生物質(zhì)譜在糖蛋白結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

1、生物質(zhì)譜在糖蛋白結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用項(xiàng)目完成人：桑志紅蔡耘項(xiàng)目完成單位：國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心隨著人們對(duì)糖蛋白參與生命活動(dòng)機(jī)理的日益深入了解，對(duì)天然糖蛋白及重組糖蛋白類藥物的分析越來越受到重視。重組糖蛋白類藥物的質(zhì)量控制更是直接關(guān)系到藥物的療效及至人類的健康。九十年代以來，隨著帶有反射功能的基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(nano-ESI-Q-TOF)等具有軟電離方式的現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜以其高靈敏度和強(qiáng)有力的分析混合物的能力，提供了生物大分子的分子量、序列、一級(jí)結(jié)構(gòu)信息以及結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、修飾等方面的信息，使糖基化分析有了重要的進(jìn)展。通常研究糖蛋白

2、的方法是把蛋白鏈上的寡糖切下來，分別研究蛋白部分和寡糖部分的結(jié)構(gòu)，因此無法研究與兩部分共同相關(guān)的結(jié)構(gòu)問題，也不能區(qū)分不同糖基化位點(diǎn)上切下來的寡糖。自90年代初，國(guó)外有人開始用質(zhì)譜法研究糖蛋白的結(jié)構(gòu)，同時(shí)描述了各個(gè)位點(diǎn)的不均一性。我們用建立的現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)研究糖蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，將其應(yīng)用與基因重組糖蛋白的結(jié)構(gòu)分析。為糖蛋白結(jié)構(gòu)分析及基因重組糖蛋白類藥物的質(zhì)量控制提供新的手段。一、生物質(zhì)譜研究糖蛋白結(jié)構(gòu)方法的建立實(shí)驗(yàn)所用儀器為：1德國(guó)BRUKER公司的REFLEXIII型基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，N2激光器，波長(zhǎng)337nm,線性飛行距離150cm,加速電壓2kv。2.英國(guó)Micro

3、mass公司Q-TOF型電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀。源溫80,氣體流速40L/h,槍頭電壓650V,檢測(cè)頻率2.4S,氧氣碰撞池壓力6*10-5mbaio1 .基質(zhì)的選擇，在MALDI-TOF-MS分析中，基質(zhì)起著相當(dāng)重要的作用。不同的基質(zhì)對(duì)不同類的物質(zhì)響應(yīng)不同，U-氟基-4-羥基肉桂酸用于測(cè)定糖蛋白核糖核酸酶B效果相對(duì)較好。2 .糖蛋白分子量的測(cè)定，糖蛋白核糖核酸酶B由124個(gè)氨基酸組成，在34位Asn處連有一個(gè)高甘露糖型N-糖鏈。由于糖鏈的微不均一性，與普通蛋白質(zhì)及核酸不同，其分子離子峰在MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為一簇峰，各峰之間約相差一個(gè)糖基。正是由于這種微不均一性，使得其分子離子峰變

4、寬，靈敏度降低。糖鏈分子量越大，峰越寬，靈敏度越低，所以一般只有糖鏈較短，蛋白的質(zhì)量不太大的糖蛋白才能測(cè)定其平均分子量。用MALDI-TOF可直接測(cè)定糖蛋白核糖核酸酶B的平均分子量為15208.6Da。核糖核酸酶B的MALDI-TOF-M5®G(14879.5、15040.1、15203.0、15381.5、15539.1Da)平均分子量：X=Qi/n=15208.6Da3 .糖含量的測(cè)定，采用O聚糖酶及內(nèi)糖甘鍵酶F分別作用于核糖核酸酶B,只有內(nèi)糖音鍵酶F能夠是其分子量發(fā)生變化，表明核糖核酸酶B分子中不存在O-連接糖鏈存在著N-連接糖鏈。內(nèi)糖甘鍵酶F切斷N-糖鏈五糖核心最內(nèi)側(cè)的Glc

5、NAc-GlcNAc糖甘鍵，得到含一個(gè)GlcNAc的肽鏈，減去GlcNAc,可以計(jì)算出準(zhǔn)確的肽鏈分子量T=13695.6,與糖蛋白平均分子量之差為糖鏈的平均分子量G=1513.4,平均糖含量為：（糖鏈大小/糖蛋白分子量）M00%=9.95%。4 .糖基化位點(diǎn)的確定，研究糖基化類型及糖基化位點(diǎn)的策略：采用蛋白酶酶解與糖甘內(nèi)切酶酶解相結(jié)合的方法，通過酶切前后含糖肽片的位移，結(jié)合網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，可以確定糖基化類型和糖基化位點(diǎn)。以不同類型的糖昔內(nèi)切酶作用于糖蛋白（N-糖昔鍵酶或O-糖昔鍵酶），在MALDITOF-MS上觀察其質(zhì)量的變化，可以直接確定糖蛋白中是否含有響應(yīng)類型的糖鏈，這是我們確定糖蛋白中糖

6、甘鍵類型的基礎(chǔ)。我們采用先將核糖核酸酶B還原烷基化，加Glu-C酶切，產(chǎn)物再用內(nèi)糖甘肩酶F酶切，可觀察到含糖肽段出現(xiàn)位移，將核糖核酸酶B的肽質(zhì)量指紋圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，證實(shí)發(fā)生位移的肽段中含有N-糖鏈特異連接位點(diǎn)，由此確定34位Asn為糖基化位點(diǎn)。另外我們采用內(nèi)糖昔鍵酶F及肽-N-聚糖酶F兩種酶進(jìn)行差位酶切法對(duì)含糖肽段進(jìn)行驗(yàn)證，兩種酶酶切后分子離子峰的差值除以GlcNAc的質(zhì)量，結(jié)果就是N-糖基化位點(diǎn)的個(gè)數(shù)5 .質(zhì)譜測(cè)定氨基酸序列，我們對(duì)核糖核酸酶B肽質(zhì)量指紋譜中的含糖肽段進(jìn)行了串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，首先在一級(jí)質(zhì)譜圖中選擇離子4972.23，在串聯(lián)質(zhì)譜的碰撞活化室以氬氣與其碰撞產(chǎn)生碎片，從碎片的質(zhì)荷比推

7、算出此肽片中的一段氨基酸序列，檢索結(jié)果為核糖核酸酶B,從而判斷其理論序列是否一致。6 .糖鏈結(jié)構(gòu)的研究，凝集素對(duì)糖肽的親和提取，進(jìn)一步分析糖肽序列及糖鏈結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵是含糖肽段的提取。核糖核酸酶B中糖鏈為高甘露糖型，我們選用對(duì)其有特異性吸附的伴刀豆球蛋白對(duì)其進(jìn)行提取利用這種簡(jiǎn)捷的親和質(zhì)譜的方法，對(duì)糖肽段進(jìn)行了分析。建立了親和質(zhì)譜分析糖肽類物質(zhì)的方法，為今后糖肽序列分析及糖鏈結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。二、基因重組糖蛋白人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）的結(jié)構(gòu)分析。利用以上建立的方法，我們對(duì)樣品重組人促紅細(xì)胞生成素進(jìn)行了分析，斷定此樣品為非完全糖基化，樣品中只存在N-連接的糖鏈，無O-糖鏈。應(yīng)用酶切法用肽-N-聚糖酶處理后，得到兩個(gè)含糖肽段，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，測(cè)得38位及83位為N-糖基化位點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符，結(jié)果可靠。因此，該項(xiàng)課題為糖蛋白結(jié)構(gòu)分析及基因重組糖蛋白類藥物的質(zhì)量控