β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定法【PPT】

1、2022-2-131 第一節(jié) -內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)v一、定義一、定義 -內(nèi)酰胺類抗生素（內(nèi)酰胺類抗生素（-lactam antibiotics）系指）系指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括臨床最常用的青霉素（臨床最常用的青霉素（penicillins）與頭孢菌素）與頭孢菌素（cephalosporin），以及近年開(kāi)發(fā)的頭霉素類、），以及近年開(kāi)發(fā)的頭霉素類、硫霉素類、單環(huán)硫霉素類、單環(huán)-內(nèi)酰胺類等其他非典型內(nèi)酰胺類等其他非典型-內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺類抗生素。類抗生素。 系對(duì)藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。系對(duì)藥品中分子量大于藥物本身的雜

2、質(zhì)的總稱。其分子量一般在其分子量一般在10005000，個(gè)別可至約，個(gè)別可至約10000道道爾頓，小于化工、生化領(lǐng)域中所指的高分子化合物爾頓，小于化工、生化領(lǐng)域中所指的高分子化合物的分子量。的分子量。 2022-2-132-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)v二、分類及來(lái)源二、分類及來(lái)源 按其來(lái)源分為兩類：外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性按其來(lái)源分為兩類：外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì)。雜質(zhì)。 外源性雜質(zhì)：包括外源性雜質(zhì)：包括蛋白蛋白、多肽多肽、多糖等類、多糖等類雜質(zhì)或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的結(jié)合雜質(zhì)或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的結(jié)合物。一般來(lái)源于發(fā)酵工藝，如青霉素中的青物。一般來(lái)源于發(fā)酵工藝，如青霉素中的青霉噻唑蛋

3、白、青霉噻唑多肽等。霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。2022-2-133v內(nèi)源性雜質(zhì)：抗菌藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合內(nèi)源性雜質(zhì)：抗菌藥物自身聚合產(chǎn)物。聚合物即可來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程，又可在儲(chǔ)存中形成，物即可來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程，又可在儲(chǔ)存中形成，甚至在用藥時(shí)使用不當(dāng)也可產(chǎn)生。甚至在用藥時(shí)使用不當(dāng)也可產(chǎn)生。v抗生素聚合物的抗生素聚合物的免疫原性免疫原性通常較弱，但作為通常較弱，但作為多價(jià)多價(jià)半抗原半抗原，可引發(fā)，可引發(fā)速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。 免疫原性免疫原性(immunogenicity)：抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生：抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。免疫應(yīng)答，誘生抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。抗原性抗

4、原性(antigenicity)：抗原與其誘生的抗體或致：抗原與其誘生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞有特異性結(jié)合的能力。也寫作反應(yīng)原性。敏淋巴細(xì)胞有特異性結(jié)合的能力。也寫作反應(yīng)原性。 完全抗原：同時(shí)具備完全抗原：同時(shí)具備2個(gè)性質(zhì)。天然的蛋白質(zhì)都是完個(gè)性質(zhì)。天然的蛋白質(zhì)都是完全抗原。全抗原。半抗原半抗原(hapten)：只有抗原性而沒(méi)有免疫原性的物質(zhì)，：只有抗原性而沒(méi)有免疫原性的物質(zhì)，即只能與抗體結(jié)合，卻不能單獨(dú)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)，即只能與抗體結(jié)合，卻不能單獨(dú)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)，稱為半抗原。一般分子量較小，如化學(xué)藥物。半抗原稱為半抗原。一般分子量較小，如化學(xué)藥物。半抗原+載體載體(carrier)完全抗原

5、完全抗原 。 速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)是一種常見(jiàn)的過(guò)敏反應(yīng)，主要速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)是一種常見(jiàn)的過(guò)敏反應(yīng)，主要為呼吸道過(guò)敏反應(yīng)、消化道過(guò)敏反應(yīng)、皮膚過(guò)為呼吸道過(guò)敏反應(yīng)、消化道過(guò)敏反應(yīng)、皮膚過(guò)敏反應(yīng)以及過(guò)敏性休克。敏反應(yīng)以及過(guò)敏性休克。隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高，目前隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高，目前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，對(duì)產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，對(duì)內(nèi)源性聚合內(nèi)源性聚合物物的控制是當(dāng)前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的控制是當(dāng)前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的重點(diǎn)。的重點(diǎn)。2022-2-134圖1 水溫引起阿莫西林干糖漿中高分子雜質(zhì)含量的變化2022-2-135-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)v三、形成機(jī)理及結(jié)

6、構(gòu)特征三、形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)特征v（一）青霉類抗生素：高分子雜質(zhì)有蛋白（多肽）（一）青霉類抗生素：高分子雜質(zhì)有蛋白（多肽）類雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)兩大類。類雜質(zhì)和聚合物雜質(zhì)兩大類。2022-2-136v青霉噻唑多肽：青霉噻唑多肽： 制劑中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在制劑中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在35002400道爾頓左右，有青霉素的道爾頓左右，有青霉素的-內(nèi)酰內(nèi)酰胺環(huán)和多肽的伯氨基按親核反應(yīng)機(jī)理胺環(huán)和多肽的伯氨基按親核反應(yīng)機(jī)理縮合縮合而而成，主要發(fā)生在成，主要發(fā)生在發(fā)酵工藝發(fā)酵工藝中。樣品在儲(chǔ)存過(guò)中。樣品在儲(chǔ)存過(guò)程中，多肽類雜質(zhì)殘留的自由氨基仍與程中，多肽類雜質(zhì)殘留的自由氨基仍與-內(nèi)內(nèi)酰胺反

