聚合酶鏈式反應PCR實驗報告

1、；實驗二聚合酶鏈式反應（PCR）一、實驗原理聚合酶鏈式反應（ PCR）是利用 DNA片段旁側兩個短的單鏈引物，在體外快速擴增特異 DNA片段的技術。它應用熱穩(wěn)定的聚合酶，通過雙鏈 DNA模板的熱變性、引物退火和引物延伸的重復循環(huán)， DNA片段以指數(shù)方式增加了百萬倍。從非常微量的 DNA甚至單個細胞所含有的 DNA起始，可產生 ug 量的 PCR產物。二、器材與試劑1. 器材：移液器， EP 管，熱蓋 PCR儀，電泳儀，量筒，錐形瓶，微波爐，電子天平，紫外照色儀2. 試劑：引物，模板，Taq DNA聚合酶，原料（dNTPs），緩沖液與 Mg2+，H2O, 2*PCRmix溶液， DNA染料三、實

2、驗步驟PCR反應體系的建立取離心管，依次加入試劑混勻1H2O12l2模板1l3引物 T71 l4引物 sp61l52*PCRmix15 lPCR儀的熱循環(huán)反應把離心管放入 PCR儀中，由變性 - 退火 - 延伸三個基本反應步驟構成1. 模板 DNA的變性：模板 DNA經加熱至 94左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經 PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；2. 模板 DNA與引物的退火 ( 復性 ) ：模板 DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至 56 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結合；3. 引物的延伸：經加熱至 72左右 DNA模板

3、- 引物結合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應原料， 靶序列為模板， 按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復該循環(huán) 30 次，每次需要 2-3 分鐘。電泳檢測結果擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中， 電泳結束后， 放到紫外照射儀中進行透射， 電泳明膠顯示清晰的條帶，如下圖所示 加入的為 1 號樣，出現(xiàn)在 500bp 左右條帶，而預算結果為擴增出 492bp 條帶，故實驗成功。.；四、討論1. Mg2+離子濃度對 PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低 PCR擴增的特 異性濃度過低則影響 PCR擴增產量甚至使 PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

4、2. 變性溫度低， 變性時間短， 極有可能出現(xiàn)假陰性 ; 退火溫度過低， 可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。3. EB：溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖中的 DNA，可與 DNA結合，用標準 302nm 紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號。4. 溴酚藍：電泳指示劑，相當于 300bp 的 DNA的電泳速度。5.100bp DNA Marker是由單獨的 PCR擴增產物混合而成，已含有 1xLoading Buffer, 可以直接電泳。包括 11 條雙鏈 DNA片斷：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp 和 1500bp。特異性加強 500bp。每次上樣 4 5 L。6. 模板一般采用 50ng-1ug 或 102-105 拷貝，濃度過高反而會抑制反應的進行。7. 引物的與模板的互補程度決定了 PCR的特異性，常用 0.1 0.5uM，濃