微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技能培訓(xùn)

1、第一部分 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技能培訓(xùn)第一次實(shí)驗(yàn)（4學(xué)時(shí)，2人/組）緒 言介紹本課程的教學(xué)大綱、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)、實(shí)驗(yàn)要求和考核方法；介紹本學(xué)期微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的內(nèi)容安排和時(shí)間安排。介紹微生物實(shí)驗(yàn)室須知事項(xiàng)，注意生物安全、水電防火安全等。介紹實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告與實(shí)驗(yàn)報(bào)告的統(tǒng)一格式和要求。實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告：標(biāo)題目的要求原理實(shí)驗(yàn)器材操作步驟（含注意事項(xiàng)）預(yù)期結(jié)果實(shí)驗(yàn)報(bào)告：標(biāo)題實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)程序與操作要點(diǎn)結(jié)果討論與體會(huì)思考題考核：評(píng)分比例：平時(shí)考核占60%，期末考核占40%。平時(shí)考核內(nèi)容包括預(yù)習(xí)報(bào)告、實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)報(bào)告（各占20%， 40%， 40%。）平時(shí)考核登記 A+：95，A：90，B+：85，B：80，C+：75

2、，C：70，D+：65，D：60，E：50實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制與無(wú)菌器材的準(zhǔn)備（9月27日）一、目的要求1、明確培養(yǎng)基的配制原理。2、通過(guò)對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。3、了解滅菌的常用方法及應(yīng)用對(duì)象。4、學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌鍋的操作方法及注意事項(xiàng)。5、學(xué)習(xí)干熱滅菌的操作技術(shù)。6、了解分離培養(yǎng)微生物前的有關(guān)準(zhǔn)備工作。二、基本原理培養(yǎng)基是人工配制的適合于不同微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，它是進(jìn)行科學(xué)研究，生產(chǎn)微生物制品及應(yīng)用等方面的基礎(chǔ)。由于各類(lèi)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測(cè)需要不同，因而培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，要根據(jù)培養(yǎng)目的和檢測(cè)需要不同，選擇配制不同的培養(yǎng)基。高

3、壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。適用于一般培養(yǎng)基、玻璃器皿、無(wú)菌水、金屬用具。一般培養(yǎng)基在1213滅菌20分鐘即可。干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌

4、所需溫度高（160170），時(shí)間長(zhǎng)（12小時(shí)）。但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)烤焦，甚至引起燃燒，因而一般塑料制品不能用干熱滅菌。三、實(shí)驗(yàn)器材1、試劑牛肉膏、蛋白胨，氯化鈉，瓊脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl等。2、儀器和其他用具試管，三角瓶，燒杯，量筒，培養(yǎng)皿，玻棒，涂布棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，藥勺，高壓蒸汽滅菌鍋，pH計(jì)，pH試紙等。四、實(shí)驗(yàn)操作步驟（一）、培養(yǎng)基的配制稱(chēng)量 -熔化- 調(diào)pH -過(guò)濾-分裝 - 加塞 - 包扎標(biāo)記 - 滅菌 - 擱置斜面或倒平板 - 無(wú)菌檢查配方：牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，氯化鈉5.0g，水1000ml，

5、pH7.4-7.6。固體培養(yǎng)基一般加瓊脂15-20g。1、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的制備（以每組300ml計(jì)）（1）稱(chēng)量：除瓊脂外，按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱(chēng)取藥品，放入搪瓷杯中。蛋白胨極易吸水，稱(chēng)量時(shí)動(dòng)作要快。（2）熔化：量取蒸餾水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒攪拌，待藥品溶解后，加入瓊脂，倒入余下的水，在電熱板上加熱熔化。加熱過(guò)程所蒸發(fā)的水分，應(yīng)在全部原料溶解后加水補(bǔ)足。（3）調(diào)pH：待培養(yǎng)基稍冷卻后，用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH邊滴加邊攪拌，使之達(dá)到pH7.4-7.6。若偏堿，則用1mol/L HCl調(diào)節(jié)。（4）過(guò)濾：趁熱過(guò)濾。如無(wú)

6、特殊要求，可省略。（5）分裝：用分裝裝置將培養(yǎng)基裝入試管，高度為試管總長(zhǎng)的1/5，每組分裝6支試管。余下培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入三角瓶中，培養(yǎng)基的量為三角瓶容量的1/3-1/2。在漏斗下口處套有一段透明膠管，膠管下部用彈簧夾夾緊。分裝時(shí)，一手捏松彈簧夾，使培養(yǎng)基流出，另一只手握住幾支試管或錐形瓶，依次接取培養(yǎng)基。分裝時(shí)，注意不要使培養(yǎng)基粘附管口或瓶口，以免浸濕棉塞引起雜菌污染。（6）加塞：試管加棉花塞（或泡沫塑料塞、試管帽），三角瓶加棉塞或泡沫塑料塞。棉塞應(yīng)采用普通新鮮、干燥的棉花制作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞無(wú)法使用。制作棉塞時(shí)，要根據(jù)棉塞大小將棉花鋪展成適當(dāng)厚度，揪取手掌心大小一塊，鋪在左手

7、拇指與食指圈成的圓孔中，用右手食指插入棉花中部，同時(shí)左手食指與拇指稍稍緊握，就會(huì)形成1個(gè)長(zhǎng)棒形的棉塞。棉塞做成后，應(yīng)迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應(yīng)緊貼內(nèi)壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺折侵入。棉塞不要過(guò)緊過(guò)松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落為合適。棉塞的長(zhǎng)度不小于管口直徑的2倍，棉塞的2/3應(yīng)在管內(nèi)或瓶?jī)?nèi)，上端露出少許棉花便于拔取。（7）包扎標(biāo)記：6支試管扎成一捆，棉塞外加一層牛皮紙防滅菌時(shí)冷凝水濕潤(rùn)棉塞，在外用繩扎成活結(jié)。三角瓶棉塞外加蓋牛皮紙，用繩扎成活結(jié)。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、班級(jí)、組別、配制日期。（8）滅菌：0.1MPa，121，20min高壓蒸汽滅菌。見(jiàn)實(shí)驗(yàn)流程（三）。（9）擱置斜

8、面：待已滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50左右，將試管口端擱置在有合適高度的器具上，使培養(yǎng)基斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半為宜。（10）倒平板：待三角瓶中培養(yǎng)基冷卻至50左右，倒平板。備用。（11）無(wú)菌檢查：滅菌培養(yǎng)基放入37培養(yǎng)箱中24-48小時(shí)，若無(wú)細(xì)菌污染則說(shuō)明滅菌徹底。2、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的制備（600-800ml/班，由2組同學(xué)或教師完成）老師代按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱(chēng)取藥品，除瓊脂外，方法同固體培養(yǎng)基的制備過(guò)程。各組需完成：用分裝裝置將培養(yǎng)液分裝到試管中，高度為試管長(zhǎng)度的1/4。每組6支試管，自行分裝、包扎、滅菌。（二）、準(zhǔn)備無(wú)菌器材1、培養(yǎng)皿：洗凈的培養(yǎng)皿烘干后，每組將10-12