7、應(yīng)，直至被飽和，反應(yīng)速度和樣品本酰胺反應(yīng)，直至被飽和，反應(yīng)速度和樣品本身的身的水分含量水分含量及及儲(chǔ)存溫度儲(chǔ)存溫度有關(guān)。有關(guān)。2022-2-137青霉噻唑蛋白的基本結(jié)構(gòu)青霉噻唑蛋白的基本結(jié)構(gòu)青霉素青霉素G內(nèi)酰胺環(huán)斷裂點(diǎn)內(nèi)酰胺環(huán)斷裂點(diǎn)2022-2-138v青霉素聚合物：青霉素聚合物： 1.反應(yīng)僅和母核結(jié)構(gòu)有關(guān)，側(cè)鏈中的活性基反應(yīng)僅和母核結(jié)構(gòu)有關(guān)，側(cè)鏈中的活性基團(tuán)不參與反應(yīng)。團(tuán)不參與反應(yīng)。 一分子青霉素首先開(kāi)環(huán)，形成一新的活性一分子青霉素首先開(kāi)環(huán)，形成一新的活性位點(diǎn)，并與另一分子青霉素聚合。位點(diǎn)，并與另一分子青霉素聚合。 2.側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng)側(cè)鏈參與的聚合反應(yīng) 主要以氨芐青霉素為代表，反應(yīng)時(shí)側(cè)鏈

8、上主要以氨芐青霉素為代表，反應(yīng)時(shí)側(cè)鏈上的氨基親核攻擊的氨基親核攻擊-內(nèi)酰胺抗生素的內(nèi)酰胺抗生素的羰基碳原羰基碳原子子，形成聚合物。，形成聚合物。 2022-2-139v頭孢菌素：頭孢菌素中的高分子雜質(zhì)主要是頭孢菌素：頭孢菌素中的高分子雜質(zhì)主要是不同類型的聚合物。不同類型的聚合物。 1.只與母核結(jié)構(gòu)有關(guān)的只與母核結(jié)構(gòu)有關(guān)的N型聚合反應(yīng)型聚合反應(yīng) eg. 頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮等頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢哌酮等 2.側(cè)鏈參與的側(cè)鏈參與的L型聚合反應(yīng)。型聚合反應(yīng)。 eg. 頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻肟等頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻肟等 在堿性條件下，兩種反應(yīng)都可以發(fā)生。在堿性條件下，兩種反應(yīng)都可以

9、發(fā)生。2022-2-1310-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)v四、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)四、結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 高度的不均一性和不確定性。高度的不均一性和不確定性。 1.青霉噻唑多肽（蛋白）類雜質(zhì)青霉噻唑多肽（蛋白）類雜質(zhì) 發(fā)酵中產(chǎn)生的任何蛋白及蛋白碎片都可能發(fā)酵中產(chǎn)生的任何蛋白及蛋白碎片都可能帶入到產(chǎn)品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可帶入到產(chǎn)品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可以結(jié)合不同數(shù)目的藥物分子。以結(jié)合不同數(shù)目的藥物分子。2022-2-1311v2.聚合物類雜質(zhì)：青霉素、頭孢菌素不僅能聚合物類雜質(zhì)：青霉素、頭孢菌素不僅能形成聚合度不同的聚合物，許多樣品還能同形成聚合度不同的聚合物，許多樣品還能

10、同時(shí)發(fā)生時(shí)發(fā)生不同機(jī)理不同機(jī)理的聚合反應(yīng)。的聚合反應(yīng)。v3.形成的聚合物可發(fā)生不同程度的分（降）形成的聚合物可發(fā)生不同程度的分（降）解反應(yīng)，如開(kāi)環(huán)等。解反應(yīng)，如開(kāi)環(huán)等。v4.對(duì)以異構(gòu)體形式存在的樣品，同聚和異聚對(duì)以異構(gòu)體形式存在的樣品，同聚和異聚反應(yīng)可同時(shí)發(fā)生。反應(yīng)可同時(shí)發(fā)生。v5.實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)高分子雜質(zhì)的種類及數(shù)量和實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)高分子雜質(zhì)的種類及數(shù)量和生生產(chǎn)工藝產(chǎn)工藝密切相關(guān)，如氨芐西林鈉，溶媒法和密切相關(guān)，如氨芐西林鈉，溶媒法和噴霧干燥法的高分子雜質(zhì)具有不同的特異性，噴霧干燥法的高分子雜質(zhì)具有不同的特異性，且二者的聚合物含量明顯不同。且二者的聚合物含量明顯不同。凍干粉凍干粉二聚物二聚物溶媒粉溶

11、媒粉二聚物二聚物2022-2-1312-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)v五、影響聚合物形成的因素五、影響聚合物形成的因素 1.青霉素的聚合物青霉素的聚合物 青霉素的聚合反應(yīng)速度在溶液條件下和溶青霉素的聚合反應(yīng)速度在溶液條件下和溶液的液的酸堿度酸堿度關(guān)系密切；在固體條件下主要和關(guān)系密切；在固體條件下主要和樣品的樣品的水分含量水分含量有關(guān)。有關(guān)。 2022-2-1313v2.頭孢菌素的聚合物頭孢菌素的聚合物 固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與固體狀態(tài)下頭孢菌素類產(chǎn)品聚合速度與含含水量水量和和貯存溫度貯存溫度的關(guān)系密切。的關(guān)系密切。 貯存溫度較低時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含貯存

12、溫度較低時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量盡管有影響，但影響不大；但當(dāng)貯存溫度量盡管有影響，但影響不大；但當(dāng)貯存溫度上升至上升至37時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量的時(shí)，含水量差異對(duì)聚合物含量的影響十分顯著。影響十分顯著。2022-2-1314-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)v六、口服青霉素類藥物使用前進(jìn)行皮試的必六、口服青霉素類藥物使用前進(jìn)行皮試的必要性要性 口服青霉素類抗生素在國(guó)內(nèi)外均有過(guò)敏反口服青霉素類抗生素在國(guó)內(nèi)外均有過(guò)敏反應(yīng)報(bào)道，但其原因未有試驗(yàn)報(bào)道。有相關(guān)報(bào)應(yīng)報(bào)道，但其原因未有試驗(yàn)報(bào)道。有相關(guān)報(bào)道，在青霉素道，在青霉素V聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引聚合物可經(jīng)胃腸道吸收而引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。因此，在口服青霉素

