實(shí)驗(yàn)二-萌發(fā)麥苗淀粉酶活性測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)二萌發(fā)麥苗淀粉酶活性的測(cè)定生物112周泓兆1102040226一、研究背景及目的酶作為生物體內(nèi)最重要的催化劑，其活性尤其受到關(guān)注。在這次實(shí)驗(yàn)中，我們將對(duì)一些經(jīng)典經(jīng)典酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，對(duì)比其思路與設(shè)計(jì)差異，了解測(cè)定酶活力的基本方向和實(shí)驗(yàn)技巧。完成小麥萌發(fā)過程中淀粉酶活力的測(cè)定并分析測(cè)定結(jié)果是否合理。二、原理淀粉在淀粉酶的催化作用下生成麥芽糖。本實(shí)驗(yàn)便是通過測(cè)定淀粉酶在一定時(shí)間內(nèi)分解淀粉所產(chǎn)生的麥芽糖總量來測(cè)定酶的活性。根據(jù)其催化產(chǎn)物的特點(diǎn)和現(xiàn)有測(cè)定方法規(guī)定酶活力單位為：每分鐘每克鮮重麥種所催化生成的麥芽糖毫克數(shù)（毫克麥芽糖*克-1鮮重*分-1 ）。本實(shí)驗(yàn)涉及a -淀粉酶與3 -淀粉酶，

2、我們可通過鈍化3 -淀粉酶的方法單獨(dú)測(cè)定 a -淀粉酶的活性。本實(shí)驗(yàn)所使用的3,5 -二硝基水楊酸法是一種對(duì)還原糖定量測(cè)定的方法。還原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。因此，我們可以測(cè)定樣品中還原糖以及總糖的量。麥芽糖是還原性糖，可用該方法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。三、儀器與試劑1. 儀器：TDL-40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），722光柵分光光度計(jì)（上海精密科學(xué) 儀器有限公司），DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），JP-100架盤藥物天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠），HCTP12A1架盤

3、藥物天平（北京醫(yī)用天平廠）2. 試劑：麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液，pH5.6的檸檬酸緩沖液 ，3,5-二硝基水楊酸溶液，0.4M NaOH,Folin-酚試劑甲，F(xiàn)olin-酚試劑乙，標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液（ 1mg/ml ）3. 材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長約1cm）四、實(shí)驗(yàn)方法/操作步驟1、 酶液的制備：稱取兩克萌發(fā)的小麥種子（芽長一厘米左右），置研缽中加少量石英砂，以蒸餾水作為勻漿液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中至40ml左右，室溫浸提15-20分鐘， 浸提充分后定容至刻度，混勻后3500r/min離心20min，取上清液備用（初始酶液）。2、取15支試管，分別編號(hào)a -測(cè)定管1、a -測(cè)定管2、a

4、 -對(duì)照管1、a -對(duì)照管2、a +3 - 測(cè)定管1、a +3 -測(cè)定管2、a +3 -對(duì)照管1、a +3 -對(duì)照管2與1、2、3、4、5、6、7。3、 在a-測(cè)定管1、a -測(cè)定管2、a-對(duì)照管1、a -對(duì)照管2中各加入酶液1ml在70C恒溫 水浴中準(zhǔn)確加熱15mi n,取出后立即在冰浴中冷卻至室溫或更低。取出后分別在四支試管中 各加入1mlpH5.6檸檬酸緩沖液，置于 40C恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫15min。之后向兩支對(duì)照管中各加入4ml 0.4M NaOH再向各管分別加入 40C下預(yù)熱的淀粉溶液 2ml，搖勻，立即于40 C 水浴中準(zhǔn)確保溫 5min,然后向兩支測(cè)定管分別迅速加入4ml 0.

