王艾平, 粟永萍, 程天民, 鄒仲敏, 王軍平 - 人α防御

1、生 物 工 程 學 報 Chin J Biotech 2008, February 25; 24(2: 291-296 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb © 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved Received : April 26, 2007; Accepted: July 3, 2007Supported by: Sci & Tech Research Foundation of PLA “Eleventh

2、 Five-Year Plan” (No. 06G076, the National Natural Science Foundation of China (No. 30771892, and Academician Fund of Chongqing City (No. CSTC, 2007AB5022.Corresponding author: Junping Wang. Tel: +86-23- 68752883; E-mail: wangjunp軍隊“十一五”科技功關(guān)項目 (No. 06G076、國家自然科學基金 (No. 30771892和重慶市院士基金 (No. CSTC, 20

3、07AB5022資助。人 防御素 5在大腸桿菌中的可溶性表達與純化研究王艾平, 粟永萍, 程天民, 鄒仲敏, 王軍平第三軍醫(yī)大學軍事預(yù)防醫(yī)學院全軍復(fù)合傷研究所 , 創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室 , 重慶 400038摘 要 : 采用 PCR 擴增大腸桿菌偏好的人防御素 5成熟肽 (mHD-5密碼子序列 , 并將其克隆至 pMAL-p2x 質(zhì)粒 , 構(gòu)建 pMAL-p2x-mHD-5表達載體 , 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL 21(DE3, 誘導(dǎo)表達 , SDS-PAGE分析目的蛋白表達量并優(yōu)化表達條件。 經(jīng) 親和層析、酶切和離子交換層析等方法分離、純化重組 mHD-5(rmHD-5多肽。采用濁度法測

4、定 rmHD-5對細菌的抑制 活性。通過優(yōu)化表達條件 , 獲得約 30%的可溶性目的蛋白表達量 , 并成功純化 rmHD-5。 rmHD-5對大腸桿菌標準菌株 (ATCC25922具有較強的抑制活性 , 在終濃度為 62.5g/mL時 , 90%以上的細胞被抑制。結(jié)果表明采用可溶性融合表達 策略 , 在原核表達系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達并純化具有生物活性的防御素是可行的途徑之一。 關(guān)鍵詞 : 防御素 , 原核表達 , 純化 , 生物活性Soluble Expression and Purification of Human Alpha- Defensin-5 in Escherichia coliAipi

5、ng Wang, Yongping Su, Tianmin Cheng, Zhongmin Zou, and Junping WangInstitute of Combined Injury of the People s Liberation of Army; National Key Laboratory of Trauma, Burn and Combined Injury, Third Military Medical University, Chonqqing 400038, ChinaAbstract : DNA fragment containing human alpha-de

6、fensin 5 mature peptide (mHD-5 coding sequence with biased codons of E.coli was amplified by PCR, which was subsequently cloned into the plasmid pMAL-p2x in order to create pMAL-p2x-mHD-5 ex-pression vector. The plasmid pMAL-p2x-mHD-5 was transferred into engineered strain BL21(DE 3 to express heter

7、ogeneous fusion protein (MBP-mHD-5. The soluble MBP-mHD-5 targeted protein inducible expressed by IPTG was accounted for about 30% under optimized conditions. The recombinant mHD-5 (rmHD-5 peptide was successfully purified through a separation process including affinity chromatography, Fac tor Xa di

8、gestion and ion exchange chromatography. The bioactivity of rmHD-5 was examined by bacte-ria-inhibition tests in liquid culture. The growth of E. coli ATCC25922 was dramatically suppressed with an inhibition rate of 90%, with the presence of 62.5g/mL rmHD-5 in the media. These results indicate that

9、the strategy of soluble expression of fusion protein in E. coli can be a useful and practical way to produce bioactive defensins. Keywords : defensin, prokaryotic expression, purify, bioactivity細菌、真菌、昆蟲、植物、鳥類、哺乳動物包 括人等各種生物均產(chǎn)生具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)等生物活性的小肽 , 統(tǒng)稱為抗菌肽或肽抗生素?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 近千種抗菌肽 , 其中動物和高等植物細胞產(chǎn)生的抗292 ISSN1000-3

