基因敲除細胞系：設計gRNA高效KO-以及避免蛋白殘留

1、基因敲除細胞系：如何設計gRNA高效KO，以及避免蛋白殘留 源井生物基因組編輯是一種理想的研究基因功能的方法。它可以精確地識別和定位基因組中的特定序列，然后改變目標序列以達到各種目的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于其簡單的機制已經(jīng)成為當今世界基因組編輯的代名詞。其中基因敲除是目前CRISPR/Cas9最常見的應用。在CRISPR/Cas9介導的基因敲除實驗中，Cas9核酸酶在gRNA的指引下，打靶目的基因，并產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（DSB）。由于DSB的不完全修復而產(chǎn)生插入和缺失（indels），引起移碼突變，導致終止密碼子提前，實現(xiàn)編碼基因敲除的目的。在CRISPR/Cas9實驗中，g

2、RNA的選擇將很大程度上影響項目的成功率。在選擇gRNA的時候，有幾個因素可以幫助大家選取有效的gRNA以產(chǎn)生成功的敲除：1）預測gRNA效率；2）選擇脫靶風險低的gRNA；3）同時使用多個gRNA以提高敲除效率。在編碼基因敲除實驗中， DNA水平驗證KO結果是首要的，此外，蛋白質水平的驗證也非常關鍵。蛋白水平的驗證通常是通過Western Blot實現(xiàn)的，但以下這兩種現(xiàn)象，有可能導致截短蛋白仍然表達，從而致使WB驗證時出現(xiàn)陽性情況。(1) 基因產(chǎn)生移碼突變后，下游ATG密碼子有可能啟動翻譯，從而導致蛋白表達?；蛘呶挥谝拼a突變上游的外顯子翻譯表達，產(chǎn)生N末端截短蛋白。(2) 

3、;細胞跳過被編輯的外顯子翻譯表達，產(chǎn)生內部序列缺失的蛋白質異構體。圖1: 抗INDEL效應導致CRISPR基因敲除實驗失敗的細胞機制翻譯重新啟動CRISPR介導的基因敲除通常是通過Cas9產(chǎn)生dsDNA斷裂來實現(xiàn)的：在切割之后，非同源末端連接（NHEJ）的易出錯性質會導致在切割位點有一個或多個核苷酸的插入或缺失（indels），從而引起移碼突變，終止密碼子提前，并產(chǎn)生無義介導的降解(NMD)， 從而完全敲除基因。因此打靶位點常常選擇盡量靠近開放閱讀框（ORFs）5端。然而，這個策略往往會忽略ORF內的存在ATG啟動另一個ORF并翻譯成截短型蛋白的可能。已經(jīng)有不少文章報道過這種非法翻譯（ITL）

4、蛋白，它是與人類疾病相關的遺傳因素。因此，基因編輯介導的閱讀框外的突變可能會導致非法翻譯，從而表達可被抗體識別的截短型蛋白質。圖2: 翻譯重新啟動的機制外顯子跳躍最近，Mu等人報道，利用CRISPR和單個sgRNA，在細胞系中打靶外顯子，可以通過以下兩種機制產(chǎn)生外顯子跳躍：第一種是在突變的前體mRNA剪接過程中發(fā)生的；第二種是由于基因缺失導致多個外顯子和其余外顯子剪接。已知跳躍多個外顯子的機制是：基因缺失后，完整的外顯子被剪接。更復雜和令人關注的是，只有一到幾個核苷酸的突變才會導致前體mRNA剪接過程中外顯子跳躍。除了內含子-外顯子邊界的剪接位點外，外顯子還包含對剪接效率起積極或消極作用的序列

5、。外顯子內起正作用的元件，稱為外顯子剪接增強子（ESEs），與識別增強剪接機制的因子結合。起負作用的元件稱為剪接沉默子（ESSs），它被認為是抑制廢置剪接位點的使用。因此，我們可以假設indel通過破壞ESE或偶然引入ESS來促進外顯子跳躍。這些機制將造成被打靶外顯子缺失的截短型ORF的表達，從而干擾WB驗證結果及后續(xù)功能實驗。圖3: 外顯子跳躍的機制那我們該怎么做？對KO實驗進行嚴格的質量控制是十分重要的，以確保構建的基因敲除細胞不包含隱藏的“驚喜”。理想情況下，我們可以事先預測如何打靶一個基因來避免外顯子跳過的問題。在設計KO項目之前，可以做以下實驗，以幫助制定避免上述蛋白殘留的問題的打靶

6、策略。1. 具有跳躍能力，如果有，則測定蛋白質編碼潛能。例如，分別設計引物，識別位于潛在跳躍外顯子上下游的外顯子，以及目的外顯子，通過比較RT-qPCR結果，我們將能夠判斷是否發(fā)生了外顯子跳躍，以及它是否會影響基因敲除結果。2. 翻譯形式檢測。在抗體特異性很高的前提下，WB結果中如果出現(xiàn)預期的條帶，以及在不同分子量（MW）處有其它雜帶，這表明這個基因存在蛋白質異構體。根據(jù)大小，并結合上述RT-PCR結果，可初步判斷編碼異構體的ORF。結合質譜分析則可以進一步確認異構體的存在及來源ORF的構成。如何設計有把握的gRNA？在設計gRNA時，除了常規(guī)的參數(shù)（靶向效率和脫靶效應），

7、應根據(jù)數(shù)據(jù)庫、文獻、上述qPCR、WB等檢測結果來判斷靶基因的潛在的多個轉錄本、ORF、起始密碼子位置、外顯子大小和是否不對稱外顯子，來選擇要打靶的位點或區(qū)域。比如，如果存在截短型ORF及非法翻譯，則大靶位點應該保證同時會破壞這些ORF；如果存在外顯子跳躍，則應該避開靶向被條約的外顯子；如果因為存在多個ORF、外顯子跳躍而無法設計有效的移碼策略，則應該考慮采用大片段敲除或直接破壞啟動子等策略進行敲除。總之，CRISPR技術的正確使用始終取決于仔細的實驗設計、執(zhí)行和分析。為一個實驗選擇gRNA需要平衡最大化打靶效率和最小化脫靶效應，同時想獲得無蛋白殘留的KO細胞，則必須在gRNA設計階段綜合考慮

8、各種因素，確認最優(yōu)方案。源井生物專注基因編輯細胞技術服務，擁有自主研發(fā)的gRNA設計系統(tǒng) “紅棉CRISPR基因編輯系統(tǒng)”，此外專業(yè)的技術團隊幫助科研工作者設計完備的基因敲除解決方案。我們已幫助科研一線工作者在100多種細胞系上進行基因編輯。根據(jù)經(jīng)驗積累和數(shù)據(jù)分析，現(xiàn)推出5000個保證WB驗證無誤的基因敲除服務。Reference:Biological plasticity rescues target activity in CRISPR knockouts. Nature methods (2019), 16(11):1087-1093.Low Incidence of Off-Targe

9、t Mutations in Individual CRISPR-Cas9 and TALEN Targeted Human Stem Cell Clones Detected by Whole-Genome Sequencing. Cell Stem Cell (2014),15:2730.Agreement between two large pan-cancer CRISPR-Cas9 gene dependency data sets. Nat Commun (2019), 10(1):5817.Unexpected consequences: exon skipping caused by