13、類抗生素發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。因此，在口服青霉素類抗生素前，必須進(jìn)行皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，這是十分必要前，必須進(jìn)行皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，這是十分必要的。的。2022-2-1315-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)v七、抗生素高分子雜質(zhì)的質(zhì)控意義七、抗生素高分子雜質(zhì)的質(zhì)控意義 1. -內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)是引發(fā)內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)是引發(fā)臨床臨床速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原；的過(guò)敏原； 2.高分子雜質(zhì)經(jīng)注射和口服都可引起過(guò)敏反高分子雜質(zhì)經(jīng)注射和口服都可引起過(guò)敏反應(yīng)，因此注射劑和口服劑都應(yīng)控制。應(yīng)，因此注射劑和口服劑都應(yīng)控制。 3.高分子雜質(zhì)是高分子雜質(zhì)是-內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量評(píng)

14、價(jià)內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，可評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量和穩(wěn)定性，并的重要指標(biāo)，可評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量和穩(wěn)定性，并可借此進(jìn)一步評(píng)價(jià)其生產(chǎn)工藝。可借此進(jìn)一步評(píng)價(jià)其生產(chǎn)工藝。2022-2-1316第二節(jié)第二節(jié) 高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)質(zhì)控方法高分子雜質(zhì)質(zhì)控方法化學(xué)分析化學(xué)分析免疫學(xué)分析免疫學(xué)分析色譜法色譜法分光法（分光法（P值法）值法）間接血凝法間接血凝法豚鼠豚鼠PCA法法反相模式反相模式離子交換模式離子交換模式凝膠色譜模式凝膠色譜模式一、概述一、概述2022-2-1317v由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常有相似的生物學(xué)特性，如：均為過(guò)敏性雜質(zhì)，因此，在物

15、學(xué)特性，如：均為過(guò)敏性雜質(zhì)，因此，在藥物質(zhì)量控制中一般藥物質(zhì)量控制中一般不需不需分別控制不同結(jié)構(gòu)分別控制不同結(jié)構(gòu)的高分子雜質(zhì)含量，而只需控制藥品中高分的高分子雜質(zhì)含量，而只需控制藥品中高分子雜質(zhì)的子雜質(zhì)的總量總量。故根據(jù)。故根據(jù)分子量差異分子量差異進(jìn)行分離進(jìn)行分離的的凝膠色譜模式凝膠色譜模式是簡(jiǎn)便易行的分離模式。是簡(jiǎn)便易行的分離模式。v以葡聚糖凝膠以葡聚糖凝膠Sephadex G-10 為基礎(chǔ)的凝膠為基礎(chǔ)的凝膠色譜分析方法，可簡(jiǎn)便地用于對(duì)各種色譜分析方法，可簡(jiǎn)便地用于對(duì)各種-內(nèi)酰內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的分離、分析，胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的分離、分析，并滿足藥品質(zhì)量控制的需要。并滿足藥品

16、質(zhì)量控制的需要。2022-2-1318高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)分析方法v二、凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)二、凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn) 2022-2-1319凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)v1.凝膠色譜法凝膠色譜法 凝膠色譜法又稱凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法分子排阻色譜法。凝膠色。凝膠色譜法主要用于譜法主要用于高聚物高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。凝膠色譜法析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來(lái)又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，由于的一種快速而又

17、簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑，對(duì)，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的分離效果。它是利用某高分子物質(zhì)有很高的分離效果。它是利用某些凝膠對(duì)混合物各組分因分子量不同，其阻些凝膠對(duì)混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進(jìn)行分離、分析的方法。滯作用也不同而進(jìn)行分離、分析的方法。 2022-2-1320凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)v 2.凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理 （1）利用凝膠色譜的分子篩機(jī)制，但凝膠的）利用凝膠色譜的分子篩機(jī)制，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千孔徑要比分子篩大得多，一般為

18、幾百至幾千埃。讓藥物分子自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而埃。讓藥物分子自由進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而所有的高分子雜質(zhì)被排阻，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)讓所有所有的高分子雜質(zhì)被排阻，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)讓所有高分子雜質(zhì)具有相同的保留時(shí)間的設(shè)想。高分子雜質(zhì)具有相同的保留時(shí)間的設(shè)想。2022-2-1321凝膠滲透色譜按分子大小分離原理圖凝膠滲透色譜按分子大小分離原理圖2022-2-1322v凝膠過(guò)濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀凝膠過(guò)濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以這種物質(zhì)可以完全或部分完全或部分排阻某些排阻某些大分子化大分子化合物合物于篩孔之外，而對(duì)

19、某些小分子化合物則于篩孔之外，而對(duì)某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。透。v任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用程度可用分配系數(shù)分配系數(shù)Kav（被分離化合物在內(nèi)（被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。 2022-2-1323v實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)驗(yàn)證明， Sephadex G-10 凝膠可基本保凝膠可基本保證所有的證所有的-內(nèi)酰胺抗生素中的高分子雜質(zhì)被內(nèi)酰胺抗生素中的高分子雜質(zhì)被排阻。排阻。 Kav = (Ve-Vo) / (Vt-Vo) Kav:分配

