系膜增生性腎小球腎炎患兒Bax蛋白表達與外周血淋巴細胞凋亡的

1、系膜增生性腎小球腎炎患兒Bax蛋白表達與外周血淋巴細胞凋亡的關(guān)系         10-10-29 15:09:00     作者：趙彤,盧思廣    編輯：studa20【摘要】  目的 明確病理類型為系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)的原發(fā)性腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS) 患兒外周血淋巴細胞(peripheral

2、 blood lymphocytes，PBLs)Bax蛋白的表達與PBLs凋亡的關(guān)系。探討MsPGN-NS患兒糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)抵抗的部分機制。方法 所有患兒和正常兒童均于清晨空腹條件下采取靜脈血，以密度梯度離心法分離PBLs，所得細胞用植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)或PHA+1×10-6mol/L地塞米松(dexamethasone，Dex)處理，培養(yǎng)24 h和48 h后應(yīng)用流式細胞儀檢測Bax蛋白的表達及細胞凋亡率。 結(jié)果 MsPGN-NS患兒與正常兒童Dex組PBLs Bax蛋白表達量均顯著高于空白對照組(P<0.

3、01)，且呈時間依賴性(48 h>24 h)，但各時間點MsPGN-NS患兒Dex組Bax的表達均低于正常兒童相應(yīng)組(P<0.01);MsPGN-NS患兒與正常兒童Dex組PBLs凋亡率均高于空白對照組(P<0.01)，且呈時間依賴性(48 h>24 h)，但各時間點MsPGN-NS患兒Dex組細胞凋亡率均低于正常兒童組(P<0.01)。結(jié)論 MsPGN-NS患兒PBLs Bax蛋白表達水平與PBLs凋亡率呈明顯正相關(guān)，但其表達顯著低于正常對照組，提示Bax蛋白的低表達是導(dǎo)致MsPGN-NS患兒PBLs凋亡減少，進而造成GC抵抗的原因之一。 【關(guān)鍵詞】 

4、 系膜增生性腎小球腎炎;腎病綜合征;外周血淋巴細胞;Bax;凋亡)Abstract： Ojective To investigate the relationship between expression of Bax protein and apoptosis in peripheral blood lymphocytes (PBLs) in children with primary nephrotic syndrome (NS) with the pathology type of mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN), s

5、o to further explore the mechanism of glucocorticoid-resistance in children. Methods The PBLs in MsPGN-NS and normal children were isolated with Ficoll-Hypaque gradient centrifugation. Then they were treated with phytohemagglutinin (PHA) or PHA plus dexamethasone (Dex). At the 24th and 48th hour of

6、culture, the expression levels of Bax protein and apoptosis proportion were measured by flow cytometric analysis. Results The Bax protein levels in PBLs of Dex in the control group were much higher than those in both the MsPGN-NS group and normal children (P<0.01) in a time-dependence manner (48

7、h>24 h). However, at each time point the Bax protein levels of Dex group in MsPGN-NS children were all lower than those in normal children (P<0.01). The apoptosis proportions of PBLs remarkably increased after Dex treatment in both MsPGN-NS and normal children (P<0.01), also in a time-depen

8、dence manner. But at each time point the apoptosis proportions of Dex group in MsPGN-NS children were all lower than those in normal children (P<0.01). Conclusion In PBLs of MsPGN-NS children the expression of Bax protein has positive correlation with apoptosis proportions, but at a level signifi

9、cantly lower than in the normal control group. The low expression of Bax protein probably accounts for the decreasing apoptosis proportions of PBLs, which leads to glucocorticoid-resistance in children with MsPGN-NS.Key words：mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN); nephrotic syndrome; pe

10、ripheral blood lymphocytes (PBLs); Bax; apoptosis已換糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)是治療腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)的首選藥物，但臨床上部分NS患兒由于對GC抵抗，致使反復(fù)應(yīng)用GC和免疫抑制劑，從而出現(xiàn)很多藥物不良反應(yīng)和(或)并發(fā)癥，加重了原有的病理損害。因此NS患兒GC抵抗的原因一直是研究的熱點1-5。系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是兒童原發(fā)性NS較常見的病理類型之一，也是最常見的對GC不敏感的病理類型，臨床