5、4M NaOH，搖勻備用。4、 取制備的酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混合均勻后，在a + 3 -測(cè)定管1、a + 3 -測(cè)定管2、a + 3 -對(duì)照管1、a + 3 -對(duì)照管2中各加入1ml稀釋后的酶液 與1mlpH5.6檸檬酸緩沖液置于 40 C恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫 15min。之后向兩支對(duì)照管中各加 入4ml 0.4M NaOH再向各管分別加入 40C下預(yù)熱的淀粉溶液 2ml，搖勻，立即于 40C水浴中準(zhǔn)確保溫5min，然后向兩支測(cè)定管分別迅速加入4ml 0.4M NaOH，搖勻備用。5、 取編號(hào)1、2、3、4、5、6、7的七支試管，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/

6、ml） 0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0ml，然后將各管用蒸餾水準(zhǔn)確補(bǔ)充至1.0ml，搖勻。6、在a-測(cè)定管1、a -測(cè)定管2、a -對(duì)照管1、a -對(duì)照管2、a + 3 -測(cè)定管1、a + 3 -測(cè)定管2、a +3 -對(duì)照管1、a +3 -對(duì)照管2與1、2、3、4、5、6、7管內(nèi)各加入1ml 3,5二 硝基水楊酸試劑混勻，同時(shí)在沸水浴中準(zhǔn)確保溫5min,取出冷卻，用蒸餾水稀釋到15ml,混勻。7、 依次取各試管溶液在 520nm波長下進(jìn)行比色，記錄消光值。以1、2、3、4、5、6、7管 消光值作為縱坐標(biāo)，麥芽糖含量作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。8、 Fo

7、lin-酚測(cè)萌發(fā)麥苗水溶性蛋白含量：稱取0.5g萌發(fā)的小麥種子（芽長一厘米左右），置研缽中加少量石英砂，以蒸餾水作為勻漿液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中至40ml左右，室溫浸提15-20分鐘，浸提充分后定容至刻度，混勻后3500r/min離心20min，取上清液備用。9、 取9支具塞試管，分別標(biāo)上待測(cè)液1、待測(cè)液2、待測(cè)液3與F1-F6。分別在F1-F6中加入標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，然后將各管用蒸餾水補(bǔ)充到1.0ml。再各取1ml上清液（步驟8）于標(biāo)有待測(cè)液1、待測(cè)液2、待測(cè)液3的試管中。在這九支試管中 各加試劑甲5ml，混勻后室溫下放置10min，

8、再加試劑乙 0.5ml，立即混勻，30min后測(cè)定各管的OD 650。五、數(shù)據(jù)整理樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線AvV 口呂號(hào)1234567OD200.0000.0620.2510.3500.4540.6110.649均值A(chǔ)vV 口呂號(hào)a -測(cè)a -測(cè)a-對(duì)a -對(duì)a + 3 -a + 3-a + 3 -a + 3 -定管1定管2照管1照管2 測(cè)定管測(cè)定管對(duì)照管對(duì)照管1212OD200.2960.3000.1590.1630.3420.3360.1910.175均值0.2980.1610.3390.183樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)液AvV 口呂號(hào)F1F2F3F4F5F6待測(cè)液待測(cè)液待測(cè)液1 23OD500.0000.12

9、60.2690.3560.4610.5520.5560.5540.551均值0.554六、結(jié)果計(jì)算與討論分析根據(jù)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:標(biāo)準(zhǔn)曲線ozgQo麥芽糖濃度(mg/ml)y = 0. 0023x Rt = 0. 9893標(biāo)準(zhǔn)曲線0.500100200300蛋白質(zhì)濃度(U g/ml)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得:AA； 口 呂號(hào)a -測(cè)定管1a -測(cè) 定管2a -對(duì) 照管1a -對(duì) 照管2a + 3 -測(cè)定管1a + 3 -測(cè)定管2a + 3 -對(duì)照管1a + 3 -對(duì)照管2麥芽糖濃 度(mg/ml)0.4450.2410.5070.274結(jié)果計(jì)算：a -淀粉酶活性(毫克麥芽糖*克-1鮮重*分-1 )

10、 =(A-A')*樣品稀釋總體積/樣品重(g) *5=(0.445-0.241)*800/2*5=16.32(毫克麥芽糖 *克-1 鮮重 * 分-1)(a -+ 3 -)淀粉酶總活性(毫克麥芽糖*克-1鮮重*分-1) =(B-B')*樣品稀釋總體積/樣品重(g) *5=(0.507-0.274)*8000/2*5=186.4(毫克麥芽糖 *克-1 鮮重 *分-1)A a -淀粉酶測(cè)定管中的麥芽糖中的濃度A' a -淀粉酶對(duì)照管中的麥芽糖濃度B a -及B -淀粉酶總活性測(cè)定管中的麥芽糖濃度B'a -及B -淀粉酶總活性對(duì)照管中的麥芽糖濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得：稀釋后