20、系數(shù)；分配系數(shù)；Ve：被分離物質(zhì)洗脫體積；：被分離物質(zhì)洗脫體積； Vo：柱內(nèi)凝膠床中顆粒間自由空間所占有的：柱內(nèi)凝膠床中顆粒間自由空間所占有的體積（外水體積）；體積（外水體積）； Vt：柱內(nèi)凝膠顆粒占有的體積與外水體積之和：柱內(nèi)凝膠顆粒占有的體積與外水體積之和（柱床體積）（柱床體積） 一般一般Kav0洗脫的組分視作高分子雜質(zhì)。洗脫的組分視作高分子雜質(zhì)。2022-2-1324外水體積（外水體積（Vo） ：凝膠柱中凝膠顆粒周：凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，即液體流動(dòng)相體積；圍空間的體積，即液體流動(dòng)相體積；內(nèi)水體積（內(nèi)水體積（Vi） ：凝膠顆粒中孔穴的體：凝膠顆粒中孔穴的體積，即固定相體積；積，即

21、固定相體積；基質(zhì)體積（基質(zhì)體積（Vg） ：凝膠顆粒實(shí)際骨架體：凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。積。Vt= Vo+ Vi+ Vg柱床體積（柱床體積（Vt）：凝膠柱：凝膠柱所能容納的總體積所能容納的總體積2022-2-1325洗脫體積（洗脫體積（Ve） ：將樣品中某一組分洗脫：將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積。下來(lái)所需洗脫液的體積。 一般是介于一般是介于Vo和和Vt之間的。之間的。（1）對(duì)于完全排阻的大分子，由于其不進(jìn)）對(duì)于完全排阻的大分子，由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動(dòng)相中，入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動(dòng)相中，故故Ve= Vo；（2）對(duì)于完全滲透的小分子，由于可以存）對(duì)于完全滲透的小分子

22、，由于可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)，故在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)，故Ve= Vt； 分子量介于兩者之間的分子，其洗脫體分子量介于兩者之間的分子，其洗脫體積也介于兩者之間，但，有時(shí)也出現(xiàn)積也介于兩者之間，但，有時(shí)也出現(xiàn)Ve Vt，這是由于這種分子與凝膠的吸附作用，這是由于這種分子與凝膠的吸附作用造成的。造成的。2022-2-1326凝膠層析洗脫示意圖凝膠層析洗脫示意圖（1）完全排阻的大分子）完全排阻的大分子 （2）中等分子）中等分子（3）完全滲透的小分子）完全滲透的小分子 （4）吸附分子）吸附分子2022-2-1327v通常選用藍(lán)色葡聚糖通常選用藍(lán)色葡聚糖2000作為測(cè)定外水體積作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。

23、該物質(zhì)分子量大（為的物質(zhì)。該物質(zhì)分子量大（為200萬(wàn)），呈萬(wàn)），呈藍(lán)色，它在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被完藍(lán)色，它在各種型號(hào)的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或全排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測(cè)（分光光度儀檢測(cè)（210nm或或260nm或或620nm）洗脫體積（即洗脫體積（即Vo）。但是，在測(cè)定激酶等蛋）。但是，在測(cè)定激酶等蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，不宜用藍(lán)色葡聚糖白質(zhì)的分子量時(shí)，不宜用藍(lán)色葡聚糖2000測(cè)測(cè)定外水體積，因?yàn)樗鼘?duì)激酶有吸附作用，所定外水體積，因?yàn)樗鼘?duì)激酶有吸附作用，所以有時(shí)用以有時(shí)用巨球巨球蛋白蛋白代替。代替。2022-2-1328Vo的測(cè)定的測(cè)定

24、2022-2-1329Vt的測(cè)定的測(cè)定2022-2-1330v（2）由于溶質(zhì)分子和凝膠介質(zhì)間存在多種次）由于溶質(zhì)分子和凝膠介質(zhì)間存在多種次級(jí)相互作用，溶質(zhì)分子可被吸附于凝膠介質(zhì)級(jí)相互作用，溶質(zhì)分子可被吸附于凝膠介質(zhì)的表面。的表面。v（3）在凝膠顆粒內(nèi)部具有較大的比表面積和）在凝膠顆粒內(nèi)部具有較大的比表面積和較小的自由空間，故溶質(zhì)分子更易和凝膠介較小的自由空間，故溶質(zhì)分子更易和凝膠介質(zhì)接觸，因此溶質(zhì)分子在質(zhì)接觸，因此溶質(zhì)分子在凝膠顆粒內(nèi)部凝膠顆粒內(nèi)部較較凝凝膠顆粒外部膠顆粒外部更易被吸附。更易被吸附。v（4）即，色譜過(guò)程中除分子排阻作用外，凝）即，色譜過(guò)程中除分子排阻作用外，凝膠對(duì)膠對(duì)藥物分子藥

25、物分子的吸附作用的吸附作用大于大于對(duì)對(duì)高分子雜質(zhì)高分子雜質(zhì)的吸附作用。的吸附作用。2022-2-1331 有目的的利用藥物分子和凝膠間的次級(jí)相互有目的的利用藥物分子和凝膠間的次級(jí)相互作用，使藥物分子吸附于凝膠顆粒內(nèi)表面，作用，使藥物分子吸附于凝膠顆粒內(nèi)表面，進(jìn)而改善高分子雜質(zhì)和藥物分子之間的分離進(jìn)而改善高分子雜質(zhì)和藥物分子之間的分離度。度。v（5）在深入研究藥物和葡聚糖凝膠的相互作）在深入研究藥物和葡聚糖凝膠的相互作用及流動(dòng)相對(duì)該相互作用的影響的基礎(chǔ)，通用及流動(dòng)相對(duì)該相互作用的影響的基礎(chǔ)，通過(guò)調(diào)節(jié)色譜過(guò)程中的過(guò)調(diào)節(jié)色譜過(guò)程中的流動(dòng)相組成、濃度、流動(dòng)相組成、濃度、pH和流速和流速等參數(shù)，調(diào)節(jié)藥物

