菌種分離篩選ppt課件

1、第六章第六章 微生物菌種的分離篩選微生物菌種的分離篩選第一節(jié)第一節(jié) 菌種分離的總體設(shè)計(jì)菌種分離的總體設(shè)計(jì)第二節(jié) 分離樣本的采樣采樣第三節(jié)第三節(jié) 含微生物樣品的富集培養(yǎng)含微生物樣品的富集培養(yǎng)第四節(jié)第四節(jié) 微生物的培養(yǎng)分離微生物的培養(yǎng)分離1.第一節(jié)第一節(jié) 菌種的分離簡(jiǎn)介菌種的分離簡(jiǎn)介 一、菌種的來(lái)源一、菌種的來(lái)源 根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門(mén)索取或購(gòu)買(mǎi)； 從大自然中分離篩選新的微生物菌種。 2二、分離思路二、分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類(lèi)微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來(lái)。 實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，

2、也必須重新進(jìn)行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。3 定方案：定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性。 采樣：采樣：有針對(duì)性地采集樣品。 增殖：增殖：人為地通過(guò)控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。 分離：分離：利用分離技術(shù)得到純種。 發(fā)酵性能測(cè)定：發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營(yíng)養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長(zhǎng)和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟三、新種分離與篩選的步驟4菌種篩選主要步驟 調(diào)查研究及查閱充分的資料 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案 確定

3、采集樣品的生態(tài)環(huán)境 采樣 確定特定的增殖條件 增殖培養(yǎng) 確定特殊的選擇培養(yǎng)基及可能的 定性或半定量快速檢出法 平板分離分離 5 原種斜面 確定發(fā)酵培養(yǎng)基礎(chǔ)條件 篩選 初篩（1株1瓶） 復(fù)篩（1株35瓶） 結(jié)合初步工藝條件摸索 再?gòu)?fù)篩（1株35瓶） 35株 單株純種分離分離 生產(chǎn)性能試驗(yàn) 毒性試驗(yàn)菌種鑒定6 第二節(jié) 分離樣本的采樣采樣1、采樣對(duì)象 以采集土壤為主。 一般園田土和耕作過(guò)的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長(zhǎng)區(qū)和果園內(nèi)。 采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。7從自然界篩選從自然界篩選8 2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不

4、多的秋初為好。 3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類(lèi)型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。9 二 根據(jù)微生物生理特點(diǎn)采樣1、根據(jù)微生物營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型2、根據(jù)微生物生理特性10 三 特殊環(huán)境下采樣11第三節(jié)第三節(jié) 含微生物樣品的富集培養(yǎng)含微生物樣品的富集培養(yǎng) 為了容易分離到所需的菌種，讓無(wú)關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過(guò)配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來(lái)控制。一、控制培養(yǎng)基的成分 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖

5、維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng)，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多。12 二、控制培養(yǎng)條件pH值的控制細(xì)菌、放線菌：pH 7.07.5酵母菌、真菌：pH 6.57.0溫度的控制通氣量的控制13 三 抑制不需要的菌類(lèi) 如使用不同類(lèi)型的抗生素、高溫、高壓等條件，抑制不需要的菌類(lèi)。14第四節(jié)第四節(jié) 微生物的培養(yǎng)分離微生物的培養(yǎng)分離 盡管通過(guò)增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋

6、分離法。151.稀釋平皿分離法1.稀釋平皿分離法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 釋161.稀釋平皿分離法b.涂布平皿分離法a.傾注平皿分離法172.平皿劃線分離法 a. 連續(xù)劃線分離法 b. 分區(qū)劃線分離法18（四）篩（四）篩 選選 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過(guò)三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。19（五）毒性試驗(yàn)（五）毒性試驗(yàn) 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)

7、有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無(wú)須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過(guò)兩年以上的毒性試驗(yàn)。20培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離 從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。 到目前為止，還沒(méi)有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個(gè)試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類(lèi)。 在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類(lèi)的菌株；在工業(yè)微生物篩選過(guò)程中，應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測(cè)方法，以與各種不同類(lèi)型的生長(zhǎng)和代謝之微生物相適應(yīng)。 因此，建立一更為科學(xué)的和針對(duì)性不強(qiáng)的分離方法是必要的。 21一、成功的分離培養(yǎng)方法一、成功的分離培養(yǎng)方法(1)認(rèn)真考察所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過(guò)程；(2)制訂初

