以5 g/ml LTA組變化最明顯。見表2、圖2。表2 雙歧桿菌LTA對WI38細胞中p21、cyclin E和CDK2 mRNA表達的影響(略) 2.3 雙歧桿菌LTA對H2O2誘導(dǎo)WI38細胞衰老過程中蛋白表達的影響 與年輕對照組比較，模型組WI38細胞的p21 蛋白表達顯著增加（P0.01），cyclin E和CDK2 蛋白表達明顯下降（P0.01）；經(jīng)5 g/ml和10 g/ml

14、雙歧桿菌LTA處理后，CDK2、p21 mRNA表達的影響 其細胞內(nèi)p21蛋白表達較模型組明顯下降（P0.01），cyclin E和CDK2 蛋白表達較模型組明顯增高（P0.01），其中尤以5 g/ml LTA組變化最明顯。見表3、圖3。表3 雙歧桿菌LTA對WI38細胞p21、Cyclin E、CDK2蛋白表達的影響(略) 3 討 論 氧化應(yīng)激是指機體活性氧的產(chǎn)生過多或(和)機體抗氧 化能力下降，活性氧(ROS)清除不足，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)增多并引起細胞氧化損傷的病理過程。ROS包括超氧陰離子(O2)、羥自由基(OH?、H2O2等。在體外,H2O2引發(fā)細胞氧化應(yīng)激損傷,誘導(dǎo)細胞衰老,是最常用的

15、誘導(dǎo)劑。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用亞致死量的160 mol/L H2O2處理WI38細胞可誘導(dǎo)細胞SIPS，其半乳糖苷酶細胞化學(xué)染色陽性細胞百分率較年輕對照組明顯增高,而用雙歧桿菌LTA處理后，半乳糖苷酶陽性細胞百分率較模型組明顯降低，其中尤以5 、10 g/ml雙歧桿菌LTA處理組降低最為明顯，而20 g/ml雙歧桿菌處理組無明顯變化，顯示出一定的濃度依賴性，表明雙歧桿菌LTA能延緩H2O2誘導(dǎo)的細胞衰老。 細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞在周期時相的變遷中進入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。細胞周期沿著G1期S期G2期M期的順序進行運轉(zhuǎn)。G1期是啟動細胞周期循環(huán)的關(guān)鍵，當細胞復(fù)制性衰老時，

16、生長停滯，主要分布在G1期。當細胞被誘導(dǎo)衰老時，也具有相同的特征。Gorbunova等6認為H2O2誘導(dǎo)的細胞衰老主要是由于DNA損傷引起。對DNA損傷所引起的反應(yīng)細胞阻滯于G1期。在整個G1期，細胞在不同時相受到各自周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依賴激酶(CDK)的凋節(jié)，其中cyclin E是調(diào)控細胞周期從G1期進入S期的關(guān)鍵。cyclin E首先激活CDK2，cyclin ECDK2的磷酸化活性使Rb磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促使DNA合成，導(dǎo)致細胞由G1期進入S期，進行有序的運轉(zhuǎn)。因此，提高cyclin E和CDK2的表達，可以促進細胞由G1期進入S期。而抑制CDK2的活性，也能阻

17、止細胞進入S期7。p21作為一個廣譜的CDK抑制劑和細胞周期的負調(diào)控因子，能抑制cyclin ECDK2的磷酸化活性，使細胞停滯在G1期，從而誘發(fā)細胞衰老的特征性改變8。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的WI38細胞出現(xiàn)SIPS，其細胞中p21表達明顯增加，cyclin E和CDK2表達顯著下降，而雙歧桿菌LTA能夠明顯逆轉(zhuǎn)上述細胞周期調(diào)節(jié)因子的變化，表明其可以通過增強細胞周期的正向調(diào)節(jié)并抑制細胞周期的負向調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮延緩細胞衰老的作用。 【參考文獻】 1 Toussaint O, Medrano EE, von Zglinicki T. Cellular and molecular mechan

18、isms of stressinduced premature senescence (SIPS) of human diploid fibroblasts and melanocytesJ. Exp Gerontol, 2000; 35(8):92745. 2 Duan J, Duan J, Zhang Z, et al. Irreversible cellular senescence induced by prolonged exposure to H2O2 involves DNAdamageandrepair genes and telomere shorteningJ. Int J Biochem Cell Biol，2005; 37(7):140