9、套培養(yǎng)皿疊在一起，用牢固的紙卷成一筒，然后進(jìn)行滅菌。2、移液管：洗凈、烘干后的吸管，在吸口的一頭塞入少許脫脂棉花，以防在使用時(shí)造成污染。塞入的棉花量要適宜，多余的棉花可用酒精燈火焰燒掉。每支吸管用一條寬約45cm的紙條，以3050的角度螺旋形卷起來(lái)，吸管的尖端在頭部，另一端用剩余的紙條打成一結(jié)，以防散開(kāi)，標(biāo)上容量，若干支吸管包扎成一束進(jìn)行滅菌。每組1ml移液管5-6支、10ml移液管1支3、試管和三角瓶：試管和三角瓶都需要做合適的棉塞。每組捆扎加塞試管4-5支，每組用三角燒瓶裝入不超過(guò)三角瓶容積1/2的去離子水。4、玻璃涂布棒：1支用報(bào)紙包好。上述物品用記號(hào)筆注明班級(jí)、組別、日期。（三）、滅菌

10、操作步驟1、高壓蒸汽滅菌（1）關(guān)好排水閥門(mén)，放入蒸餾水至標(biāo)度。注意水量一定要加足，否則容易造成事故。（2）將須要滅菌的器材、培養(yǎng)基等裝入滅菌鍋中，加蓋密封。旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度（不要太緊），然后再旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到徹底滅菌的目的。（3）通電加溫，打開(kāi)排氣閥門(mén)，排盡鍋內(nèi)的空氣。全自動(dòng)高壓鍋應(yīng)關(guān)閉排氣閥，（4）恒溫滅菌: 0.1MPa 或15磅壓力（鍋內(nèi)溫度相當(dāng)于120121）保持2030分鐘。（5）降溫：自然降溫，當(dāng)鍋內(nèi)蒸汽完全排盡時(shí)即壓力表指針降到零時(shí)，才能打開(kāi)排氣閥。（6）取出滅菌物品：如培養(yǎng)基需制備固體斜面培養(yǎng)基時(shí)，則應(yīng)趁熱將試管斜

11、放在桌上。培養(yǎng)基、無(wú)菌水等：濕熱滅菌。2、干熱滅菌（1）將包扎好的玻璃器皿擺入電熱烘箱中，相互間要留有一定的空隙，以便空氣流通。（2）關(guān)緊箱門(mén)，打開(kāi)排氣孔，接上電源。（3）待箱內(nèi)空氣排出到一定程度時(shí)，關(guān)閉上排氣孔，加熱至滅菌溫度后，固定溫度進(jìn)行滅菌：150170滅菌1.52h。2小時(shí)后切斷電源。（4）待烘箱內(nèi)溫度自然降溫冷卻到60以下后，再開(kāi)門(mén)取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。 放入烘箱加熱滅菌：150170滅菌1.52h。 玻璃器皿：可選擇干熱滅菌或濕熱滅菌五、注意事項(xiàng)1、培養(yǎng)基的配制加熱熔化過(guò)程中，要不斷攪拌，以免瓊脂或其它固體物質(zhì)粘在燒杯底上燒焦。加熱過(guò)程中所蒸發(fā)的水

12、分應(yīng)補(bǔ)足； pH值必須按不同培養(yǎng)基要求準(zhǔn)確測(cè)定；所有器皿要清潔，忌用鋼質(zhì)、鐵質(zhì)器皿；分裝培養(yǎng)基時(shí)，注意不使培養(yǎng)基沾在瓶口或管壁上端以免浸濕棉塞，引起雜菌污染；培養(yǎng)基滅菌的時(shí)間和溫度，需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以達(dá)到滅菌效果且不損害必要營(yíng)養(yǎng)成分；滅菌后的培養(yǎng)基須放37溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)方可使用。2、滅菌使用滅菌鍋應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行，避免發(fā)生事故，如鍋內(nèi)應(yīng)加足水份，以防干燒；滅菌時(shí)，操作者切勿擅自離開(kāi)；務(wù)必待壓力下降到零后，才可打開(kāi)鍋蓋。干熱滅菌時(shí)電烘箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與電烘箱內(nèi)壁的鐵板接觸，以防包裝紙烤焦起火。待烘箱內(nèi)溫度自然降溫

13、冷卻到60以下后，再開(kāi)門(mén)取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。六、思考題1、培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底？2、高壓蒸汽滅菌開(kāi)始前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降至0時(shí)才能打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取物？七、講授重點(diǎn)1、培養(yǎng)基種類(lèi)、配制培養(yǎng)基的基本原理與方法。2、高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌的原理和規(guī)范操作流程。八、實(shí)驗(yàn)要求每組需完成制作棉塞、配制培養(yǎng)基、準(zhǔn)備無(wú)菌器材九、考核點(diǎn)操作是否規(guī)范、迅速第二次實(shí)驗(yàn)（4學(xué)時(shí)，1人/組）實(shí)驗(yàn)二 微生物的分離、接種及環(huán)境微生物的檢測(cè)（9月28日）一、目的要求1、體會(huì)無(wú)菌操作技術(shù)在微生物研究中的重要性。2、證

14、實(shí)環(huán)境中存在微生物。3、掌握倒平板的方法。4、學(xué)習(xí)微生物接種的基本技術(shù)。5、學(xué)習(xí)分離微生物的常用方法。二、基本原理高溫對(duì)微生物具有致死效應(yīng)，在微生物接種時(shí)，一般在酒精燈旁進(jìn)行，用火焰直接灼燒接種環(huán)，以達(dá)到滅菌的目的。自然界中各種微生物混雜生活在一起，即使取很少量的樣品也是許多微生物共存的群體，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物的分離與純化。平板分離法常用的有：稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法與平板劃線(xiàn)法。不同的微生物在固體、半固體和液體培養(yǎng)基中能表現(xiàn)出各自特有的培養(yǎng)特征，這些特征可以作為不同種類(lèi)微生物的鑒別特

15、征之一。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培養(yǎng)物。2、培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基。3、儀器和其他用具接種環(huán)、酒精燈、試管架、記號(hào)筆、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、微生物接種技術(shù)（1）試管斜面接種法（用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種）：標(biāo)記：用記號(hào)筆對(duì)待接試管斜面培養(yǎng)基進(jìn)行標(biāo)記，寫(xiě)上待接菌種名稱(chēng)、接種日期、組別。取菌：左手拿大腸桿菌試管斜面培養(yǎng)物，右手持接種環(huán)，將接種環(huán)在火焰上進(jìn)行灼燒滅菌，然后在火焰旁用右手小指指和無(wú)名指或右手掌緣拔出并夾住試管棉塞