11、溶液的蛋白質(zhì)濃度（卩g/ml） =240.9卩g/ml結(jié)果計(jì)算：稀釋倍數(shù)為2g/0.5g=4，可得酶液的蛋白質(zhì)濃度（ 卩g/ml ） =240.9卩g/ml*4=963.5卩g/ml（a -+ 3 -）淀粉酶總比活=（a -+ 3 -）淀粉酶總活性（毫克麥芽糖 *克-1鮮重*分-1） /酶液 的蛋白質(zhì)濃度（卩g/ml ） *酶液總體積（ml） =186.4 （毫克麥芽糖*克-1鮮重*分-1） /963.5 卩 g/ml*25ml）=7.738U/mg我們可以看出，平行數(shù)據(jù)之間的誤差在允許的范圍之內(nèi)，說明3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定生成麥芽糖的濃度是可行的。而a -淀粉酶活性與（a -+ 3 -）

12、淀粉酶總活性差距極大很可能是因?yàn)槊傅膮f(xié)助作用，或是一部分有協(xié)助分解淀粉作用的酶在70C時(shí)與3 -淀粉酶一同失活。七、結(jié)論與展望通過以上的實(shí)驗(yàn)方法，我們對(duì)淀粉酶的活性進(jìn)行了測(cè)定。并且我們發(fā)現(xiàn)a -+ 3 -）淀粉酶總活性遠(yuǎn)高于a -淀粉酶活性，小麥淀粉酶的總比活為7.738U/mg。八、思考題及質(zhì)疑1. 完成這次小小的蛋白含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)從設(shè)計(jì)到實(shí)施完成的自我經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。答：這次蛋白實(shí)驗(yàn)的主要難點(diǎn)在于蛋白溶液的稀釋倍數(shù)。在設(shè)計(jì)時(shí)我考慮使用濃度梯度的方法來使得稀釋后酶液濃度落在工作曲線內(nèi)，其實(shí)實(shí)際操作時(shí)通過不斷稀釋即可。而且設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)我強(qiáng)調(diào)“可溶性蛋白”，于是考慮了溶解度的問題，并且設(shè)計(jì)了 12000r

13、/min的離心過程，后來發(fā)現(xiàn)這樣使得蛋白含量與酶活性之間喪失了可比性（因?yàn)殡x心程度不同了）。因此我的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)是：聯(lián)系本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，盡可能減少變量的數(shù)目2. 從酶活測(cè)定的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的酶活測(cè)定樣品稀釋倍數(shù)是否合理？為什么？答：根據(jù)我們組和其它小組的經(jīng)驗(yàn)，本次a-淀粉酶活性測(cè)定結(jié)果均靠近甚至稍微超過工作曲線，因此我們覺得應(yīng)當(dāng)再稀釋一倍后進(jìn)行測(cè)定。3. 眾多測(cè)定淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一般均是采取鈍化3-淀粉酶的活力而測(cè) a-淀粉酶 和測(cè)總酶活力的策略，為何不采取鈍化a -淀粉酶活力去測(cè)3 -淀粉酶活力呢？這種設(shè)計(jì)思路 說明什麼？答：鈍化3 -淀粉酶可以采取高溫的方法，而鈍化a

14、 -淀粉酶則需要采用酸性環(huán)境。若在實(shí)驗(yàn)中采取鈍化a -淀粉酶的方式，則在將 pH調(diào)回的的過程中a -淀粉酶會(huì)有很大一部分復(fù)性。 而高溫處理后立即冰浴，則可以大大減少3 -淀粉酶的復(fù)性。其次，在實(shí)驗(yàn)中，酶對(duì)pH更加 敏感，若酸過量則會(huì)導(dǎo)致3-淀粉酶也被鈍化，相對(duì)而言，溫度更加易于控制。這種設(shè)計(jì)思路說明我們?cè)趯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)要考慮其在操作時(shí)的合理性，使實(shí)驗(yàn)操作盡可能簡(jiǎn)便。4. a -淀粉酶活性測(cè)定時(shí) 70C水浴為何要嚴(yán)格保溫15分鐘？保溫后為什么要立即于冰浴中驟冷？而經(jīng)如此處理，為什么在隨后的40C溫浴和酶促反應(yīng)中就能保證3 -淀粉酶不會(huì)再參與催化反應(yīng)。答，保溫時(shí)間過短3 -淀粉酶失活不完全， 時(shí)間過長

