納米羥基磷灰石-殼聚糖骨組織工程支架的研究_圖文

1、納米羥基磷灰石2殼聚糖骨組織工程支架的研究王新1劉玲蓉1張其清1,2【摘要】目的以一種簡單、有效的方法制備多孔的納米羥基磷灰石(nano hydroxyapatite,nano2HA2殼聚糖(ch ito san,CS復合支架,并評價其理化性能及與細胞相容性。方法采用原位復合2冷凍干燥方法,制備多孔nano2 HA2CS支架。通過掃描電鏡、透射電鏡、X線衍射和傅立葉紅外光譜分析支架的微觀形貌及材料的組成。分離初生W istar 大鼠的成骨細胞,取傳代培養(yǎng)第3代細胞分別與nano2HA2CS支架和純CS支架共培養(yǎng)2、4、6、8h,各時間點各取4個樣品,測定細胞在支架上的黏附率,并通過組織化學染色

2、、掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。結果nano2HA2CS復合支架具有多孔結構,孔徑為100500m,大多數(shù)孔徑為400500m。具有很高的孔隙率,隨CS和HA含量的增加,孔隙率明顯降低,密度升高。掃描電鏡和透射電鏡觀察顯示合成的HA晶體,晶粒大小為納米級,在支架孔壁上均勻、連續(xù)分布如“鋪路石”樣。X線衍射和紅外光譜分析表明合成的HA是含CO32-弱結晶納米晶體。細胞相容性實驗顯示,成骨細胞在支架上黏附、增殖,并分泌纖維狀細胞外基質;在復合支架上的黏附率明顯高于純CS支架。結論采用原位復合與冷凍干燥法結合制備的nano2HA2CS復合支架具有良好的理化性質和細胞相容性,有望應用于組織工程骨的構建?！娟P鍵

3、詞】納米羥基磷灰石殼聚糖骨組織工程支架中圖分類號:R318.08Q813文獻標識碼:AA STUDY ON NANO-HYD R OX YAPATITE-CH IT OSAN SCAFF OLD F ORB ONE TISSUE ENGINEER ING W A N GX in,L IU L ing rong,ZH A N G Q iqing.Institu te of B io m ed ica l E ng ineering,P ek ing U n ion M ed ica l Colleg e and Ch ineseA cad e m y of M ed ica l S cience

4、s,T ianj in,300192,P.R.Ch ina.E2m a il:w ang x inoneone126.co mCorresp ond ing au thor:ZH A N G Q iqing,E2m a il:z hang qiqxm u.ed 【Abstract】ObjectiveTo fab ricate a nano2hydroxyapatite2ch ito san(nano2HA2CSscaffo ld w ith h igh po ro sity by a si m p le and effective techn ique and to evaluate the

5、physical and chem ical p roperties and the cytocompatib ility of the compo site scaffo ld.M ethodsT he th ree2di m en si onal nano2HA2CS scaffo lds w ith h igh po ro sity w ere p repared by the in situ hyb ridizati on2freeze2drying m ethod.T he m icro scop icmo rpho logy and componen ts of the compo

6、 site scaffo lds w ere analyzed by the scann ing electron m icro scopy(SE M,the tran s m issi on electron m icro scopy(T E M,the X2ray diffracti on(XRDexam inati on,and the Fou rier tran sfo rm ed infrared spectro scopy(FT I R.T he calvarial o steob lasts w ere iso lated from the neonatalW istar rat

7、s.T he serial subcu ltu red cells(3rd passagew ere respectively seeded on to the nano2HA2CS scaffo ld and the CS scaffo ld,and then w ere co2cu ltu red fo r2,4,6and8hou rs.A t each ti m e po in t,fou r speci m en s from each m atrix w ere taken to determ ine the cell2adhesi on rate.T he cell mo rpho

8、 logy w as ob served by theh isto logical stain ing and SE M.ResultsT he m acropo rou s nano2HA2CS scaffo lds had a featu re of h igh po ro sity w ith apo re diam eter from100to500m(mo stly4002500m.T he scaffo lds had a h igh in terval po ro sity;how ever,the in terval po ro sity w as obvi ou sly de

9、creased and the scaffo ld den sity w as increased w ith an increase in the con ten ts of CS and HA.T he SE M and T E M resu lts show ed that the nano2sized HA w as syn thesized and w as distribu ted on the po re w alls homogeneou sly and con tinuou sly.T he XRD and FT I R resu lts show ed that the H