16、，試管口在火焰上燒一下。接種環(huán)輕輕插入斜面上半部，在管壁冷卻水上或管壁上使接種環(huán)冷后，挑起少許菌苔，再燒一下試管口，塞上棉塞，左手把斜面試管放回試管架。右手持有菌接種環(huán)在酒精燈旁無(wú)菌區(qū)。接種：左手從試管架上取出標(biāo)記好的斜面試管一支，右手掌緣拔出棉塞，試管口在酒精燈上灼燒一下，沾有菌苔的接種環(huán)迅速放進(jìn)斜面底部，從下到上劃一直線(xiàn)，然后再?gòu)牡撞块_(kāi)始向上作蛇形劃線(xiàn)接種。完畢后，燒一下試管口，塞上棉塞，接種環(huán)在火焰上灼燒后放回原處。培養(yǎng)：試管放37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-36小時(shí)。（2）液體培養(yǎng)基接種法：接種流程同（1）。接種時(shí)略有不同，即將挑有菌苔的接種環(huán)在液體表面的管內(nèi)壁上輕輕摩擦，使菌體分散從環(huán)上脫開(kāi)，

17、進(jìn)入液體培養(yǎng)基中。輕輕搖勻培養(yǎng)液。2、平板分離技術(shù)（1）稀釋涂布平板法：倒平板：滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基冷卻到55左右，搖勻。解開(kāi)麻繩，去掉三角瓶口上的牛皮紙和紗布，右手持裝培養(yǎng)基的三角瓶在酒燈旁，瓶口對(duì)著火焰。左手持9cm無(wú)菌培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰旁打開(kāi)一條縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，平置于桌面上，使培養(yǎng)基均勻分布于皿底，待冷凝后即為平板。菌液稀釋?zhuān)喝?支無(wú)菌試管，每管加9 ml無(wú)菌水，無(wú)菌操作取1ml大腸桿菌菌液至9ml無(wú)菌水中混勻，依次進(jìn)行10倍稀釋。涂布：取0.1ml稀釋菌液入平板中，用無(wú)菌涂布棒在培養(yǎng)基表面涂布均勻。培養(yǎng)：合上皿蓋，倒置培養(yǎng)皿于37培養(yǎng)24-36

18、小時(shí)。挑菌落：挑取單個(gè)菌落的菌苔少許，涂在載玻片上進(jìn)行顯微鏡個(gè)體形態(tài)觀察，結(jié)合菌落形態(tài)特征綜合分析。若不純，需再用平板分離法進(jìn)行純化。（2）平板劃線(xiàn)法：倒平板、培養(yǎng)和挑單菌落同A。劃線(xiàn)：左手拿平板，右手拿接種環(huán)在火焰上滅菌后沾取菌液或菌苔一環(huán)，在平板上劃平行線(xiàn)三條，接種環(huán)在火焰上滅菌，左手轉(zhuǎn)動(dòng)平皿約70度，用無(wú)菌接種環(huán)通過(guò)第一次劃線(xiàn)的末端作為起點(diǎn)作二次劃線(xiàn)，依次作第三次、第四次劃線(xiàn)（平行線(xiàn)劃線(xiàn)法）。或?qū)⑻羧∮芯慕臃N環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線(xiàn)。3、環(huán)境微生物的檢驗(yàn)將1個(gè)牛肉膏蛋白胨平板放在當(dāng)時(shí)做實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基暴露在空氣中，將另一牛肉膏蛋白胨瓊脂平板放在無(wú)菌室或無(wú)人走動(dòng)的其

19、他實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋。10min后蓋上兩個(gè)皿蓋。五、注意事項(xiàng)1、無(wú)菌技術(shù)手和臺(tái)面要消毒；無(wú)菌操作需在火焰旁進(jìn)行，手不可觸摸試管口端，以防燙傷；接種時(shí)接種環(huán)不要碰觸試管口邊，防止污染；棉塞不可放在桌面上，應(yīng)該用右手手緣或右手指間夾住。2、平板分離技術(shù)倒平板時(shí)，培養(yǎng)皿邊緣不要沾染培養(yǎng)基，搖勻培養(yǎng)基時(shí)要輕，以防培養(yǎng)液濺到皿蓋或溢出培養(yǎng)皿；劃線(xiàn)接種時(shí)，動(dòng)作要輕，注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基；分離、接種時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按無(wú)菌操作要求進(jìn)行；平板培養(yǎng)微生物時(shí)要倒置培養(yǎng)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、記錄液體培養(yǎng)基和固體斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。2、記錄菌種分離培養(yǎng)的結(jié)果。七、思考題1、平板培養(yǎng)時(shí)為什么要把培養(yǎng)皿倒置？2、在劃線(xiàn)分離時(shí)，為

20、什么每次都需要將接種環(huán)上的剩余物燒掉？八、講授重點(diǎn)1、倒平板2、微生物轉(zhuǎn)接方法3、平板劃線(xiàn)法和涂布平板法九、實(shí)驗(yàn)要求每位學(xué)生練習(xí)倒平板、液體試管接種、斜面接種、平板劃線(xiàn)和涂布平板。十、考核點(diǎn)1、無(wú)菌操作是否規(guī)范2、平板劃線(xiàn)方法是否正確實(shí)驗(yàn)三 顯微鏡的基本知識(shí)及使用方法附：數(shù)碼顯微鏡的使用 一、目的要求1、掌握普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。2、學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理、使用方法、維護(hù)的基本知識(shí)。 3、掌握利用顯微鏡觀察不同微生物的基本技能。4、學(xué)習(xí)顯微數(shù)碼系統(tǒng)的使用方法。 5、了解微生物在顯微鏡下的基本形態(tài)特征。二、基本原理現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像，故又常被稱(chēng)為復(fù)

21、式顯微鏡。它們由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成，在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率，而在普通光學(xué)顯微鏡通常配制的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最高，但需要在載波片與鏡頭之間加滴鏡油，主要是為了增加照明亮度和提高顯微鏡的分辨率。物鏡放大倍數(shù)越大，焦距越短，直徑更小，所需光強(qiáng)越大。從承載標(biāo)本的玻片透過(guò)來(lái)的光線(xiàn)，因介質(zhì)密度不同，會(huì)發(fā)生折射或全反射使光線(xiàn)不能進(jìn)入鏡頭。結(jié)果導(dǎo)致物像不清。在油鏡和玻片間滴加與玻璃折射率（空氣是1.55，香柏油是1.52）相近的鏡油，使光線(xiàn)不會(huì)造成太大的損失。顯微鏡分辯率是顯微鏡能辨別兩點(diǎn)之間的最小距離的能力，最小距離越小，分辨率越高。分辯率=

22、/2NA=/2n·sin（/2） 公式中可見(jiàn)光波長(zhǎng)，平均為0.55m，n折射率(香柏油1.52，空氣1.0，水1.33)，NA是物鏡的數(shù)值孔徑，取決于物鏡的鏡口角和玻片與鏡頭間介質(zhì)的折射率。三、實(shí)驗(yàn)器材1、標(biāo)本片：霉菌標(biāo)本片、細(xì)菌（枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis等）的標(biāo)本片（2片/組）。2、溶液和試劑：香柏油、乙醇乙醚混合液或二甲苯等（各一瓶/組）。3、儀器或其他用具：普通光學(xué)顯微鏡（1臺(tái)/組）、擦鏡紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）顯微鏡操作演示與錄相1、觀察前準(zhǔn)備：鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣約10cm，光源調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)目鏡、調(diào)節(jié)聚光器數(shù)值孔徑值。2、顯微鏡觀察：（1）低倍鏡觀察（2）高倍

