基因工程的操作程序

1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序DUCK179制作侍侍 燕燕 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 目的基因主要是指目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因供體生物細(xì)胞供體生物細(xì)胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因即：將需要的基因從供體生物細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)即：將需要的基因從供體生物細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)目前被廣泛提取使目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因植物抗病基因人胰島人胰島素基因等。素基因等。1.什么是基因文庫(kù)？2.怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因？2

2、）2 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因3 3）人工合成）人工合成 種類：基因組文庫(kù)：cDNA文庫(kù)：含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切 口，露出口，露出_。 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。 核心核心3.3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個(gè)重組，形成了一個(gè)重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNAD

3、NA連接酶連接酶相同相同( (二二) )基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子一個(gè)一個(gè)切口切口兩個(gè)兩個(gè)黏性末端黏性末端兩個(gè)兩個(gè)切口切口獲得目的基因獲得目的基因DNA DNA 連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）同一種同一種 限制酶限制酶 科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)

4、粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲能力。 目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因、目的基因b、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因( (三三) )將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入目的基因進(jìn)入_內(nèi)，并且在內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持受體細(xì)胞內(nèi)維持_和和_的過(guò)程的過(guò)程受體細(xì)胞受體細(xì)胞穩(wěn)定穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)方法方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞

5、導(dǎo)入微生物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法 感受態(tài)細(xì)胞吸收感受態(tài)細(xì)胞吸收DNADNA分子分子( (三三) )將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞( (四四) )目的基因的檢測(cè)與鑒定目的基因的檢測(cè)與鑒定檢查是否成功檢查是否成功檢測(cè)檢測(cè)鑒定鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方

6、法方法方法方法方法方法DNADNA分子雜交分子雜交DNA分子雜交分子雜交抗原抗原- -抗體雜交抗體雜交PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀DNA雙鏈復(fù)制的基本原理雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對(duì)引物一對(duì)引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶( (TaqTaq酶酶）DNADNA的兩條鏈為模板的兩條鏈為模板溫度控制溫度控制類別類別項(xiàng)目項(xiàng)目 復(fù)制復(fù)制 轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄場(chǎng)所場(chǎng)所特點(diǎn)特點(diǎn)模板模板原料原料酶酶能量能量堿基堿基配對(duì)配對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)物細(xì)胞核細(xì)胞核只有只有DNA的一條鏈的一條鏈四種核糖核苷酸四種核糖核苷酸RNA聚合酶聚合酶ATPA-U C-G T-A

7、G-C細(xì)胞核細(xì)胞核DNA的兩條鏈的兩條鏈四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶聚合酶ATPA-T C-G T-A G-C兩個(gè)雙鏈兩個(gè)雙鏈DNADNA分子分子一條單鏈一條單鏈mRNAmRNA邊解旋邊復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，半保留復(fù)制半保留復(fù)制邊解旋邊轉(zhuǎn)錄邊解旋邊轉(zhuǎn)錄5 5/ /3 3/ /GGGGTCTC3 3/ /5 5/ /GAGACCCC5 5/ /3 3/ /引物引物GGGG變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸1.目的基因目的基因DNA受熱變性，解鏈；受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。聚合酶作用下進(jìn)行延伸。

8、5 5/ /3 3/ /AGAG引物引物利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下， 斷裂，形成斷裂，形成_ _ b b、復(fù)性（、復(fù)性（55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端延伸，合成與模板互補(bǔ)端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的的_。 氫鍵氫

9、鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈2.微生物作受體細(xì)胞原因：微生物作受體細(xì)胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞3.轉(zhuǎn)化方法：轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少處理細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 _細(xì)胞吸收DNA分子。Ca2+感受態(tài)感受態(tài)感受態(tài)感受態(tài)1.常用菌：常用菌： 目的基因插入目的基因插入TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA上上 農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌 導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞 整合到受體細(xì)胞的染色體上整合到受體細(xì)胞的染色體上 目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá)目的基因的遺傳特性得以維持穩(wěn)定和表達(dá) 1

10、. 1.農(nóng)桿菌特點(diǎn)：農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物。易感染雙子葉植物和裸子植物。TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上的名詞及對(duì)應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是的名詞及對(duì)應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是2 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫(kù)中提取從基因組文庫(kù)中提取從受體細(xì)胞中提取從受體細(xì)胞中提取 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù) 利用利用DNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.3.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受體細(xì)