8、步的篩選標(biāo)準(zhǔn)；(3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過(guò)程。22三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點(diǎn)的一般思路要點(diǎn) 1羅列出所要分離的微生物類(lèi)群； 2根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù)，描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地： 3將若干樣本分成若干類(lèi)型，如植物和植物各部，土壤(類(lèi)型和土層)、巖石、水、昆蟲(chóng)和發(fā)酵食品等； 4羅列出所要考察和測(cè)量的環(huán)境參數(shù)，如pH、鹽分、水分、氧化還原電勢(shì)及溫度等；23 5列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠； 6根據(jù)上述1-5項(xiàng)中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件；

9、 7用標(biāo)準(zhǔn)方法作對(duì)照來(lái)評(píng)價(jià)生態(tài)學(xué)分離方法； 8根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法； 9運(yùn)用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類(lèi)群。24四、自然界中細(xì)菌的分離四、自然界中細(xì)菌的分離25 (一一)采樣和采集方法采樣和采集方法 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時(shí)，必須十分重視樣本的采集。 樣本采集時(shí)所需的工具通常有無(wú)菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無(wú)菌小塑料袋和塑料瓶等。26采樣的注意事項(xiàng)采樣的注意事項(xiàng)1、采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對(duì)無(wú)菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類(lèi)及采集

10、日期、地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素，因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的；27 5、采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4下，但貯存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來(lái)的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會(huì)發(fā)生變化，微生物群體之間就會(huì)出現(xiàn)消長(zhǎng)28( (二二)生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基的組成原則的組成原則1、加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類(lèi)和用量、環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類(lèi)。2、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基

11、中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。293、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50gm1， 以抑制真菌的生長(zhǎng)。4、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37培養(yǎng)箱中孵育l、2天。5、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。30二、分離分離 目的微生物不純，需分離分離純化。采用簡(jiǎn)便迅速，有一定準(zhǔn)確性的檢出方法，提高篩選效率。常用平皿反應(yīng)法： 紙片培養(yǎng)顯色法：浸有指示劑濾紙。 透明圈透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。生長(zhǎng)圈法：利用某些具有特殊

12、營(yíng)養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，要分離分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)而合成該營(yíng)養(yǎng)物而使工具菌能生長(zhǎng)，形成生長(zhǎng)圈。抑制圈法：瓊脂塊培養(yǎng)法。31用剛果紅染色法鑒定篩選降解纖維素的菌株 羧甲基纖維素鈉作培養(yǎng)物抗生素篩選檢定菌培養(yǎng)，加上發(fā)酵液32五、放線菌的分離培養(yǎng)基的組成原則五、放線菌的分離培養(yǎng)基的組成原則 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。 選擇性地添加抗生素。 分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37培養(yǎng)箱中存放3天。33放

13、線菌的分離放線菌的分離 土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無(wú)菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。 植物體上放線菌的分離：無(wú)菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類(lèi)增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過(guò)濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。34次代培養(yǎng)及純化次代培養(yǎng)及純化 菌落形成后可根據(jù)肉眼可見(jiàn)的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。 通過(guò)高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營(yíng)養(yǎng)孢子形成情況。 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識(shí)別不同

14、的生長(zhǎng)形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時(shí)顯得尤為重要。 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無(wú)菌牙簽挑取，點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。35放線菌菌落形態(tài)36六六、真菌分離1、利用低碳氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長(zhǎng)菌落分散，利于計(jì)數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營(yíng)養(yǎng)成分的減少而使生長(zhǎng)減慢，并由此限制真菌的遷徙生長(zhǎng)。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離。3、有時(shí)，真菌子實(shí)體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮。374、選擇性富集：是通過(guò)一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。 富集可以是種水平的，如通過(guò)營(yíng)養(yǎng)要求的改變來(lái)富集分