23、鏡觀察（3）油鏡觀察一種方法是先低倍再高倍再油鏡，使用微調(diào)節(jié)器聚焦。第二種方法是在低倍下找到樣品區(qū)，用粗調(diào)節(jié)器升高鏡筒，將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置，在樣品區(qū)滴加鏡油后，從側(cè)面注視用粗調(diào)節(jié)器小心降下鏡筒，并使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接，調(diào)節(jié)聚光器的數(shù)值孔徑及視野照明亮度后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，再用細(xì)調(diào)節(jié)器使聚焦清晰為止。后一種方法盡量不用，在實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)介紹和使用第一種方法。3、 顯微鏡用畢后的處理：上升鏡筒，取下載玻片；擦凈鏡油；清潔物鏡及目鏡；還原各部件，降下聚光鏡。（二）Motic顯微數(shù)碼系統(tǒng)的使用 演示與錄相建文件夾： 例如 D:2008-2009學(xué)年環(huán)境0511班姓名圖片要求： 1）格

24、式：JPG2）文件名：例如 環(huán)境0511班 姓名 大腸桿菌1000倍五、注意事項(xiàng)1、顯微鏡是精密儀器，在取放時(shí)要一手托住底座，一手握住鏡臂，忌用單手拎提。2、養(yǎng)成雙目觀察的習(xí)慣，忌單眼觀察。3、觀察時(shí)可摘下近視鏡或遠(yuǎn)視鏡，因顯微鏡具有聚焦校正功能。若在觀察時(shí)配載眼鏡，應(yīng)防止眼鏡鏡片與目鏡鏡片接觸，以免造成鏡片劃痕。4、顯微鏡照明亮度的調(diào)節(jié)，可通過(guò)升降聚光器或改變光源亮度進(jìn)行調(diào)節(jié)，一般情況下聚光器都是調(diào)到最高位置。只要能獲得良好的觀察效果，也可以通過(guò)對(duì)虹彩光圈、聚光器高度、照明光源強(qiáng)度的協(xié)同調(diào)節(jié)靈活運(yùn)用。5、使用粗節(jié)器聚焦物像時(shí)，必須養(yǎng)成的習(xí)慣是：先從側(cè)面注視并小心調(diào)節(jié)物鏡靠近標(biāo)本，然后用目鏡觀

25、察，慢慢調(diào)節(jié)物鏡離開(kāi)標(biāo)本。否則可能因誤操作而損壞鏡頭及玻片。6、一般情況下，可利用同焦現(xiàn)象，對(duì)在低倍鏡下看到的物像，可以轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器將其他物鏡轉(zhuǎn)到工作位置，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器對(duì)物像進(jìn)行清晰聚焦，可以避免因使用粗調(diào)節(jié)器時(shí)可能發(fā)生的誤操作而損害鏡頭或玻片。7、使用乙醇乙醚混和物或二甲苯等清潔劑時(shí)，不要過(guò)量使用或讓其在鏡頭上停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因清潔劑對(duì)鏡頭會(huì)造成損害。不能用手或?yàn)V紙擦鏡頭，以免污染鏡頭或產(chǎn)生劃痕。8注意區(qū)分待觀察樣品與使用時(shí)間較長(zhǎng)的顯微鏡鏡頭上的霉點(diǎn)等污物。9每人在D盤(pán)上建一個(gè)文件夾，文件夾名與文件名的要求。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果低倍、高倍、油鏡下觀察微生物形態(tài)圖七、思考題1、用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些

26、問(wèn)題？ 2、在載玻片和鏡頭之間滴加香柏油有什么作用？八、講授重點(diǎn)1、 顯微鏡結(jié)構(gòu)2、油鏡工作原理3、如何使用雙目清晰觀察物像4、聚光器數(shù)值孔徑的調(diào)節(jié)5、利用物鏡的同焦現(xiàn)象，如何配合使用低倍鏡、高倍鏡和油鏡分別在不同物鏡下獲得清晰圖像。6、使用注意事項(xiàng)，特別是油鏡。7、數(shù)碼顯微鏡系統(tǒng)軟件的使用。九、實(shí)驗(yàn)要求1、練習(xí)使用顯微鏡，每位同學(xué)至少觀察微生物的2個(gè)標(biāo)本片（低倍、高倍物鏡下觀察霉菌，在低倍、高倍物鏡、油鏡下觀察細(xì)菌），每一類(lèi)型的微生物至少觀察一個(gè)標(biāo)本片。2、用數(shù)碼顯微系統(tǒng)分別拍攝所觀察到的微生物形態(tài)圖，提交2張圖片（高倍物鏡下觀察霉菌和油鏡下觀察細(xì)菌）。3、制成圖版打印黑白圖片，并標(biāo)注菌種名

27、稱(chēng)、觀察物鏡及總放大倍數(shù)。十、考核點(diǎn)操作是否規(guī)范熟練以及油鏡下的物像清晰度第三次實(shí)驗(yàn)（4學(xué)時(shí)，1人/組）微生物標(biāo)本的制備與染色實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法一、目的要求1、學(xué)習(xí)并掌握微生物制片及簡(jiǎn)單染色的基本技術(shù)。2、學(xué)習(xí)無(wú)菌操作技術(shù)。3、進(jìn)一步熟練掌握顯微鏡油鏡的使用技術(shù)。4、初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的形態(tài)特征。二、基本原理細(xì)菌制片常采用涂片法，通過(guò)涂沫能使細(xì)菌細(xì)胞個(gè)體均勻分散在載玻片上，有利于觀察個(gè)體形態(tài)。加熱固定使細(xì)胞質(zhì)凝固，使細(xì)胞固定在載玻片上，能殺死大多數(shù)細(xì)菌但不會(huì)破壞細(xì)胞形態(tài)。微生物染色的基本原理是借助物理和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素：細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透和吸附作用等?；瘜W(xué)因素

28、：主要是正負(fù)離子之間的相互吸引。染色劑按染料電離后所在地帶電荷的性質(zhì)分為幾種類(lèi)型：酸性染料（如酸性復(fù)紅，剛果紅，伊紅和苯胺黑等）、堿性染料（堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭等，細(xì)菌易被這種染料染色）、中性（復(fù)合）染性（伊紅，美蘭，Gimsa染料）。簡(jiǎn)單染色法是利用單一染料（如呂氏美藍(lán)、堿性品紅）對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，堿性染料電離時(shí)的染色部分帶正電荷，因此，堿性染料的染色部分容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。在顯微鏡下因與背景有明顯對(duì)比而易于識(shí)別。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：大腸桿菌（Escherichia