10、A crystals w ere carbonate2 sub stituded and no t w ell2crystallized.T he cytocompatib ility test show ed that the seeded o steob lasts cou ld adhere the scaffo lds,p ro liferating and p roducing the ex tracellu lar m atrix on the scaffo lds.T he adherence rate fo r the nano2HA2CS scaffo lds w as ob

11、vi ou sly h igher than that fo r the pu re CS scaffo lds.ConclusionT he nano2HA2CS scaffo lds fab ricated by the in situ hyb ridizati on2freeze2drying m ethod have a good physical and chem ical p roperties and a good cytocompatib ility;therefo re,th is k ind of scaffo lds m ay be successfu lly u sed

12、 in the bone tissue engineering.【Key words】N ano hydroxyapatiteCh ito sanBone tissue engineeringScaffo ldFounda tion ite m:P rogram of T ian jin fo r T ack ling H ard2nu t P rob lem s in Science and T echno logy (05YFGZGX03800基金項目:天津市科技攻關項目資助項目(05YFGZGX03800作者單位:1中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程研究所天津市生物醫(yī)學材料重點實

13、驗室(天津,300192;2廈門大學生物醫(yī)學工程研究中心廈門大學醫(yī)學院廈門市生物醫(yī)學工程技術研究中心通訊作者:張其清,教授,博士導師,研究方向:組織引導再生,E2m ail:zhangqiqxm 具有多孔結構的三維支架是組織工程中的重要研究內(nèi)容。理想的骨組織工程支架應該能模擬骨組織的形態(tài)、結構和功能1。殼聚糖(ch ito san,CS是一種天然可降解多糖,生物相容性好,塑形容易,已廣泛應用于組織工程研究2。羥基磷灰石(hydroxyap atite,HA是骨組織的成分。納米HA(nano2HA除了具有傳統(tǒng)HA的特性外,在理化性質和生物學方面有更大的優(yōu)越性3,4。為了結合CS和HA兩種材料的優(yōu)

14、點,現(xiàn)在常把兩種材料復合以得到具有更好性能的材料5。傳統(tǒng)的方法是將HA粉體與CS溶液共混,但是nano2HA存在易聚集、分散困難的缺點。原位復合的方法,是采用預先配制均一的HA前體2CS反應體系,然后在強堿溶液中緩慢反應,制備的nano2HA2CS棒材具有多層結構,nano2HA可均勻分散在復合材料中6。但是這種材料不具有細胞遷移、生長所必需的多孔結構。我們通過將原位復合和冷凍干燥的方法相結合,合成了新型nano2HA2CS多孔支架,并對其進行了理化性質和細胞相容性研究。1材料與方法1.1主要材料與儀器CS(浙江金殼生物化學有限公司,黏均分子量5195×105,脫乙酰度90.75%;

15、KH2PO4、Ca(NO324H2O、N aO H(分析純,天津大學科威公司;HA粉體(四川新津縣馬龍化工廠;2M E M培養(yǎng)基(Gibco公司,美國;胎牛血清(H yclone公司,美國;0.25%胰蛋白酶(Sigm a公司,美國。JS M26700F型掃描電鏡、JE M2100CX 型透射電鏡(JEOL公司,日本; DM A X 2500 PC型X線衍射儀(R igaku公司,日本;FT S3000型傅立葉紅外光譜(B I O2RAD公司,美國。1.2nano2HA2CS復合支架制備按參考文獻6方法,分別稱取一定質量的Ca(NO324H2O、KH2PO4和CS溶解在210%的乙酸溶液中并充

16、分攪拌,最終配成一定濃度和質量比的nano2HA2CS前體溶液(CS濃度,CS2HA理論生成量質量比:CS1.0%,CS2HA11;CS1.0%,CS2HA 12;CS2.0%,CS2HA21;CS2.0%,CS2HA 22;CS3.0%,CS2HA31,離心去氣泡。預先用少量溶液注入模具,在模具內(nèi)沉積一層CS膜;然后用配制的混合液注滿容器,將容器置入410%N aO H溶液中,室溫下反應。10h后將反應所得的凝膠體浸入去離子水,浸泡至中性,除去殘留的N aO H。將清洗后的凝膠體放入-30低溫冰箱預凍6h,然后進行冷凍干燥,制得多孔支架。1.3nano2HA2CS支架材料的物理化學性能表征1