15、導(dǎo)致a -淀粉酶也有一部分被鈍化， 所以要嚴(yán)格保溫15分鐘。立即于冰浴中驟冷是為了減小3 -淀粉酶在降溫過程中的復(fù)性。經(jīng)過巨大的溫度變化，不耐高溫的 3 -淀粉酶會(huì)徹底失活，所以在隨后的40C溫浴和酶促反應(yīng)中就能保證3 -淀粉酶不會(huì)再參與催化反應(yīng)。5. 酶的最適反應(yīng)溫度（一般都是生理溫度）和最適保存溫度（一般0C以下）為什么不一樣？而這兩個(gè)狀態(tài)都是需要維護(hù)酶的空間結(jié)構(gòu)。答：最適反應(yīng)溫度時(shí)，酶的結(jié)構(gòu)最適合誘導(dǎo)底物與之結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物，因此體現(xiàn)出酶的活性最強(qiáng)。而在最適保存溫度時(shí)，酶的穩(wěn)定性最好，催化能力很低，從而很好地保存了酶的活性。6. 為什么3, 5-二硝基水楊酸與還原糖的反應(yīng)要先沸水浴

16、然后再稀釋測(cè)定？答：原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物。因此在沸水浴時(shí)，溶液濃度越大反應(yīng)越完全。而在比色法測(cè)定時(shí)，濃度過大無法測(cè)定，因此需要稀釋以后進(jìn)行測(cè)定，使數(shù)據(jù)盡可能符合朗伯-比爾定律。7. 在設(shè)計(jì)酶活測(cè)定的實(shí)驗(yàn)時(shí)，要求酶促反應(yīng)初速度對(duì)底物濃度的小量變化不敏感，具體要求為：在底物濃度有10%勺變化幅度范圍內(nèi)，而所測(cè)初速度的變化幅度小于1%貝US/K m應(yīng)該大于多少才能保證這一點(diǎn)？（設(shè)定為米氏酶）答：根據(jù)米氏方程：v=（VmaxS）/（K m+S），根據(jù)題意：0.9S < S' < 1.1S,則 0.99v < v' w 1.01

17、v,計(jì)算可得：S/K m> 8.18。8. 轉(zhuǎn)氨酶在細(xì)胞內(nèi)的作用及生理意義？細(xì)胞內(nèi)有眾多的轉(zhuǎn)氨酶，但相關(guān)研究及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中卻幾乎都是只檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT的活力，而極少測(cè)定其它轉(zhuǎn)氨酶活力，你推測(cè)可能的原因會(huì)是什么？為什么？答：轉(zhuǎn)氨酶在細(xì)胞內(nèi)催化酮酸與氨基酸或氨基酸之間的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，可以生成非必須氨基酸或產(chǎn)生酮酸分解產(chǎn)能或作為糖和脂肪酸的原料。轉(zhuǎn)氨酶在肝臟中作用巨大，其中以谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT最為重要。前者是催化谷氨酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，后 者是催化谷氨酸與草酰乙酸之間的轉(zhuǎn)氨作用，其反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸和草酰乙酸都是代謝的重要中間產(chǎn)物，而且GPT和G

18、OT的活性在人體轉(zhuǎn)氨酶中是最高的，所以但相關(guān)研究及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中卻幾乎都是只檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT的活力。9. 轉(zhuǎn)氨酶催化的是雙底物可逆反應(yīng)，根據(jù)酶活力測(cè)定的總體思路，要保證測(cè)定反應(yīng)的初速度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)所提供的資料，你認(rèn)為是否保證了這一點(diǎn)？是如何保證的？答：保證了這一點(diǎn)。 通過加入過量的底物促進(jìn)了正反應(yīng)進(jìn)行，而且適當(dāng)增長了反應(yīng)時(shí)間，使正反應(yīng)反應(yīng)充分。10、指導(dǎo)所提供的兩個(gè)轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)方案，設(shè)計(jì)的酶促反應(yīng)時(shí)間是多少？終止酶促反應(yīng)用的什么試劑？與淀粉酶活力測(cè)定規(guī)定的酶促反應(yīng)時(shí)間相比是否有差異？差異可能的原 因你分析認(rèn)為會(huì)是因?yàn)槭裁?？答：酶促反?yīng)的時(shí)間是 10min，用4ml 0.4M NaOH終止酶促反應(yīng)，