10、061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2008 Vol.24 No.2J菌肽又稱為防御素 1。 迄今為止 , 相繼發(fā)現(xiàn)了 6種人 防御素 (HNP1-4, HD-5, HD-6和 6種人防御素 (HBD1-6。人 防御素 5成熟肽 (mHD-5是由 32個 氨基酸殘基組成 , 分子量為 3.58 kD的陽離子多肽 , 含保守的 6個半胱氨酸殘基 , 構(gòu)成 3個分子內(nèi)二硫 鍵 , 形成穩(wěn)定的肽鏈折疊 , 并進而形成具有 3條-折疊片組成的兩歧性分子。研究發(fā)現(xiàn) , HD-5除在小 腸潘氏細胞中大量分泌表達外 ; 在生殖道上皮細 胞、鼻粘膜和部分正常

11、支氣管粘膜等細胞中也存在 固有表達 , 還可因炎癥、感染和細胞惡性轉(zhuǎn)化等因 素的刺激而表達、分泌上調(diào) 2,3。由此可見 , mHD-5在消化道、生殖道等粘膜內(nèi)源性感染預(yù)防和免疫保 護調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。研究表明 , 化學合成、 從粘膜組織提取或哺乳動物細胞表達的 mHD-5不 僅具有高效的廣譜抑 /殺病原細菌和參與免疫保護 調(diào)節(jié)作用活性 4, 而且具有阻止 HIV 、 HSV 等病毒 粘 附 進 入 細 胞 和 抑 制 病 毒 顆 粒 復(fù) 制 的 抗 病 毒 作 用57。在細菌耐藥已經(jīng)成為全球性醫(yī)學難題的今天 , mHD-5展 現(xiàn) 了 作 為 新 型 抗 病 原 微 生 物 藥 物 的 前

12、景。鑒于 mHD-5因富含精氨酸和半胱氨酸導(dǎo)致化 學合成困難 , 復(fù)性效率低 , 成本高的現(xiàn)狀 , 本研究 率先構(gòu)建 mHD-5與 MBP 融合表達載體 , 屏蔽了防 御素對宿主菌的毒性 , 實現(xiàn)了可溶性高表達 , 并探 索了多肽的純化工藝 , 為 mHD-5的開發(fā)奠定了 基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 質(zhì)粒、菌株與主要試劑pMAL-p2x 質(zhì)粒、 Xmn 、 Fsp 、 Hin d 內(nèi)切 酶、 Amyloses 樹脂和 Factor a 購自 NEB 公司 ; CM Sepharose FF 購自 GE 公司 ; 寡聚 DNA 單鏈訂購于 上海生物工程公司 ; Pyrobest DNA Poly

13、merase 、 T4 DNA Ligase 購自 TaKaRa 公司 ; DH5、 BL 21(DE 3 、 ATCC 25922和 ATCC 25923菌株由本所保存。1.2 寡聚 DNA 單鏈的設(shè)計根據(jù)大腸桿菌密碼子使用偏好優(yōu)化人源 HD-5成熟肽基因序列 , 設(shè)計一對寡脫氧核苷酸序列。 P1的 5 端引入 Fsp 酶切位點 , P2的 5 端引入 Hin d 酶切位點。序列分別為 : P1: 5 -CGGATCTGCGCA ACCTGCTATTGCCGTACCGGCCGTTGCGCGACCCGTGAAAGCCTGAGCGGCGTGT-3 ; P2: 5 -CCCA-AGCTTTCATT

14、AGCGACAGCACAGACGATACAGA CGGCCGCTAATTTCGCACACGCCGCTCAGGC-3 。1.3 mHD-5密碼子優(yōu)化序列的克隆利用 P1和 P2即用作引物又作為模板進行 PCR 擴增 , 產(chǎn)物長度為 120 bp(含引物兩端的酶切位點和 保護堿基 。反應(yīng)條件 : 94 30 s 50 30 s 72 15 s, 共 25個循環(huán) , 然后 72延伸 2 min后終止反應(yīng)。1.4 pMAL-p2x-mHD-5表達質(zhì)粒的構(gòu)建 (圖 1 將 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳后 , 切下目的 條帶并純化回收 , 用 Fsp 和 Hin d 雙酶切 (37 , 8 h后再凝

15、膠電泳回收目的片段。 將 pMAL-p2x 質(zhì)粒 用 Xmn 和 Hin d 雙酶切 (37 , 4 h后凝膠回收大 片段。 回收 mHD-5目的片段和線性化 pMAL-p2x 載 體 , 按 4: 1比例 , 在 T4 DNA連接酶作用下反應(yīng) (16 , 16 h, 然后電轉(zhuǎn)化至 E. coli DH5菌株 , Amp抗性篩 選陽性重組子 , 陽性菌落擴增后提取質(zhì)粒 , Bgl 和 Hin d 雙酶切初步鑒定 , 并委托上海生物工程公司 測序。序列正確的重組子質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至表達宿主菌 BL 21(DE 3 。1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)與表達形式鑒定取重組工程菌過夜培養(yǎng)液 40 L 轉(zhuǎn)種于 2 mL