17、.3.1支架形態(tài)學觀察將支架用利刀切開,以顯示內(nèi)部結構,噴金鍍膜后在JS M26700F型掃描電鏡下觀察其微觀形貌,JE M2100CX 型透射電鏡觀察HA晶體顆粒大小和分布。1.3.2支架孔隙率、密度測定采用液體置換法測定7,用量筒量取V1體積的無水乙醇,取一定質量(W的支架浸入其中,反復抽真空至無氣泡逸出,此時量筒讀數(shù)是V2,將含乙醇的支架材料移出后記所剩乙醇體積為V3,支架孔隙率(P可用下式計算:P=(V1-V3 (V2-V3,支架的密度d=W (V2-V3,每種樣品測6個。1.3.3支架化學性質分析DM A X 2500 PC型X 線衍射儀、FT S3000型傅立葉紅外光譜分析材料的組

18、成和結晶結構。1.4細胞相容性實驗1.4.1細胞2支架共培養(yǎng)取大小為5mm×5mm×3mm的nano2HA2CS支架(CS1%,HA2CS11和純CS支架酒精消毒后備用。提取初生W istar大鼠顱成骨細胞(天津利居生物制品供應中心,并進行傳代培養(yǎng)至第3代。細胞匯合后,經(jīng)胰酶消化、培養(yǎng)基稀釋,形成密度為110×105 m l的細胞懸液。取細胞懸液均勻接種于兩種支架上,置于37,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。2M E M+10%胎牛血清培養(yǎng)液每2天更換1次。1.4.2成骨細胞在支架上的細胞黏附率檢測細胞2支架復合物共培養(yǎng)2、4、6、8h,分別在每個時間點取出復合支架和

19、純CS支架各4個樣品,PB S液沖洗3次,用細胞計數(shù)板計算黏附細胞的百分率8。1.4.3細胞形態(tài)觀察將培養(yǎng)5d的樣品經(jīng)過固定、脫水、石蠟包埋、切片、H E染色后,在光鏡下觀察。經(jīng)過2.5%的甲醛固定和1.0%的鋨酸二次固定,梯度酒精逐級脫水,真空干燥、噴金后在掃描電鏡下觀察細胞形態(tài)。1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用方差分析,組內(nèi)兩兩比較采用獨立樣本t檢驗,P值<0105為有統(tǒng)計學意義。2結果2.1nano2HA2CS支架的形態(tài)及孔隙率掃描電鏡觀察復合支架具有多孔結構(圖1ac,孔徑為100500m,大多數(shù)孔徑為4005

20、00m。支架孔內(nèi)無HA晶體聚集,孔壁上有大量細小的HA晶體連續(xù)、均勻分布,猶如“鋪路石”狀緊密鑲嵌在孔壁上(圖1d。支架具有很高的孔隙率,而隨著CS和HA含量的增加,支架的孔壁增厚,孔隙率降低,密度升高,見表1。支架的密度、CS和HA總含量不同的支架,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0105。支架孔隙率比較,支架(CS110%,CS2HA11與支架(CS210%,CS2 HA21;CS210%,CS2HA22;CS210%,CS2HA 31比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0105。透射電鏡觀察,可見大量的HA晶體包裹于CS的基體中,晶體呈球形,直徑為60nm左右,在基體中分散良好(圖2

21、。表1nano-HA-CS支架的密度與孔隙率(n=6,x±sTab.1D en sity and i n terval porosity of the nano-HA-CS scaffolds(n= 6,x±sCS濃度(% Concentrati on of CS(%CS2HA比例CS2HA rati o(WW密度(g c m3D ensity(g c m3孔隙率(%Intervalpo ro sity(%3.0310.091±0.00888.3±4.332.0220.096±0.00987.6±4.232.0210.069±

22、;0.01289.4±7.231.0120.072±0.00690.2±3.21.0110.049±0.00592.9±3.03與支架(CS110%,CS2HA11比較P值<01053Compared w ith the scaffo ld(CS110%,CS2HA11,P<0105 2.2nano2HA2CS支架化學性質分析X線衍射分析見圖3。在復合支架衍射譜中可明顯見到與HA特征衍射峰位置相對應的衍射峰。但與HA 粉末的衍射譜比較,復合支架的衍射峰峰形明顯變寬,峰位重疊。隨CS2HA含量和比例的變化,各衍射峰的強度也不同。在復合