29、coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）斜面培養(yǎng)物。2、 染色劑：堿性美藍(lán)染液，石炭酸復(fù)紅染液。3、儀器或其他用具：顯微鏡，酒精燈，載玻片，鑷子、接種環(huán)、載玻片夾子、濾紙等。四、實(shí)驗(yàn)步驟涂片- 干燥 - 固定 染色 水洗 干燥 - 鏡檢1、涂片：取干凈載玻片，用記號(hào)筆做好標(biāo)記，滴一滴生理鹽水于載玻片中央；用接種環(huán)無(wú)菌操作分別挑取適量菌苔，沾有菌苔的接種環(huán)在載玻片上的生理鹽水中涂抹，使菌懸液在載玻片上形成均勻薄膜（如果用液體培養(yǎng)物，則用接種環(huán)蘸取1-2環(huán)菌液直接涂沫于載玻片上）。2、干燥：自然風(fēng)干或用電吹風(fēng)干燥。3

30、、固定：細(xì)菌涂面朝上，通過(guò)火焰2-3次。4、染色：載玻片平放于桌面或載玻片支架上，滴加染液使之覆蓋菌膜，一般染色1-2分鐘。5、水洗：傾去染液，用自來(lái)水沖洗，水流宜緩，否則易沖掉細(xì)菌涂膜，至洗出的水無(wú)色為止。6、干燥：用吸水紙吸去多余水分，自然風(fēng)干。7、鏡檢：制好的樣片在顯微鏡下觀察并記錄。五、注意事項(xiàng)1、涂片時(shí)取菌量要適量，且要求涂布均勻。2、無(wú)菌操作取菌時(shí)一定要等接種環(huán)冷卻后再取菌，以免高溫使菌體變形。3、涂片需干燥后再加熱固定，避免加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起細(xì)胞易破裂或變形，以至載玻片破裂。加熱固定時(shí)要用載玻片夾子或鑷子，以免燙傷。4、使用染料時(shí)注意避免沾到衣物和實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果低倍、高倍

31、、油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)圖七、思考題 在進(jìn)行細(xì)菌涂片時(shí)應(yīng)注意哪些環(huán)節(jié)？為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察？八、講授重點(diǎn)1、 細(xì)菌簡(jiǎn)單染色的原理。2、 無(wú)菌操作與細(xì)菌涂片操作要點(diǎn)。3、 染色劑的類(lèi)型與常用種類(lèi)。4、 顯微鏡的使用。九、實(shí)驗(yàn)要求每位學(xué)生至少用一種染色劑對(duì)一株菌進(jìn)行染色、觀察、拍照。提交1張?jiān)谟顽R下觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖，標(biāo)明菌種名稱(chēng)和總放大倍數(shù)。十、考核點(diǎn)涂片質(zhì)量與油鏡下圖像的清晰度實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌革蘭氏染色法一、目的要求1、 了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類(lèi)鑒定中的重要性。2、 掌握革蘭氏染色法操作技術(shù)。二、基本原理革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性和陰性，是由這兩類(lèi)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和

32、組成不同決定的，當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類(lèi)細(xì)菌的脫色效果是不同的，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類(lèi)脂質(zhì)含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，通透性降低，從而使結(jié)晶紫碘復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類(lèi)脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類(lèi)脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易洗脫出來(lái)，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。革蘭氏染色是細(xì)菌分類(lèi)的重要依據(jù)之一。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），大腸桿菌（

33、Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Saphylococcus aureus）等細(xì)菌16-18h斜面培養(yǎng)物。2、 染色劑：石炭酸復(fù)紅染液，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈氏碘液，95%乙醇。3、儀器或其他用具：顯微鏡，酒精燈，載玻片，鑷子、接種環(huán)、載玻片夾子、濾紙等。四、實(shí)驗(yàn)步驟制片 - 初染 - 媒染 - 脫色- 復(fù)染 - 鏡檢 1、制片：與細(xì)菌簡(jiǎn)單染色法的涂片、干燥和固定過(guò)程相同。2、初染：滴加結(jié)晶紫染色液于菌膜上1-2分鐘，流水沖洗。3、媒染：盧戈氏碘液沖洗一下菌膜，再滴加該液于菌膜上，靜置1分鐘。4、脫色：95%酒精沖洗至無(wú)色后，再水洗。5、復(fù)染：番紅染色液覆蓋菌膜，靜置2分鐘后

34、水洗，干燥。6、鏡檢：顯微鏡觀察。7、三區(qū)涂片染色：在熟悉上述革蘭氏染色過(guò)程后，在同一載玻片上分別用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（或金黃色葡萄球菌）單獨(dú)涂片及二者的混合涂片，染色、鏡檢比較觀察。五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)三、四中的注意事項(xiàng)同樣適用于本實(shí)驗(yàn)。2、選取活躍生長(zhǎng)期菌種、涂片厚度適宜、脫色程度適當(dāng)，能避免產(chǎn)生假性革蘭氏染色結(jié)果。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、拍攝油鏡下觀察到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌與大腸桿菌的單菌涂片及混合涂片的革蘭氏染色菌體圖。2、將實(shí)驗(yàn)結(jié)果填于表3-1。表3-1 革蘭氏染色結(jié)果記錄表菌名菌體顏色細(xì)菌形態(tài)結(jié)果（G+、G-）七、思考題1、哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？

35、其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？2、現(xiàn)有一株未知桿菌，個(gè)體明顯大于大腸桿菌，請(qǐng)你鑒定該菌是革蘭氏陽(yáng)性還是陰性，如何確定你的染色結(jié)果的正確性？ 八、講授重點(diǎn)1、 細(xì)菌革蘭氏染色的原理。2、 革蘭氏染色操作要點(diǎn)和結(jié)果判斷。九、實(shí)驗(yàn)要求每位同學(xué)完成2個(gè)單菌涂片及1個(gè)三區(qū)涂片，進(jìn)行染色、觀察、拍照。記錄革蘭氏染色結(jié)果。提交3張?jiān)谟顽R下觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖，標(biāo)明菌種名稱(chēng)和總放大倍數(shù)。十、考核點(diǎn)1、無(wú)菌操作是否規(guī)范2、染色過(guò)程操作是否規(guī)范3、顯微鏡操作是否熟練實(shí)驗(yàn)六 細(xì)菌芽孢染色法一、目的要求1、學(xué)習(xí)并掌握芽孢染色法的原理和技術(shù)，了解芽孢的形態(tài)特征。2、鞏固顯微鏡操作方法。二、基本原理芽孢是某些細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段在

36、菌體內(nèi)形成的休眠體，通常是圓形或橢圓形。細(xì)菌能否形成芽孢及芽孢的形狀、在芽孢囊內(nèi)的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鑒定細(xì)菌的依據(jù)之一。因芽孢壁厚、透性低、不易著色，但一旦著色也很難脫去。當(dāng)用著色力強(qiáng)的染色劑（如孔雀綠、石炭酸復(fù)紅）在加熱條件下染色時(shí)，染料可進(jìn)入菌體和芽孢內(nèi)，但菌體內(nèi)的染料經(jīng)水洗可脫掉，芽孢內(nèi)的染料依然存在呈色。用對(duì)比度大的復(fù)染劑染色時(shí)，芽孢保留初染劑的顏色，菌體和芽孢囊呈現(xiàn)復(fù)染劑的顏色。三、實(shí)驗(yàn)器材1、 菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）48h斜面培養(yǎng)物。2、 染色劑：石炭酸復(fù)紅染液，5%孔雀綠水溶液。3、儀器或其他用具：顯微鏡，酒精燈，載玻片，鑷子、接種環(huán)、