16、 TB 培養(yǎng)基 (Amp終濃度為 100 g/mL, 37培養(yǎng)至 OD 600 0.6時 , 加入終濃度 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo) 5 h, 超聲破胞后取離心上清和沉淀 , SDS-PAGE鑒定表 達形式 , 使用蛋白定量試劑盒測定并計算表達量。1.6 目的蛋白可溶性表達條件優(yōu)化與純化分別在 37、 30、 25、 15和或 1、 0.5 mmol/L IPTG條件下采用 1.5方法誘導(dǎo)表達 , 取上清 電泳確定可溶性高表達條件。在優(yōu)化條件下 , 采用 溶菌酶法裂解誘導(dǎo)表達重組菌 , 收集含目的蛋白的 PB(20 mmol/L, pH 7.2緩沖液上清。 對蛋白溶液行 Q Sephero

17、se FF層析后再進行 Amyloses 親和層析 , 收 集洗脫峰 , 電泳鑒定。1.7 融合蛋白裂解與目的肽純化參考說明書 , 用 Factor a 裂解融合蛋白。 裂解 蛋白液過 SP 陽離子層析柱 , 收集分離峰并電泳鑒 定。 用截留分子量為 1.5 kD的透析帶在 ddH 2O 中將 目的肽溶液透析過夜 , 凍干。1.8 重組 mHD-5 (rmHD-5抑菌活性測定選用文獻 4中的方法略做改進 , 即將在 MHB 培養(yǎng)液中過夜生長細菌用緩沖液 (10 mmol/L PB,王艾平等 : 人 防御素 5在大腸桿菌中的可溶性表達與純化研究293 JpH7.2 稀釋至 1×1065

18、×106 cfu/mL, 與溶于含 0.01%醋酸 PB 緩沖液中的不同濃度 rmHD-5等體積 混勻后于 37培養(yǎng) 3 h, 取 10 L 涂于 MHB 平板繼 續(xù)培養(yǎng) 14 h后計算菌落數(shù)以判斷抑菌活性。采用酶 標儀測定倍比稀釋的 rmHD-5在 96孔細胞培養(yǎng)板中的細菌濁度 , 計算 rmHD-5對 ATCC 25922和 ATCC 25923 2種標準菌株的抑菌效果。1.9 統(tǒng)計學處理采用統(tǒng)計軟件 SPSS 10.0進行 t 檢驗和分析。 實 驗獨立重復(fù) 3次以減少實驗誤差。圖 1 pMAL-p2x-mHD-5構(gòu)建示意圖Fig. 1 Construction of pMAL-

19、p2x-mHD-5 vector2 結(jié)果2.1 mHD -5序列克隆用設(shè)計的 2條寡脫氧核苷酸單鏈經(jīng) PCR 擴增 , 瓊脂糖凝膠電泳見約 120 bp處有 1條清晰帶 , 與預(yù) 計大小相符 (圖 2 。2.2 pMAL-p2x-mHD-5重組質(zhì)粒酶切鑒定提取的可疑質(zhì)粒用 Bgl / Hin d 雙酶切 , 在0.7%瓊脂糖凝膠電泳中見到約 6 kb和 900 bp兩條帶 , 陽 性 重 組 子 酶 切 出 的 小 片 段 明 顯 比 空 質(zhì) 粒 酶 切圖 2 PCR 擴增 mHD-5Fig. 2 mHD-5 was amplified by PCR294 ISSN1000-3061 CN11

20、-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2008 Vol.24 No.2 J出的小片段約大 60 bp, 與理論計算值 64 bp相符 (圖 3 。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒序列與設(shè)計完全一致 , mHD-5閱讀框正確插入表達載體。圖 3 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig. 3 Digestion of pMAL-p2x-mHD-5 and pMAL-p2xM: DNA marker; 1, 2, 4, 5: digested 4 clones ofpMAL-p2x-mHD-5 by Bgl / Hin d ; 3: digested pMAL-p2x byBgl / Hin

