Notch信號通路相關(guān)基因的表達與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系

1、Notch信號通路相關(guān)基因的表達與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系         10-11-15 15:49:00     編輯：studa20                        作者：盧友光 佘林 林李嵩 張聲 丁林燦 【摘要】&

2、#160; 目的 篩選與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的Notch信號通路基因。 方法 對已構(gòu)建的涎腺腺樣囊性癌高低轉(zhuǎn)移細胞株ACCM、ACC2基因表達譜進行生物信息學(xué)分析，在與Notch信號通路基因進行比對后，篩選出差異基因，通過熒光實時定量PCR技術(shù)對相關(guān)基因的表達差異進行初步驗證。 結(jié)果 涎腺腺樣囊性癌的表達譜中有46個基因與Notch信號通路有關(guān)。驗證發(fā)現(xiàn)，Notch1,Notch2,Notch4，CHUK，F(xiàn)OXC1，F(xiàn)ZD2，F(xiàn)ZD3，GBP2和RUNX1在2個細胞株中的表達差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同時Notch1在發(fā)生轉(zhuǎn)移的涎腺腺樣囊性癌中的表達明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的涎腺腺

3、樣囊性癌（P<0.05）。 結(jié)論 Notch信號通路中的多個基因可能參與了涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生和發(fā)展；Notch1的表達與涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  癌，腺樣囊性； 涎腺腫瘤； 聚合酶鏈反應(yīng)； 細胞，培養(yǎng)的； 基因表達； 信號傳導(dǎo)涎腺腺樣囊性癌是口腔唾液腺常見的惡性腫瘤之一，該腫瘤的惡性程度高，術(shù)后易于復(fù)發(fā)，患者預(yù)后較差。目前認為多種分子涉及該腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，包括P53、P16、P27、MMPs等。Notch信號通路是一條古老的信號通路，相鄰細胞通過Notch信號通路的傳遞，決定細胞的增殖或凋亡，它參與胚胎發(fā)育，T細胞的發(fā)育，以及維持造血干細胞自我

4、更新等。筆者采用第二代差異顯示技術(shù)構(gòu)建了涎腺腺樣囊性癌高低轉(zhuǎn)移細胞株的基因表達譜，通過生物信息學(xué)分析和半定量RTPCR，發(fā)現(xiàn)Notch基因家族4個成員在ACC2，ACCM 2個細胞株間存在表達差異1。本研究采用熒光定量PCR進一步驗證Notch基因家族在這2個細胞株中表達的差異，分析Notch信號通路42個主要相關(guān)基因表達的變化，尋找與涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。    1  材料與方法    1.1  材料  人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細胞株ACCM和低轉(zhuǎn)移細胞株ACC2由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)

5、院口腔頜面外科腫瘤實驗室惠贈。其中ACCM為ACC2經(jīng)過裸鼠體內(nèi)連續(xù)傳代培養(yǎng)分離出的高轉(zhuǎn)移細胞株。免疫組織化學(xué)標(biāo)本為福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診為涎腺腺樣囊性癌的腫瘤石蠟組織標(biāo)本，其中發(fā)生轉(zhuǎn)移者11例，未轉(zhuǎn)移者14例。    1.2  主要試劑和儀器  Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；Prime Script RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司)；Notch1兔多克隆抗體(美國Neomarker公司)；UltraSensitive SP超敏試劑盒、磷酸鹽緩沖

6、液PBS、檸檬酸鹽抗原修復(fù)液、加強型DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。Mastercycler Gradient 5331 PCR儀(德國Eppendorf公司)；TP800熒光定量PCR儀(日本TaKaRa公司)；GeneSnap凝膠成像系統(tǒng)(英國SynGene公司)；石蠟自動包埋脫水機、連續(xù)切片機（德國Leica公司）。    1.3  篩選Notch信號通路相關(guān)基因  根據(jù)文獻2構(gòu)建的涎腺腺樣囊性癌基因表達譜，進行生物信息學(xué)分析，使用圖像分析軟件測量出所有片段在凝膠上的遷移距離。SAS統(tǒng)計軟件進行曲線擬合，找出最佳擬合曲線

7、，計算各片段bp值。根據(jù)擬合結(jié)果，以片斷大小和所在“表達窗”作參數(shù)，按2%容許誤差從數(shù)據(jù)庫(Qbiogene Inc MPBiomedicals Inc公司)確定其所對應(yīng)的基因，每個片段數(shù)據(jù)均與NCBI GeneBank直接鏈接，從而對涎腺腺樣囊性癌的基因表達譜進行分析，初步得出相關(guān)基因。根據(jù)文獻36查找Notch信號通路上下游相關(guān)基因共113個，通過與文獻2構(gòu)建的表達譜中所得到的5 420個基因片段的信息進行比對，選出在兩者中共有的基因共46個，通過NCBI Genebank和UCSC查詢46種基因的序列，使用Primer 3(v.0.4.0)在線設(shè)計引物（表1），引物委托上海生工生物工程技

8、術(shù)服務(wù)有限公司合成。    1.4  細胞株培養(yǎng)  將ACCM、ACC2細胞株復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)、取第4代對數(shù)生長期細胞通過Trizol法提取抽提RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度。通過分光光度儀測定260 nm和表1  46種基因及內(nèi)參照引物280 nm的值，兩者比值在1.72.0，并根據(jù)260 nm將各個樣品總RNA稀釋至相同濃度，使用Prime Script RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。    1.5  熒光實時定量PCR分析  反應(yīng)體系包括

9、：cDNA 2.0 L，上游引物0.5 L，下游引物0.5 L，SYBR Premix Ex Taq 12.5 L，去離子水加至總體積25 L。反應(yīng)條件：94 30 s94 10 s60 30 s，進行40個循環(huán)后進行融解曲線的測定。以前12個循環(huán)的熒光值作為熒光本底信號，第412個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍設(shè)定為閾值，以Actin(ACTB)為管家基因，校正每個樣品Ct值，數(shù)據(jù)分參照文獻7的方法進行。46種基因均采用上述方法進行PCR反應(yīng)，同時每個基因在每個模板中做3次重復(fù)實驗，得到的Ct值取平均值Ct，對應(yīng)模板內(nèi)參基因（ACTB）Ct值的平均值 Ct(ACTB)：  

10、;  Ct=Ct-Ct(ACTB)；CtCt實驗組-Ct對照組    對照組和實驗組中待測基因的倍數(shù)：    N=2-Ct    1.6  免疫組織化學(xué)分析  標(biāo)本取下后立即用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，3 m連續(xù)切片。陽性對照采用卵巢癌組織，陰性對照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。免疫組織化學(xué)驗證采用SP三步法，由2位病理科醫(yī)師盲法閱片，隨機觀察10個視野（×400）。評判標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本無陽性反應(yīng)細胞或陽性反應(yīng)細胞<10%為陰性（）；10%50%為陽性（+）；&g

11、t;50%為強陽性（）。    1.7  統(tǒng)計學(xué)處理  數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0軟件包處理。實時定量PCR結(jié)果采用兩樣本t檢驗，免疫組織化學(xué)結(jié)果采用秩和檢驗。=0.05為統(tǒng)計學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)。    2  結(jié)  果    2.1  PCR分析結(jié)果  對上述初篩的46種基因進行定量RTPCR分析，將對照組（ACC2）各個基因的相對表達量定義為1，ACCM細胞中這些基因的相對表達量見圖1。與ACC2比較，在46個基因中，CHUK、FOXC1、FZD2、FZ