23、支架的紅外光譜中(圖4,除可見HA中PO43-、O H-的特征吸收峰外,在1420c m-1附近還出現(xiàn)了CO32-的吸收峰。而相對于純CS譜圖,CS 酰胺 譜帶(1655c m21和酰胺 譜帶(1596c m21的吸收峰在復合支架的譜圖中向低波數(shù)方向偏移。CS2 HA含量和比例不同的支架特征吸收峰的強度也不同。2.3細胞相容性實驗細胞2支架復合物共培養(yǎng)4、6、8h,成骨細胞在nano2HA2CS復合支架上的黏附率分別為24125%±2188%、35151%±3181%和67163%±3163%,均明顯高于在純CS支架上的黏附率15134%±2181%、2

24、2184%±3102%和46104%±3162%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05。成骨細胞與支架復合培養(yǎng)5d,組織切片H E染色可見梭形的成骨細胞,核為圓形,黏附生長于支架孔內(nèi)(圖5。掃描電鏡觀察可見大量梭形、多角形的成骨細胞黏附于材料表面,另有大量成骨細胞開始分泌纖維狀細胞外基質,包裹于基質中的成骨細胞呈球形(圖6。3討論組織工程的目的是運用生命科學和工程科學的原理和方法,研究、開發(fā)具有修復或改善組織或器官功能的新一代臨床應用取代物,用于替代組織或器官的一部分或全部功能9。骨組織工程為因外傷、骨腫瘤、骨病等造成的骨缺損修復提供了一條新的解決途徑。支架、種子細胞、生物

25、活性因子,是組織工程中的關鍵因素。支架作為種子細胞的細胞外基質,新形成的組織框架,其性質直接影響細胞的黏附、增殖和分化等生物學特性,最終影響組織構建。骨組織工程支架材料的要求:應具有一定機械強度,為新生組織提供支撐;具有一定骨傳導性,有利于臨近正常骨組織爬行替代;具有良好的生物相容性,有利于細胞黏附和生長;具有良好的生物降解性,能隨新骨形成,逐漸被骨組織替代10。結合兩種材料的優(yōu)點,CS2HA復合材料可以更好滿足上述要求。另外,組織工程支架應具有三維多孔結構,一定孔徑孔隙率的支架是細胞與周圍環(huán)境進行營養(yǎng)物質交換,促進骨組織再生、修復的必要條件11。CS2HA 復合材料可以通過冷凍干燥法、粒子瀝

26、濾法等,制備成多孔支架。其中,冷凍干燥法以水為致孔劑,無有機溶劑殘留,且簡單、可控,具有一定的優(yōu)越性。骨是一種復雜的生物礦化體系。生理狀態(tài)的HA 晶體極小,尺度在納米級,以有機質形成的網(wǎng)絡為模板有規(guī)律的沉積,形成連續(xù)的、有支持力的結構12。因此,從仿生學的角度看,應當保持骨組織替代材料中HA在納米狀態(tài)。我們的實驗通過把原位復合與冷凍干燥的方法相結合,解決了傳統(tǒng)方法nano2HA在基體中的分散問題,制備了高孔隙率,大孔nano2HA2CS支架。在原位復合反應中,預先形成的CS膜具有半透膜作用,可以使2O H向內(nèi)緩慢滲透,進而控制CS沉積和HA形成兩個反應有序進行,同時CS可以起到模板的作用指導H

27、A的沉積,最終形成nano2HA分散均勻的復合物凝膠6。再通過預凍、冰晶致孔,冷凍干燥最終制成多孔支架。制備的復合支架保持了很高的孔徑和孔隙率,表明大量HA晶體的形成并未影響支架的孔結構,這有利于氧氣和營養(yǎng)物質的供應、細胞的遷移、增殖和分化1。有機質對礦物質沉積有指導作用,掃描電鏡和透射電鏡可觀察到,復合支架的孔壁上有大量納米級的HA晶體,按CS形成的框架有序沉積,彼此連接,與CS 基體結合緊密,晶體大小與骨組織中的磷灰石類似。nano2HA2CS支架中HA的X線衍射峰峰形變寬,峰位重疊,是因為形成的HA晶粒在納米級,且呈弱結圖1掃描電鏡觀察nano-HA-CS支架的微觀形貌aCS1.0%,C