21、d 2.3 重組蛋白表達條件優(yōu)化與目的肽純化從溫度、 IPTG 濃度和培養(yǎng)基成分 3個因素優(yōu)化 目的蛋白的表達量。圖 4顯示 , 將轉(zhuǎn)化含有正確重 組質(zhì)粒 pMAL-p2x-mHD-5的 BL 21(DE3 單克隆工程 菌在 TB 培養(yǎng)基中 37培養(yǎng) 17 h后 , 稀釋 50倍擴繁 4 h, 然后加終濃度為 1 mmol/L的 IPTG 在 25條件 下誘導(dǎo) 20 h獲得了約 31%的可溶性表達量 (圖 5泳道 4 。破胞后的表達上清先經(jīng)陰離子和親和層析純化 獲得純度大于 95%的重組融合蛋白 (圖 5泳道 3 。 融 合蛋白經(jīng) Fac tor a 裂解釋放出承載分子和小肽 , 裂 解效率接

22、近 100%(圖 5泳道 2 。裂解液經(jīng)強陽離子 交 換 層 析 , 收 集 洗 脫 峰 (圖 6 , 經(jīng) 透 析 脫 鹽 和圖 4 不同表達條件下可溶性融合蛋白的表達量Fig. 4 Expression level of soluble fusion protein underdifferent conditions圖 5 重組蛋白 /多肽 SDS-PAGE 鑒定Fig. 5 Identification of recombinant protein and peptideby SDS-PAGEM: protein marker; 1: purified rmHD-5; 2: digeste

23、d fusion protein;3: fusion targeted protein; 4: expression supernatant圖 6 融合蛋白裂解體系中目的肽的陽離子 (SP交換層析純化曲線Fig. 6 Cation (SP exchange chromatograph curve of pu-rifying rmHD-5 in digested fusion protein solution冷凍干燥 , 獲得最終產(chǎn)品 rmHD-5肽 (圖 5泳道 1 。 rmHD-5凍干產(chǎn)品的平均產(chǎn)率為 2.34 mg/L菌液。2.4 rmHD-5活性鑒定采 用 平 板 法 測 定 rmHD-

24、5對 大 腸 埃 希 氏 菌 (ATCC 25922和金黃色葡萄球菌 (ATCC 259232種 標準菌株的抗菌活性 , 結(jié)果顯示純化所得 rmHD-5對 ATCC 25922具有較強的抑 /殺能力 , 對 ATCC 25923的抑制作用相對較弱。采用液體培養(yǎng)法測定 了該產(chǎn)品對 2種菌株的抑制能力 , 考察了從 1.95 g/mL至 500 g/mL的終濃度范圍 , 經(jīng) 8 h培養(yǎng)后 , 測定 OD 600值。 結(jié)果 (圖 7 表明 , rmHD-5在終濃度為62.5 g/mL至 125 g/mL時可抑制 90%以上 ATCC 25922細胞的生長 ; 在終濃度為 500 g/mL時 , 約

25、50% 的 ATCC 25923細胞受到抑制。王艾平等 : 人 防御素 5在大腸桿菌中的可溶性表達與純化研究295 J圖 7 抗菌活性測定曲線Fig.7 Antimicrobial activity curve of rmHD-53 討論越來越多抵抗傳統(tǒng)抗生素的耐藥致病菌株的出現(xiàn)已成為當前醫(yī)學的一大難題。具有不易誘導(dǎo)產(chǎn)生 耐藥菌株的獨特抑 /殺微生物機制的抗菌肽 , 不僅能 直接殺滅細菌、真菌、原蟲和病毒等多種致病微生 物 , 并且具有多靶向性和多作用途經(jīng)的免疫保護促 進作用 , 因此可能成為新一代抗微生物藥物 8。 當前 , 研究開發(fā)抗菌肽的主要任務(wù)仍然是尋求低成本獲得 高活性抗菌肽的工藝。

26、為此目的 , 本課題組以具有 高效抑 /殺細菌和抗病毒活性的人防御素 5為模式 分子開展了相關(guān)的研究。為了屏蔽抗菌肽自身對表達宿主菌的毒性作用 和防止防御素因分子小易被蛋白酶所降解 , 本研究 選用融合表達的策略 , 為成功表達奠定了基礎(chǔ)。 mal E 基因源于細菌本身 , 其蛋白 (MBP具有良好的 可溶性 , 故有利于提高融合靶蛋白的溶解性 ; 并且 MBP 是良好的分子伴侶 , 有利于外源基因表達產(chǎn)物 的穩(wěn)定與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運 ; 另外 , MBP屬于帶負電荷較多 的蛋白 , 可能會產(chǎn)生中和防御素正電荷的作用 , 因 而避免了表達的大量帶正電荷的防御素多肽與宿主 核酸相互作用引起的宿主細胞毒性和