37、載玻片夾子、濾紙等。四、實(shí)驗(yàn)步驟Schaeffer-Fulton氏染色法：1、制片：涂片、干燥、固定。2、染色：5%孔雀綠滴在涂片上，夾子夾住玻片一端，在微火上加熱至染料冒蒸氣開(kāi)始計(jì)時(shí)5分鐘。3、水洗：待玻片冷卻后用流水沖洗至流出的水為無(wú)色。4、復(fù)染：番紅染液復(fù)染2分鐘，水洗，干燥。5、鏡檢五、注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)三、四的注意事項(xiàng)適用于本實(shí)驗(yàn)。2、選取適當(dāng)菌齡的菌種進(jìn)行芽孢染色，幼齡菌尚未產(chǎn)生芽孢，老齡菌芽孢囊已破裂，不易獲得正確染色結(jié)果。3、加熱時(shí)間和溫度要適宜，否則芽胞不易著色或溫度過(guò)高導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂。4、在將孔雀石綠染液加熱時(shí)切不可蒸干。5、脫色時(shí)必須等玻璃片冷卻后再進(jìn)行，否則冷水沖洗

38、易導(dǎo)致玻片破裂。6、注意安全，謹(jǐn)防燙傷和使用酒精燈時(shí)可能引發(fā)的火災(zāi)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察、拍攝并說(shuō)明枯草芽孢桿菌的形態(tài)特征。七、思考題為什么芽孢染色需要進(jìn)行加熱？能否用簡(jiǎn)單染色法觀察到細(xì)菌芽孢？八、講授重點(diǎn)1、芽孢染色原理和Schaeffer-Fulton氏染色方法。2、細(xì)菌芽孢的形態(tài)。九、實(shí)驗(yàn)要求每位同學(xué)完成1個(gè)芽孢染色標(biāo)本片，進(jìn)行觀察、拍照。記錄染色結(jié)果。提交1張?jiān)谟顽R下觀察到的細(xì)菌形態(tài)圖，標(biāo)明菌種名稱(chēng)和總放大倍數(shù)。十、考核點(diǎn)1、染色結(jié)果是否正確2、涂片質(zhì)量3、顯微鏡操作是否熟練第四次實(shí)驗(yàn)（4學(xué)時(shí)，1人/組）微生物個(gè)體形態(tài)和群體形態(tài)觀察（P69-76）實(shí)驗(yàn)七 放線(xiàn)菌個(gè)體形態(tài)和菌落形態(tài)觀察一、目

39、的要求1、學(xué)習(xí)并掌握放線(xiàn)菌幾種制片方法和簡(jiǎn)單染色的基本技術(shù)。2、掌握放線(xiàn)菌個(gè)體細(xì)胞和菌落的形態(tài)特征，并注意與霉菌、酵母菌的相互區(qū)別。二、基本原理放線(xiàn)菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，常見(jiàn)放線(xiàn)菌大多能形成菌絲體。緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基生長(zhǎng)的叫營(yíng)養(yǎng)菌絲（基內(nèi)菌絲，較透明較細(xì)），其生長(zhǎng)到一定階段能向空氣中生長(zhǎng)，叫氣生菌絲（較粗，色較暗），由氣生菌絲分化形成孢子絲及孢子。孢子絲成螺旋形、波浪形或分枝狀等，孢子常呈圓形、橢圓形或桿形。氣生菌絲、孢子絲和孢子的形態(tài)、顏色常作為放線(xiàn)菌分類(lèi)的重要依據(jù)。制片時(shí)通常采用插片法并結(jié)合簡(jiǎn)單染色進(jìn)行觀察，也可以用印片法將放線(xiàn)菌菌落或菌苔表面的孢子絲

40、印在載玻片上，經(jīng)簡(jiǎn)單染色后觀察。放線(xiàn)菌菌落干燥、不透明、表面呈致密的絲絨狀，上有一薄層“干粉”。 酵母菌是一類(lèi)呈單細(xì)胞生長(zhǎng)的真核微生物的總稱(chēng)，少數(shù)能形成假菌絲。酵母菌的菌落較濕潤(rùn)，與細(xì)菌菌落較相似，但不透明。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：鏈霉菌（Streptomyces sp.)插片平板培養(yǎng)物。2、染色劑：呂氏堿性美藍(lán)染液，石炭酸復(fù)紅染色液。3、儀器和其他用品：顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、濾紙片、接種環(huán)、接種鏟、鑷子等。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）插片染色法1、取蓋片：取出放線(xiàn)鏈霉菌插片平板培養(yǎng)物，用鑷子輕取蓋片，擦去背面培養(yǎng)物。2、固定：用酒精燈微熱固定。3、染色：用堿性美藍(lán)染液或石炭酸復(fù)紅染色液染色 1

41、-2分鐘。4、水洗、干燥5、觀察：菌面朝上置于載片上，鏡檢觀察。（二）菌落形態(tài)觀察對(duì)放線(xiàn)菌瓊脂平板上的菌落進(jìn)行仔細(xì)觀察，記錄菌落大小、形狀、透明程度、顏色、表面干燥或濕潤(rùn)，能否易挑取等特征。五、注意事項(xiàng)1、放線(xiàn)菌插片法操作過(guò)程中，在移動(dòng)附著有菌體的蓋玻片時(shí)勿碰動(dòng)菌絲體，菌面需朝上，以免破壞菌絲體的形態(tài)。2、插片法觀察個(gè)體形態(tài)時(shí)，宜用微調(diào)節(jié)器分別聚焦，以便清晰觀察到處于不同焦平面上的孢子、孢子絲、氣生菌絲和基內(nèi)菌絲。3、觀察菌落時(shí)，注意正反兩面的顏色和菌落表面的薄層“干粉”，仔細(xì)分辨與霉菌菌落的異同點(diǎn)。不要隨意移動(dòng)開(kāi)蓋，以免孢子飛散污染實(shí)驗(yàn)室。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪圖并說(shuō)明所觀察到的放線(xiàn)菌的形態(tài)特征。七

42、、思考題鏡檢時(shí)如何區(qū)分基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲？八、講授重點(diǎn)1、放線(xiàn)菌個(gè)體和菌落的一般形態(tài)特征。2、插片法觀察放線(xiàn)菌個(gè)體形態(tài)的方法和操作要點(diǎn)。九、實(shí)驗(yàn)要求每位學(xué)生利用插片染色法觀察、拍照。提交1張?jiān)诟弑剁R下觀察到的放線(xiàn)菌形態(tài)圖，標(biāo)明菌種名稱(chēng)和總放大倍數(shù)。描述菌落特征。十、考核點(diǎn)能否區(qū)分放線(xiàn)菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲和孢子。實(shí)驗(yàn)八 酵母菌形態(tài)觀察及死、活細(xì)胞的鑒別一、目的要求1、觀察酵母菌的細(xì)胞形態(tài)及出芽生殖方式。2、學(xué)習(xí)掌握區(qū)分酵母菌死、活細(xì)胞的原理和染色方法。3、了解酵母菌的個(gè)體和菌落形態(tài)特征，及其與細(xì)菌的區(qū)別。二、基本原理酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，少數(shù)能形成假菌絲，通常比常見(jiàn)