15、離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落形成。38真菌的分離方法真菌的分離方法 土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過(guò)篩法，庶糖密度梯度離心法。 植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。 水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集。 子實(shí)體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實(shí)體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無(wú)菌濾紙上培養(yǎng)。39微生物菌種分離實(shí)例微生物菌種分離實(shí)例分解纖維素的微生物

16、的分離 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?從土壤中分離能分解纖維素的微生物,純化得到1-5株菌.并通過(guò)此次實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)以下三方面的能力: 1.基本技術(shù)訓(xùn)練：在目前專(zhuān)業(yè)課程學(xué)習(xí)基礎(chǔ)上進(jìn)一步練習(xí)培養(yǎng)基的配制，干濕熱滅菌，以及微生物分離純化技術(shù)。 2.初步的科研訓(xùn)練：練習(xí)科研過(guò)程中查閱資料、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案、動(dòng)手實(shí)施方案、綜合安排實(shí)驗(yàn)、解決臨時(shí)實(shí)際困難等方面的基本能力，認(rèn)識(shí)科研程序，感受科研樂(lè)趣和困難。 3.培養(yǎng)實(shí)事求是的工作作風(fēng)，科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度。40實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理纖維素與纖維素酶纖維素與纖維素酶 纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為至少包含三部分，C1,Cx,和葡萄糖苷酶組成。前兩種使纖維素分解成纖維二糖，第三種將纖維

17、二糖分解成葡萄糖，正是在這三種酶的協(xié)同作用下，纖維素最終被分解成葡萄糖，為微生物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。41 纖維素分解菌的篩選纖維素分解菌的篩選 纖維素-剛果紅混合培養(yǎng)基42剛果紅染色法剛果紅染色法 常用的剛果紅染色法有兩種：一是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，二是倒平板時(shí)就加剛果紅。 方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點(diǎn)是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。 方法二的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，不存在菌落混雜問(wèn)題，缺點(diǎn)是由于實(shí)驗(yàn)材料和瓊脂都含有淀粉類(lèi)物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊,無(wú)

18、明顯影響.方法二的另一缺點(diǎn)是：有些微生物具有降解色素的能力，它們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。短時(shí)間培養(yǎng)也無(wú)大礙。431.實(shí)驗(yàn)材料及方法實(shí)驗(yàn)材料及方法1.1 樣品：樣品： 從校園找到的竹子下的土壤、松樹(shù)下的土壤、混合土；熊貓糞；牛糞。1.2 實(shí)驗(yàn)所用的器材實(shí)驗(yàn)所用的器材： 培養(yǎng)皿，250mL錐形瓶，無(wú)菌稱(chēng)量瓶，濾紙，藥匙、1 mL和10 mL的移液管、電子秤、無(wú)菌培養(yǎng)皿、涂布器、解剖鏡、顯微鏡、接種針、溫箱等441.3 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基配方及配制注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基配方及配制注意事項(xiàng)1.3.1、選擇培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基: 纖維素分解細(xì)菌-赫奇遜培養(yǎng)基: CM

19、C, KH2PO41.0g、MgSO47H2O 0. 3g、NaCl0.1g、FeCl30.01g、NaNO32.5g、水1000mL、pH7. 2 7. 4 、瓊脂20g、剛果紅. 纖維素分解放線菌培養(yǎng)基: CMC、KNO3 1. 00 g、KH2PO4 0. 50 g、MgSO4 7H2O 0. 50 g、N aCl 0. 50 g、 10%FeSO 4 2滴、H2O 1000 mL、pH 7. 2 7. 4 、瓊脂 20g、剛果紅.45 纖維素分解真菌真菌培養(yǎng)基: CMC、馬鈴薯200g KH2PO 4 3. 00 g、MgSO47H2O1.50 g、蛋白胨0. 50 g、VB12 丸、瓊脂20. 00 g、H2O 1000 mL、pH 6. 0 6. 5 、瓊脂 20g。 纖維素分解菌（混合）的選擇培養(yǎng)基: 纖維素粉 5g、NaNO3 1g、Na2HPO3 1.2g、KH2PO3 0.9g、MgSO4 0.5g、KCl 0.5g、酵母膏0.5g、水解酪素0.5g、以上物質(zhì)溶解后蒸餾水定容到1