26、分子和凝膠顆粒間等參數(shù)，調(diào)節(jié)藥物分子和凝膠顆粒間的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)高分子雜質(zhì)和藥物分的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)高分子雜質(zhì)和藥物分子間的分離度。子間的分離度。2022-2-1332凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)凝膠色譜系統(tǒng)的分離原理及特點(diǎn)v3. Sephadex G-10 凝膠色譜法分離凝膠色譜法分離-內(nèi)酰胺內(nèi)酰胺抗生素中高分子雜質(zhì)的概況：抗生素中高分子雜質(zhì)的概況： 在在Sephadex G-10 凝膠色譜系統(tǒng)中，理論凝膠色譜系統(tǒng)中，理論上上-內(nèi)酰胺抗生素三聚體以上的高分子雜質(zhì)內(nèi)酰胺抗生素三聚體以上的高分子雜質(zhì)均集中在均集中在Kav=0的色譜峰中；調(diào)節(jié)各種色譜的色譜峰中；調(diào)節(jié)各種色譜條件，既可使條件，

27、既可使-內(nèi)酰胺抗生素的寡聚物（如內(nèi)酰胺抗生素的寡聚物（如青霉素類抗生素的二聚物等）和其它高分子青霉素類抗生素的二聚物等）和其它高分子雜質(zhì)分離，又可使其二者合二為一，因此可雜質(zhì)分離，又可使其二者合二為一，因此可用于不同的分析目的。用于不同的分析目的。 2022-2-1333高分子雜質(zhì)分析方法高分子雜質(zhì)分析方法v三、色譜條件對(duì)三、色譜條件對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素在內(nèi)酰胺類抗生素在Sephadex G-10 凝膠色譜系統(tǒng)中色譜行凝膠色譜系統(tǒng)中色譜行為的影響為的影響2022-2-1334色譜條件的影響色譜條件的影響v1.流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)溶質(zhì)保留行為的影響：流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)溶質(zhì)保留行為的影響： 流動(dòng)相的離子強(qiáng)

28、度和色譜行為雖然并無(wú)直流動(dòng)相的離子強(qiáng)度和色譜行為雖然并無(wú)直接聯(lián)系，但一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)流動(dòng)相中的離子種接聯(lián)系，但一般說(shuō)來(lái)，當(dāng)流動(dòng)相中的離子種類不改變時(shí)，離子強(qiáng)度越大，類不改變時(shí)，離子強(qiáng)度越大， -內(nèi)酰胺類抗內(nèi)酰胺類抗生素的生素的Kav值越大。值越大。 2022-2-1335v 在被測(cè)物濃度較高時(shí)，流動(dòng)相中應(yīng)含有足量在被測(cè)物濃度較高時(shí)，流動(dòng)相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰形和分離效果。的緩沖鹽以改善色譜峰形和分離效果。v有研究表明，在流動(dòng)相中添加有研究表明，在流動(dòng)相中添加中性鹽中性鹽如氯化如氯化鈉或鈉或增加增加緩沖液的濃度后緩沖液的濃度后 ，均使離子強(qiáng)度增均使離子強(qiáng)度增加，使加，使-內(nèi)酰胺類抗生素中

29、的高分子雜質(zhì)得內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)得到有效分離。到有效分離。2022-2-1336色譜條件的影響色譜條件的影響v2.流動(dòng)相種類對(duì)溶質(zhì)色譜行為的影響：流動(dòng)相種類對(duì)溶質(zhì)色譜行為的影響： 常用流動(dòng)相有：檸檬酸緩沖液、硫酸銨緩常用流動(dòng)相有：檸檬酸緩沖液、硫酸銨緩沖液、磷酸緩沖液、醋酸緩沖液等。沖液、磷酸緩沖液、醋酸緩沖液等。 改變流動(dòng)相中緩沖液的種類，可以改變?nèi)芨淖兞鲃?dòng)相中緩沖液的種類，可以改變?nèi)苜|(zhì)的色譜行為，對(duì)質(zhì)的色譜行為，對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素，表現(xiàn)內(nèi)酰胺類抗生素，表現(xiàn)為其為其Kav值的改變及色譜峰型的變化。值的改變及色譜峰型的變化。 2022-2-1337流動(dòng)相流動(dòng)相0.1mol/L頭孢菌素

30、的頭孢菌素的Kav值值頭孢他啶頭孢他啶頭孢曲松頭孢曲松頭孢噻吩頭孢噻吩檸檬酸緩沖液檸檬酸緩沖液0.452.522.06硫酸銨硫酸銨0.361.761.45磷酸緩沖液磷酸緩沖液0.311.361.42醋酸緩沖液醋酸緩沖液0.270.791.00碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液0.210.550.88硝酸鈉硝酸鈉0.150.210.58流動(dòng)相中緩沖液種類對(duì)頭孢菌素色譜行為的影響流動(dòng)相中緩沖液種類對(duì)頭孢菌素色譜行為的影響2022-2-1338測(cè)定次數(shù)測(cè)定次數(shù)緩沖鹽緩沖鹽0.1mol/L理論板數(shù)理論板數(shù)拖尾因子拖尾因子1磷酸緩沖液磷酸緩沖液31911.43檸檬酸緩沖液檸檬酸緩沖液23852.542磷酸緩沖液磷

31、酸緩沖液41211.43檸檬酸緩沖液檸檬酸緩沖液31202.40流動(dòng)相對(duì)頭孢他啶高分子雜質(zhì)色譜行為的影響流動(dòng)相對(duì)頭孢他啶高分子雜質(zhì)色譜行為的影響2022-2-1339v分析證明，影響這種變化的決定因素是緩沖分析證明，影響這種變化的決定因素是緩沖液中的液中的陰離子種類陰離子種類，陰離子所帶的負(fù)電荷越，陰離子所帶的負(fù)電荷越多，溶質(zhì)的多，溶質(zhì)的Kav值相對(duì)越大，色譜峰也越易值相對(duì)越大，色譜峰也越易拖尾。拖尾。2022-2-1340色譜條件的影響色譜條件的影響v3.流動(dòng)相流動(dòng)相pH的影響的影響 對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pHpH值越小，組分的值越小，組分的k k值越值越大，當(dāng)大，當(dāng)pHpH值