28、S2HA11(×50bCS1.0%,CS2HA12(×50cCS2.0%,CS2 HA22(×50d支架孔壁上的HA晶體連續(xù)、均勻分布,如“鋪路石”狀(×10k圖2透射電鏡觀察nano-HA-CS支架(CS1.0%,CS-HA 1:1的微觀形貌(×100k圖3nano-HA-CS支架的X線衍射譜圖A:HAB:CS1.0%,CS2HA11C:CS1.0%,CS2HA12D:CS 210%,CS2HA22E:CS2.0%,CS2HA21F:CS3.0%,CS2HA31G:CS圖4nano-HA-CS支架的紅外光譜分析A:CS2.0%,CS2 HA2

29、1B:CS3.0%,CS2HA31C:CS1.0%,CS2HA12D:CS1.0%,CS2HA11E:CSF:CS2.0%,CS2HA22G:HAa:CO32-的吸收峰b:CS酰胺 譜帶和酰胺 譜帶圖5成骨細胞與支架共培養(yǎng)5d的組織切片觀察(HE×400圖6成骨細胞與支架共培養(yǎng)5 d的掃描電鏡觀察(×500F ig.1M icroscop ic morphology of the nano-HA-CS scaffoldaCS110%,CS2HA11(×50bCS110%,CS2HA12(×50cCS 210%,CS2HA22(×50dT he

30、nano2HA crystals distributed on the po re w alls homogeneously and continuously(×10kF ig.2The TE M i m age of the nano-HA-CS scaffold(CS%:1.0%,CS-HA:11,TE M×100kF ig.3The XR D pattern s for the nano-HA-CS scaffoldA:HAB:CS1.0%,CS2HA11C:CS1.0%,CS2HA12D:CS2.0%,CS2HA22E:CS2.0%,CS2HA21F:CS3.0%,

31、CS2HA31G:CS F ig.4The FTIR spectra for the nano-HA-CS scaffoldA:CS2.0%,CS2HA21B:CS3.0%,CS2HA31C:CS1.0%,CS2HA12D: CS110%,CS2HA11E:CSF:CS2.0%,CS2HA22G:HAa:CO32-derived bandsb:Bands of am ide and am ide F ig.5The h istolog ical section observation on the osteoblasts co-cultured with the scaffold for5da

32、ys(HE×400F ig.6The SE M observation on the osteoblasts co-cultured with the scaffold for5days(×500晶狀態(tài)的原因13;紅外光譜中出現(xiàn)的CO32-的吸收峰表明合成的是含碳酸納米晶體14,其特點與骨組織中HA結構類似。復合支架紅外光譜中CS的酰胺 譜帶和酰胺 譜帶向低波數(shù)方向移動表明,在原位復合反應過程中HA和CS兩種分子間產(chǎn)生了化學作用,可能是CS中的2N H2與HA中的2O H之間的氫鍵作用以及2N H2和Ca2+之間的螯合作用引起的15,該作用能使CS基體與HA晶體結合更加牢固

33、,有效限制HA顆粒移位。納米晶體巨大的比表面積,具有晶格缺陷的含CO32-弱結晶體結構,該特點使支架中的nano2HA更易在生理狀態(tài)下溶解,從而提高材料周圍局部的Ca、P 離子濃度,有利于在材料表面形成類骨磷灰石層,而表面形成富Ca2P層和類骨磷灰石層是支架材料植入體內(nèi)后形成骨鍵合的關鍵因素16,17。細胞相容實驗的結果表明,成骨細胞能很好地在復合支架上黏附、增殖,表達細胞功能,比在純CS支架上具有更高的細胞黏附率,更有利于成骨細胞黏附,這些結果可能與以下因素有關:含CO32-弱結晶HA生物相容性好;納米晶體晶 粒細小、數(shù)量多,增加了材料表面的粗糙程度;晶粒表面積巨大,處于晶粒表面的原子多,有

34、利于與細胞黏附相關蛋白的相互作用,從而更有利于成骨細胞黏附18。研究結果表明,采用原位復合與冷凍干燥的方法相結合制備的nano2HA2CS支架,合成的nano2HA與骨結構中的HA結構類似,并可以很好地分散在CS基體中。支架具有較高的孔徑和孔隙率,具有良好的物化性質和細胞相容性,可望應用于骨組織工程。4參考文獻1Karageo rgi ou V,Kap lan D.Po ro sity of3D bi om aterial scaffo lds and o steogenesis.B i om aterials,2005,26(27:547425491.2史德海,蔡道章,周長忍,等.殼聚糖與

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