11、治療較為困難。免疫功能紊亂可能在MsPGN患兒發(fā)病機制中起著重要作用。本實驗采用Bax蛋白表達及外周血淋巴細胞(PBLs)凋亡率來觀察系膜增生型NS中GC抵抗的可能機制。1 資料和方法1.1 研究對象 本實驗所選患者為門診隨訪和定期住院進行環(huán)磷酰胺沖擊治療(3個月和半年一次)的原發(fā)性NS患兒，他們均是初治時對GC不敏感，而行腎活檢術(shù)，病理類型證實為MsPGN,36例，其中男23例，女13例，平均年齡10.6歲，所有入選兒童近期無感染性疾病，部分患兒已停用GC 3個月以上或現(xiàn)口服強的松最大量為5 mg，隔日1次。正常兒童(無感染性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、外傷等)30例，男18例，女12例，平均年齡

12、11.6歲。于2004年8月2005年2月采血，檢測地塞米松(Dex)處理不同時間(24 h、48 h)后Bax蛋白表達水平與PBLs凋亡情況。1.2 試劑 小鼠抗人Bax單抗購自北京萊博生物技術(shù)研究所;Annexin/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司;RPMI1640、植物血凝素(PHA)、新生牛血清、地塞米松等均為北京華美生物工程公司進口分裝。1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱為美國UVP公司產(chǎn)品，流式細胞儀(FCM)由美國Calibur公司生產(chǎn)。1.4 方法1.4.1 淋巴細胞分離與培養(yǎng) 密度梯度離心法常規(guī)分離淋巴細胞，調(diào)備細胞數(shù)為1×109/L，用含10%小牛血清

13、和雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)基分組進行細胞培養(yǎng)。對照組為細胞懸液+PHA，處理組為細胞懸液+PHA+Dex，置37、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448 h。1.4.2 Bax蛋白表達的檢測 取PBS調(diào)備的濃度為1×109/L的細胞懸液1 ml，用4%多聚甲醛固定1520 min，1000 r/min離心10 min, 棄上清，沉淀用含0.1%Triton100和10%小牛血清的完全培養(yǎng)基洗滌1次，條件為1000 r/min離心10 min，而后加入Bax單抗(濃度均為1100)100 l，混勻后室溫放置30 min，完全培養(yǎng)基洗滌2次，加入FITC-山羊抗鼠IgG(濃度為11

14、00)100 l，混勻后室溫避光放置30 min，完全培養(yǎng)基洗滌2次;沉淀用完全培養(yǎng)基0.5 ml重懸，送流式細胞儀檢測。1.4.3 淋巴細胞凋亡的檢測 取PBS調(diào)備的濃度為1×109/L的細胞懸液1 ml,1 000r/min、4離心10 min，棄上清，加入1 ml冷的PBS，輕輕震蕩，使細胞懸浮，1000 r/min、4離心10 min，棄上清，再用冷PBS洗滌2次;將細胞重懸于200 l結(jié)合緩沖液，加入10 l Annexin-FITC和5 l PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min、4反應(yīng)30 min，加入300 l結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)上機檢測。1.5 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)

15、據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，Bax蛋白表達水平以及凋亡率均以±s表示，兩組之間的比較用t檢驗，Bax蛋白表達量與凋亡率之間的關(guān)系應(yīng)用相關(guān)分析，P<0.05為有顯著性差異。2 結(jié) 果2.1 MsPGN-NS患兒與正常兒童PBLs Bax蛋白的表達 MsPGN-NS患兒與正常兒童空白對照組PBLs經(jīng)體外培養(yǎng)24和48 h后Bax的表達有所升高，Dex組Bax的表達則顯著增加(48 h>24 h);Dex組各時間點Bax蛋白的表達均顯著高于空白對照組(P<0.01);MsPGN-NS患兒空白對照組Bax蛋白的表達與正常兒童相比無明顯差異(P>0.05)，

16、而Dex組Bax蛋白的表達則顯著低于正常兒童(P<0.01)。見表1。2.2 MsPGN-NS患兒與正常兒童PBLs凋亡率 MsPGN-NS患兒與正常兒童空白對照組PBLs經(jīng)體外培養(yǎng)24和48 h后凋亡率有所升高，Dex組凋亡率則顯著增加(P<0.01)，并與處理時間呈正相關(guān)(48 h>24 h);Dex組各時間點凋亡率均顯著高于空白對照組(P<0.01);MsPGN-NS患兒空白對照組24 h凋亡率略低于正常兒童,但無明顯差異(P>0.05)，而48 h凋亡率明顯低于正常兒童(P<0.05);Dex組凋亡率則顯著低于正常兒童(P<0.01)。見表2。表1 腎病綜合征患兒與正常兒童淋巴細胞Bax蛋白表達的比較(±s,%)地塞米松作用時間腎病綜合征患兒組(n=36)對照組Dex組 正常兒