32、遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKapKa值時(shí)，弱酸主值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。 當(dāng)流動(dòng)相中有多元酸當(dāng)流動(dòng)相中有多元酸/鹽存在時(shí)，鹽存在時(shí)，pH通過(guò)影通過(guò)影響多元酸的解離，改變緩沖液中的陰離子類響多元酸的解離，改變緩沖液中的陰離子類型，來(lái)改變?nèi)苜|(zhì)的保留時(shí)間。型，來(lái)改變?nèi)苜|(zhì)的保留時(shí)間。2022-2-1341色譜條件的影響色譜條件的影響v4.洗脫速度的影響洗脫速度的影響 流速越大，溶質(zhì)的保留值減小。反之，溶流速越大，溶質(zhì)的保留值減小。反之，溶質(zhì)的保留值增大。質(zhì)的保留值增大。 這是由于流速較快時(shí)，溶質(zhì)分子進(jìn)入凝膠這是由于流速較快時(shí)，溶質(zhì)分子進(jìn)

33、入凝膠顆粒內(nèi)部的概率減小，導(dǎo)致與葡聚糖凝膠相顆粒內(nèi)部的概率減小，導(dǎo)致與葡聚糖凝膠相互作用的機(jī)會(huì)減少之故。互作用的機(jī)會(huì)減少之故。2022-2-1342色譜條件的影響色譜條件的影響v5.溶質(zhì)保留值和半峰寬的關(guān)系溶質(zhì)保留值和半峰寬的關(guān)系 -內(nèi)酰胺抗生素在內(nèi)酰胺抗生素在Sephadex G-10凝膠色凝膠色譜系統(tǒng)中的半峰寬與其保留時(shí)間均呈線性關(guān)譜系統(tǒng)中的半峰寬與其保留時(shí)間均呈線性關(guān)系。也就是說(shuō)，保留時(shí)間越大，半峰寬越大，系。也就是說(shuō)，保留時(shí)間越大，半峰寬越大，峰型越難看。峰型越難看。2022-2-1343第三節(jié)第三節(jié) 分子排阻色譜法分子排阻色譜法v中國(guó)藥典中國(guó)藥典2005版二部規(guī)定，版二部規(guī)定，分子排

34、阻色譜法分子排阻色譜法是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)，其分離原理即為凝膠色譜柱液相色譜技術(shù)，其分離原理即為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。的分子篩機(jī)制。-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子雜質(zhì)的測(cè)定采用分子排阻色譜法。子雜質(zhì)的測(cè)定采用分子排阻色譜法。2022-2-1344自身對(duì)照外標(biāo)法自身對(duì)照外標(biāo)法v原理原理 在在Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)中，由凝膠色譜系統(tǒng)中，由于于Sephadex G-10的排阻分子量?jī)H為的排阻分子量?jī)H為700道道爾頓，因此，除部分寡聚物外，爾頓，因此，除部分寡聚物外， -內(nèi)酰胺抗內(nèi)酰胺抗生素中的高分

35、子雜質(zhì)在色譜過(guò)程中均不保留；生素中的高分子雜質(zhì)在色譜過(guò)程中均不保留；即所有高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，其即所有高分子雜質(zhì)表現(xiàn)為單一的色譜峰，其kav=0 。 2022-2-1345自身對(duì)照外標(biāo)法自身對(duì)照外標(biāo)法v在特定條件下，在特定條件下，-內(nèi)酰胺抗生素由于分子間內(nèi)酰胺抗生素由于分子間的氫鍵、靜電、疏水相互作用等次級(jí)相互作的氫鍵、靜電、疏水相互作用等次級(jí)相互作用，可以形成用，可以形成締合物締合物，導(dǎo)致其表觀分子量增，導(dǎo)致其表觀分子量增大。此時(shí)，在大。此時(shí)，在Sephadex G-10凝膠色譜系統(tǒng)凝膠色譜系統(tǒng)中和高分子雜質(zhì)具有相似的色譜行為，即在中和高分子雜質(zhì)具有相似的色譜行為，即在kav=0處

36、表現(xiàn)為單一的色譜峰。處表現(xiàn)為單一的色譜峰。2022-2-1346自身對(duì)照外標(biāo)法自身對(duì)照外標(biāo)法v測(cè)定方法測(cè)定方法 利用以上所述原理，在利用以上所述原理，在Sephadex G-10凝膠凝膠色譜系統(tǒng)中，以藥物自身為對(duì)照品，測(cè)定其色譜系統(tǒng)中，以藥物自身為對(duì)照品，測(cè)定其在特定條件下在特定條件下締合時(shí)的峰締合時(shí)的峰響應(yīng)指標(biāo)；再改變響應(yīng)指標(biāo)；再改變色譜條件，測(cè)定樣品高分子雜質(zhì)和藥物分離色譜條件，測(cè)定樣品高分子雜質(zhì)和藥物分離后，后， kav=0處處高分子雜質(zhì)的峰高分子雜質(zhì)的峰響應(yīng)指標(biāo)；按響應(yīng)指標(biāo)；按外標(biāo)法計(jì)算，既得藥品中高分子雜質(zhì)相當(dāng)于外標(biāo)法計(jì)算，既得藥品中高分子雜質(zhì)相當(dāng)于藥品本身的相對(duì)含量。藥品本身的相對(duì)