43、細(xì)菌大幾倍甚至十幾倍。大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通過(guò)接合產(chǎn)生子囊孢子。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，故具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無(wú)色的、而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。酵母菌的菌落較濕潤(rùn)，與細(xì)菌菌落較相似，但不透明，有特殊的酒香味。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的平板培養(yǎng)物。（提供空氣中細(xì)菌培養(yǎng)平板，用于酵母和細(xì)菌菌落形態(tài)的比較觀察）。2、染色劑：呂氏堿性美藍(lán)染液，石炭酸復(fù)紅。3、儀器和其他用品：顯微

44、鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、濾紙片、接種環(huán)、鑷子等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、酵母?jìng)€(gè)體形態(tài)及死活細(xì)胞觀察在載玻片上滴加1小滴生理鹽水，用接種環(huán)挑取少量菌苔，涂布均勻 - 在載玻片中央滴加1小滴呂氏堿性美藍(lán)染色液（0.1%）混合均勻 - 蓋上蓋玻片 - 放置3分鐘 - 先低倍后高倍鏡下觀察酵母形態(tài)和出芽情況 - 30分鐘后再觀察。并根據(jù)顏色來(lái)區(qū)別死活細(xì)胞，藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞，無(wú)色細(xì)胞是活細(xì)胞。2、菌落形態(tài)觀察仔細(xì)觀察酵母菌菌落，記錄菌落大小、形狀、透明程度、顏色、表面干燥或濕潤(rùn)，能否易挑取等特征，注意與細(xì)菌菌落的區(qū)別。五、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)1、酵母菌制片時(shí)，當(dāng)菌體與染液混合時(shí)注意不要?jiǎng)×彝磕?，以免破壞?xì)胞

45、。2、生理鹽水和染液滴加量均要適中，蓋蓋玻片時(shí)，染液過(guò)多易溢出，過(guò)少易產(chǎn)生氣泡。蓋玻片緩慢傾斜覆蓋，能避免產(chǎn)生氣泡。3、觀察菌落特點(diǎn)時(shí)，注意其表面是否濕潤(rùn)、大小和形態(tài)，注意與細(xì)菌菌落的區(qū)別。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、繪圖說(shuō)明顯微鏡下所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征。2、根據(jù)你所觀察到的呂氏美藍(lán)染液作用時(shí)間與釀酒酵母死、活細(xì)胞數(shù)量變化的情況，填寫(xiě)表4-1。表4-1 酵母染色結(jié)果記錄表呂氏美藍(lán)濃度0.1%作用時(shí)間3min30min每視野活細(xì)胞數(shù)（個(gè)）每視野活細(xì)胞數(shù)（個(gè)）七、思考題 在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細(xì)菌？八、講授重點(diǎn)1、酵母死活細(xì)胞鑒定原理。2、酵母細(xì)胞的個(gè)體形態(tài)，注意出芽繁殖方式是其主

46、要特點(diǎn)。3、怎樣分辨酵母與細(xì)菌菌落。九、實(shí)驗(yàn)要求每位學(xué)生染色觀察、拍照。提交2張?jiān)诟弑剁R下觀察到的酵母染色形態(tài)圖，標(biāo)明菌種名稱(chēng)、總放大倍數(shù)、觀察時(shí)間。描述菌落特征。十、考核點(diǎn)1、無(wú)菌操作是否熟練規(guī)范2、制片3、顯微鏡操作是否熟練規(guī)范實(shí)驗(yàn)九 霉菌的個(gè)體形態(tài)和菌落形態(tài)觀察一、目的要求1、學(xué)習(xí)并掌握霉菌的制片技術(shù)。2、了解常見(jiàn)霉菌（青霉、曲霉、根霉等）形態(tài)特征和相互區(qū)別。3、了解霉菌菌落形態(tài)特征及其與放線(xiàn)菌、酵母菌和細(xì)菌菌落的相互區(qū)別。二、基本原理霉菌可產(chǎn)生復(fù)雜分枝的菌絲體，分為基生菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長(zhǎng)到一定階段后分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。 霉菌菌絲體（尤其是繁殖菌絲）及其孢子的

47、形態(tài)特征是分類(lèi)的重要依據(jù)?？捎弥苯又破ê屯该髂z帶法觀察，也可采用載玻片培養(yǎng)觀察法觀察常用石炭酸美藍(lán)染液對(duì)霉菌進(jìn)行染色，蓋上蓋玻片后直接鏡檢。根霉?fàn)I養(yǎng)體是無(wú)隔多核菌絲體，營(yíng)養(yǎng)菌絲產(chǎn)生匍匐菌絲，以跳躍方式蔓延生長(zhǎng)，在匍匐絲交接處長(zhǎng)出假根，上方長(zhǎng)出孢囊梗，頂端膨大成孢子囊，有囊軸、孢囊孢子、囊托。有性生殖產(chǎn)生接合孢子，接合孢子外無(wú)附屬絲。曲霉菌在營(yíng)養(yǎng)菌絲的足細(xì)胞上長(zhǎng)出無(wú)隔的分生孢子梗，頂端膨大形成頂囊，在頂囊的表面上長(zhǎng)出單層或雙層小梗，在小梗頂端分化出串珠狀的分生孢子。青霉菌菌絲體有隔，從菌絲細(xì)胞長(zhǎng)出分生孢子梗，有隔有分枝，小梗有單輪或雙輪生，雙輪生中又分為對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)。分生孢子梗的分枝和輪生組成

48、了復(fù)雜的掃帚狀分枝結(jié)構(gòu)。在掃狀枝上，最后一級(jí)分枝為產(chǎn)生串生鏈狀分生孢子的小梗，呈瓶梗狀，著生小梗的細(xì)胞叫?；?，支持?；募?xì)胞叫副枝。分生孢子常為球形、橢圓形，呈藍(lán)綠色。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細(xì)菌和放線(xiàn)菌粗很多，是細(xì)菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，用低倍鏡即可觀察。群體（菌落）形態(tài)：霉菌呈絲狀生長(zhǎng)。菌絲也分營(yíng)養(yǎng)菌絲和氣生菌絲。菌絲以菌絲體的形式行使其功能。霉菌的菌落呈明顯的絲狀體，但與放線(xiàn)菌菌落相比比較疏松，一般呈絨毛狀、顆粒狀、棉絮狀等。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：毛霉（Mucor sp.）、青霉（Penicilliun sp.）、曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus s