27、降低防御素表 達量的現(xiàn)象 10; 同時 , 含 MBP 的融合蛋白可利用已 商業(yè)化的麥芽糖樹脂進行親和層析純化 ; 因此 mal E 基因可能是防御素融合表達的合適承載分子。研究 選用 pMAL-p2x 作為表達載體 , 其不僅含有可作為 承載分子的 mal E 基因 , 并且具有 MBP 蛋白的信號 肽序列 , 可將在胞質(zhì)中翻譯的融合蛋白分泌到能將 巰基氧化為二硫鍵的周質(zhì)環(huán)境中 , 這有助于防御素 空間折疊的形成 , 避免了防御素因缺乏二級結(jié)構(gòu)導(dǎo) 致活性降低的可能。設(shè)計中 , 作者選用生物活性最強的 mHD-5剪切體序列 , 并應(yīng)用密碼子使用偏好原 則選用了有利于大腸桿菌高效表達的密碼子 ,

28、 同時 選用了合適的核酸限制性內(nèi)切酶和切割位點剛好位 于識別序列之后的 Fac tor a 作為融合蛋白的裂解 酶 , 成功構(gòu)建可獲得 mHD-5天然序列的重組載體。 為獲得具有生物活性的 rmHD-5創(chuàng)造了條件?？咕牡母咝П磉_已有成功的報道 9, 但多數(shù) 情況下目的蛋白是以包涵體的形式出現(xiàn)。目的蛋白 形成了包涵體不僅給下游純化帶來了困難 , 并且復(fù) 雜而又低效的復(fù)性過程阻礙了獲得具有正確折疊和 高效生物活性重組防御素的效率。研究中 , 作者優(yōu) 化了表達條件 , 選用合適的表達溫度、 IPTG 濃度和 營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基 , 成功獲得了可溶性的高效表 達。小分子肽的純化工藝也是防御素研發(fā)急需解

29、決 的問題 , 作者分析了目的融合蛋白的生化特性并利 用承載分子 malE 的親和特性 , 將誘導(dǎo)后的破菌上清 先后經(jīng)過陰離子交換層析和親和層析獲得了純度大 于 95%的融合蛋白液。 利用 mHD-5具有較高的等電 點 (pI =8.58, 在 pH 6.8的 PB 緩沖體系中帶正電荷 , 應(yīng) 用 強 陽 離 子 交 換 層 析 , 將 其 從 含 雜 蛋 白 MBP(pI =5.12的裂解融合蛋白體系中的分離出來 , 同 時 去 掉 了 極 微 量 的 Fac tor a(pI =5.09。 將 經(jīng) UV214在線監(jiān)測洗脫峰收集液進行透析脫鹽和冷凍 干燥等精制過程 , 成功獲得 rmHD-5

30、凍干粉。 活性測 定結(jié)果顯示 rmHD-5對 G -菌 ATCC 25922具有較強 的抑 /殺作用 , 對 G +菌 ATCC 25923的抑制作用較 弱。與文獻 4報道的人工合成并經(jīng)復(fù)性的 mHD-5活性比較 , rmHD-5的活性略微偏低。可能原因是獲 得的 rmHD-5尚未經(jīng)反相層析精細純化 , 純度不如 人工合成肽 ; 另外 , 重組基因大量而又快速地表達 時 , 部分蛋白未能形成正確的空間結(jié)構(gòu)也可能是 rmHD-5生物活性降低的原因。 rmHD-5具有對細菌 的抑 /殺活性可能機理是其帶有的大量正電荷與帶 負電荷的細菌胞膜相互作用從而破壞了生物膜的結(jié) 構(gòu)與功能 11, 12。研究結(jié)

31、果表明采用可溶性的融合表達策略 , 從 原核表達系統(tǒng)獲得具有生物活性的陽離子抗菌肽是 防御素研發(fā)的有效途徑之一。REFERENCES1 Seebah S, Suresh A, Zhuo S, et al. Defensins knowledgebase:296 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2008 Vol.24 No.2 2 3 4 5 6 7 a manually curated database and information source focused on the defensins family of

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