37、含量。流動(dòng)相流動(dòng)相B：水：水流動(dòng)相流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液：磷酸鹽緩沖液2022-2-1347v為什么采用自身對(duì)照外標(biāo)法？為什么采用自身對(duì)照外標(biāo)法？ 定量分析法的理論基礎(chǔ)：通過(guò)檢測(cè)器的定量分析法的理論基礎(chǔ)：通過(guò)檢測(cè)器的物質(zhì)的量與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)成正比，其檢物質(zhì)的量與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)成正比，其檢測(cè)器響應(yīng)可以是面積或峰高。測(cè)器響應(yīng)可以是面積或峰高。含含量量響響應(yīng)應(yīng)值值(A或或H)定量方法：定量方法：2022-2-1348v 1.外標(biāo)法外標(biāo)法 以以待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照品待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照品為參照物，根據(jù)供為參照物，根據(jù)供試品的量和對(duì)照品的量以及對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)試品的量和對(duì)照品的量以及對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行定量的方法。

38、進(jìn)行定量的方法。 高聚物對(duì)照品較難制備，即使制備的高高聚物對(duì)照品較難制備，即使制備的高聚物對(duì)照品由于不穩(wěn)定也較難保存，而且不聚物對(duì)照品由于不穩(wěn)定也較難保存，而且不同批制備的對(duì)照品很難同質(zhì)。同批制備的對(duì)照品很難同質(zhì)。 -內(nèi)酰胺抗生素高分子雜質(zhì)具有高度的不內(nèi)酰胺抗生素高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性。均一性和不確定性。2022-2-1349v2. 歸一化法歸一化法 將測(cè)得色譜圖上，將測(cè)得色譜圖上，所有色譜峰所有色譜峰面積求和，面積求和，與每個(gè)色譜峰面積相比較，即得每個(gè)色譜峰與每個(gè)色譜峰面積相比較，即得每個(gè)色譜峰的百分比，把所有的色譜峰的百分比相加即的百分比，把所有的色譜峰的百分比相加即得得1

39、00%，稱為峰面積歸一化。，稱為峰面積歸一化。 對(duì)于高分子雜質(zhì)來(lái)說(shuō)，其含量和藥物本身對(duì)于高分子雜質(zhì)來(lái)說(shuō)，其含量和藥物本身含量相差甚遠(yuǎn)，測(cè)量誤差較大。含量相差甚遠(yuǎn)，測(cè)量誤差較大。2022-2-1350高分子高分子雜質(zhì)雜質(zhì)樣品主峰樣品主峰2022-2-1351v3.內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法是結(jié)合了峰面積歸一法和外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法是結(jié)合了峰面積歸一法和外標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)的一種方法，它在加入內(nèi)標(biāo)后，按峰的優(yōu)點(diǎn)的一種方法，它在加入內(nèi)標(biāo)后，按峰面積歸一法的分析方法進(jìn)行分析，這就避免面積歸一法的分析方法進(jìn)行分析，這就避免了由于進(jìn)樣的一致性及樣品歧視效應(yīng)導(dǎo)致的了由于進(jìn)樣的一致性及樣品歧視效應(yīng)導(dǎo)致的偶然誤差，因而，它的分析精密

40、度也是比較偶然誤差，因而，它的分析精密度也是比較高的，是氣相色譜的一種比較理想的定量分高的，是氣相色譜的一種比較理想的定量分析方法。析方法。 2022-2-1352v4.主成分對(duì)照法主成分對(duì)照法 由于由于Sephadex G-10凝膠色譜分離系凝膠色譜分離系統(tǒng)的柱效較低，進(jìn)樣微量的藥物很難表現(xiàn)統(tǒng)的柱效較低，進(jìn)樣微量的藥物很難表現(xiàn)出色譜峰。出色譜峰。2022-2-1353基本分析方法基本分析方法2022-2-1354儀儀 器器v1.恒流泵恒流泵 1）轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速范圍：）轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速范圍：0.1-120rpm,正反轉(zhuǎn)可逆正反轉(zhuǎn)可逆2）調(diào)速方式：無(wú)級(jí)調(diào)速配）調(diào)速方式：無(wú)級(jí)調(diào)速配以線性數(shù)碼旋鈕連續(xù)可調(diào)以線性數(shù)

41、碼旋鈕連續(xù)可調(diào)3）速度分辯率：）速度分辯率：30rpm以以下為下為0.1rpm，30rpm以上以上為為1rpmv硅膠管硅膠管 1）粗細(xì)合適）粗細(xì)合適 2）壁厚）壁厚1.5mm 3）耐磨）耐磨2022-2-1355儀儀 器器v2.玻璃層析柱玻璃層析柱 合理選擇層析柱的長(zhǎng)度和合理選擇層析柱的長(zhǎng)度和直徑，是保證分離效果的直徑，是保證分離效果的重要環(huán)節(jié)，理想的層析柱重要環(huán)節(jié)，理想的層析柱的直徑與長(zhǎng)度之比一般為的直徑與長(zhǎng)度之比一般為1：251：100.2022-2-1356儀儀 器器v3.檢測(cè)器檢測(cè)器 -內(nèi)酰胺抗生素通常都內(nèi)酰胺抗生素通常都有較明顯的紫外吸收特有較明顯的紫外吸收特征，所以測(cè)定中一般選征，

42、所以測(cè)定中一般選擇紫外檢測(cè)器，通常用擇紫外檢測(cè)器，通常用到的檢測(cè)波長(zhǎng)是到的檢測(cè)波長(zhǎng)是254nm。2022-2-1357儀儀 器器v3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 積分儀積分儀n選擇性記錄選擇性記錄,n進(jìn)行積分處進(jìn)行積分處理和定量計(jì)理和定量計(jì)算算色譜工作站色譜工作站u色譜控制色譜控制數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集記錄記錄計(jì)算計(jì)算分析分析圖圖譜保存譜保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果編實(shí)驗(yàn)結(jié)果編排排打印于一體打印于一體2022-2-1358v系統(tǒng)適用性試驗(yàn)系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 1.以藍(lán)色葡聚糖以藍(lán)色葡聚糖2000的保留時(shí)間來(lái)表示高分的保留時(shí)間來(lái)表示高分子雜質(zhì)的保留特征，考察對(duì)照品色譜峰及高子雜質(zhì)的保留特征，考察對(duì)照品色譜峰及高分子雜質(zhì)色譜峰