49、p.)的平板培養(yǎng)物。2、染色劑：呂氏堿性美藍(lán)染液或石炭酸復(fù)紅染色液。3、儀器和其他用品：顯微鏡、酒精燈、載玻片、蓋玻片、濾紙片紙、解剖針、鑷子、生理鹽水等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、霉菌直接制片及菌體觀察取干靜載玻片，中央滴加一滴染色液， 用解剖針從菌落邊緣處挑取少量已產(chǎn)生孢子的霉菌菌絲放在染液中，用解剖針仔細(xì)將菌絲分散開(kāi)，蓋上蓋玻片。低倍鏡觀察后轉(zhuǎn)高倍鏡觀察。2、透明膠帶制片法取干靜載玻片，中央滴加一滴染色液， 用食指和拇指粘在一段透明膠帶兩端，使透明帶呈U形，膠面朝下，使呈U形 ， 用透明膠帶面輕輕觸及霉菌菌落表面 ， 使粘在透明膠帶上的菌體浸入載玻片上的染液中，并將膠帶兩端固定在載片兩端。低倍鏡觀

50、察后轉(zhuǎn)高倍鏡觀察。3、菌落形態(tài)觀察：仔細(xì)觀察霉菌的瓊脂平板上的菌落，記錄每種霉菌的菌落大小、形狀、顏色、表面是否有小黑點(diǎn)名小顆粒，能否易挑取等特征。五、注意事項(xiàng)1、制片時(shí)，取菌和分散菌絲要細(xì)心，要從菌落邊緣取，不要只取大菌落中央的菌絲，否則觀察不到完整菌絲體的結(jié)構(gòu)。2、不要攪動(dòng)菌絲體，盡量減少菌絲斷裂及形態(tài)的被破壞，蓋蓋玻片時(shí)避免了產(chǎn)生氣泡。3、若視野中只見(jiàn)孢子，不見(jiàn)霉菌的其它部分時(shí)，可對(duì)挑取的霉菌菌絲體，用50%的酒精浸一下，以除去脫落的孢子，再制片、染色和觀察。4、觀察菌落特征時(shí)，要選擇分離得很開(kāi)的單個(gè)較大菌落；5、勿隨意移動(dòng)開(kāi)蓋，以免孢子飛散污染實(shí)驗(yàn)室。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、拍攝并說(shuō)明所觀察到

51、的四種霉菌的形態(tài)特征。2、根據(jù)你對(duì)瓊脂平板上的放線(xiàn)菌、酵母菌和四種霉菌的的菌落觀察，將結(jié)果記錄在表4-2。表4-2平板菌落觀察結(jié)果記錄表菌種菌落大小菌落顏色表面干燥或濕潤(rùn)形態(tài)高度邊緣能否易挑取放線(xiàn)菌酵母菌毛霉根霉曲霉青霉七、思考題1、在進(jìn)行微生物制片時(shí)是否都需要進(jìn)行涂片？為什么？2、黑曲霉和黑根霉在形態(tài)特征上有何區(qū)別？八、講授重點(diǎn)1、四類(lèi)常見(jiàn)霉菌各自的典型特征2、直接制片觀察法與透明膠帶法九、實(shí)驗(yàn)要求每位學(xué)生制作4個(gè)標(biāo)本片，觀察、拍照。提交4張?jiān)诟弑剁R下觀察到的霉菌形態(tài)圖，標(biāo)明菌種名稱(chēng)、總放大倍數(shù)。描述菌落特征。十、考核點(diǎn)1、制片技術(shù)2、顯微鏡操作是否規(guī)范熟練第六次實(shí)驗(yàn)（4學(xué)時(shí)，1人/組）微生

52、物的大小和數(shù)量測(cè)定實(shí)驗(yàn)十 微生物大小的測(cè)定一、目的要求1、學(xué)習(xí)并掌握使用顯微測(cè)微尺測(cè)定微生物的大小的方法。2、掌握對(duì)不同形態(tài)細(xì)菌細(xì)胞大小測(cè)定的分類(lèi)學(xué)基本要求，增強(qiáng)對(duì)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識(shí)。二、基本原理1、 微生物的大小是微生物重要的形態(tài)特征之一，分類(lèi)鑒定的依據(jù)；2、 目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺是測(cè)量工具。微生物細(xì)胞的大小是微生物重要的形態(tài)特征之一，也是分類(lèi)鑒定的依據(jù)之一。由于菌體很小，只能在顯微鏡下來(lái)測(cè)量。用于測(cè)量微生物細(xì)胞大小的工具有目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長(zhǎng)度刻成50等分，或把10 mm長(zhǎng)度刻成100等分。測(cè)量時(shí)，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好

53、與物鏡放大的中間像重疊)來(lái)測(cè)量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際表示的長(zhǎng)度也不一樣，因此目鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物大小時(shí)須先用置于鏡臺(tái)上的鏡臺(tái)測(cè)微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每小格所代表的相對(duì)長(zhǎng)度。鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻有精確等分線(xiàn)的載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長(zhǎng)l0m（即0.0lmm），是專(zhuān)門(mén)用來(lái)校正目鏡測(cè)微尺的。校正時(shí)，將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在載物臺(tái)上，由于鏡臺(tái)測(cè)微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處于同一位置，都要經(jīng)過(guò)物鏡和目鏡的兩次放大成像進(jìn)入視野，即鏡臺(tái)測(cè)微尺隨著顯微鏡總放大倍數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺(tái)測(cè)微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實(shí)大小，所

54、以用鏡臺(tái)測(cè)微尺的已知長(zhǎng)度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測(cè)微尺，即可求出目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度，然后移去鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上待測(cè)標(biāo)本片，用校正好的目鏡測(cè)微尺在同樣放大倍數(shù)下測(cè)量微生物大小。三、實(shí)驗(yàn)器材1、活材料：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌種(菌懸液)2、溶液和試劑香柏油， 乙醇乙醚 3、儀器和其他用品：顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、蓋玻片、滴管、擦鏡紙。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、目鏡測(cè)微尺的安裝和校正把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測(cè)微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)

55、目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺(tái)測(cè)微尺的刻度每格長(zhǎng)l0m，所以由下列公式可以算出目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度。例如目鏡測(cè)微尺5小格正好與鏡臺(tái)測(cè)微尺5小格重疊，已知鏡臺(tái)測(cè)微尺每小格為l0m，則目鏡測(cè)微尺上每小格長(zhǎng)度為=5×10m/510m    用同法分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測(cè)微尺每小格所代表的長(zhǎng)度。    由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測(cè)

56、微尺必須針對(duì)特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長(zhǎng)度）進(jìn)行，而且只能在特定的情況下重復(fù)使用，當(dāng)更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須重新校正目鏡測(cè)微尺每一格所代表的長(zhǎng)度。2、微生物大小的測(cè)定    (1)將酵母菌斜面制成一定濃度的菌懸液（10-2）    (2)取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。    (3)移去鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測(cè)微尺來(lái)測(cè)量酵母菌菌體的長(zhǎng)，寬各占幾格（不足一格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)）。測(cè)出的格數(shù)乘上目鏡測(cè)微尺每格的校正值，即等于該菌的長(zhǎng)和寬。一般測(cè)量菌體的大小要在同一個(gè)標(biāo)本片上測(cè)定1020個(gè)菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。而且一般是用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體進(jìn)行測(cè)定。（4）同法用油鏡測(cè)定微生物染色標(biāo)本的長(zhǎng)和寬。五、注意事