43、與藍(lán)色葡聚糖分子雜質(zhì)色譜峰與藍(lán)色葡聚糖2000溶液色譜溶液色譜峰保留時(shí)間的比值均應(yīng)不超過(guò)某一限度。峰保留時(shí)間的比值均應(yīng)不超過(guò)某一限度。 中國(guó)藥典要求是中國(guó)藥典要求是0.931.07。 對(duì)照品峰和供試品溶液聚合物峰與相應(yīng)色對(duì)照品峰和供試品溶液聚合物峰與相應(yīng)色譜中藍(lán)色葡聚糖譜中藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時(shí)間的比值也峰的保留時(shí)間的比值也是是0.931.07。2022-2-1359流動(dòng)相流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液：磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相流動(dòng)相B：水：水5.3495.1862022-2-1360v2.理論板數(shù)理論板數(shù) 在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中，按藍(lán)色葡聚糖在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中，按藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算，理論板數(shù)均峰計(jì)

44、算，理論板數(shù)均不小于不小于700。221254.5WtntnRR或2022-2-1361v3.拖尾因子拖尾因子 在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)在兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中，按藍(lán)色葡聚糖中，按藍(lán)色葡聚糖2000峰計(jì)算，拖尾峰計(jì)算，拖尾因子均因子均小于小于2.0。ABAsfT2) (峰的拖尾因子A B10%峰 高5%峰 高2022-2-1362 4.重復(fù)性重復(fù)性 RSD 考察對(duì)照品在流動(dòng)相考察對(duì)照品在流動(dòng)相B系統(tǒng)中重復(fù)進(jìn)樣系統(tǒng)中重復(fù)進(jìn)樣后峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)符合規(guī)定。后峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)符合規(guī)定。2022-2-1363v流動(dòng)相流動(dòng)相B：水：水 測(cè)定對(duì)照品，在測(cè)定對(duì)照品，在Kav=0處表現(xiàn)為單一的處表現(xiàn)為單一的色譜峰

45、，以藥物自身為對(duì)照品，測(cè)定這一色譜峰，以藥物自身為對(duì)照品，測(cè)定這一條件下締合時(shí)的峰響應(yīng)指標(biāo)。條件下締合時(shí)的峰響應(yīng)指標(biāo)。5.305測(cè)定過(guò)程測(cè)定過(guò)程2022-2-1364v流動(dòng)相流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖液：磷酸鹽緩沖液 測(cè)定供試品，測(cè)定樣品中高分子雜質(zhì)和藥測(cè)定供試品，測(cè)定樣品中高分子雜質(zhì)和藥物分離后，物分離后，Kav=0處高分子雜質(zhì)的峰響應(yīng)指處高分子雜質(zhì)的峰響應(yīng)指標(biāo)。標(biāo)。5.3452022-2-1365影響準(zhǔn)確測(cè)定的若干因素影響準(zhǔn)確測(cè)定的若干因素v1.峰響應(yīng)值的選擇峰響應(yīng)值的選擇v2.檢測(cè)器類型及其線性范圍檢測(cè)器類型及其線性范圍v3.進(jìn)樣量的影響進(jìn)樣量的影響v4.對(duì)照品異質(zhì)性的影響對(duì)照品異質(zhì)性的影響2

46、022-2-1366分離度分離度v定義：分離度是指高分子聚合物與藥物單體定義：分離度是指高分子聚合物與藥物單體之間分離程度（或分離能力）。之間分離程度（或分離能力）。vpHHvp/Hp Hp 次高峰到基線的高。次高峰到基線的高。HvHv 次高峰與最大峰曲線次高峰與最大峰曲線分離的最低點(diǎn)到基線的高。分離的最低點(diǎn)到基線的高。 2022-2-1367分離度影響因素分離度影響因素v1.凝膠對(duì)藥物吸附作用的強(qiáng)弱與結(jié)構(gòu)有關(guān)凝膠對(duì)藥物吸附作用的強(qiáng)弱與結(jié)構(gòu)有關(guān)v2.與洗脫劑組成有關(guān)與洗脫劑組成有關(guān)v3.與流動(dòng)相的離子強(qiáng)度有關(guān)與流動(dòng)相的離子強(qiáng)度有關(guān)v4.與流動(dòng)相的與流動(dòng)相的pH有關(guān)有關(guān)v5.與流動(dòng)相的流速有關(guān)與

47、流動(dòng)相的流速有關(guān)2022-2-1368第四節(jié)第四節(jié) Sephadex G-10凝膠色譜系凝膠色譜系統(tǒng)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)統(tǒng)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)v1.凝膠的預(yù)處理凝膠的預(yù)處理 凝膠：凝膠：溶膠溶膠或或溶液溶液中的中的膠體膠體粒子或粒子或高分子高分子在一在一定條件下互相連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)空隙定條件下互相連接，形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)空隙中充滿了作為分散介質(zhì)的中充滿了作為分散介質(zhì)的液體液體（在干凝膠中也可以（在干凝膠中也可以是是氣體氣體），這樣一種特殊的），這樣一種特殊的分散體系分散體系稱作凝膠。沒(méi)稱作凝膠。沒(méi)有有流動(dòng)性流動(dòng)性。內(nèi)部常含有大量液體。葡聚糖凝膠屬于。內(nèi)部常含有大量液體。葡聚糖凝膠屬于彈性凝

48、膠彈性凝膠彈性凝膠失去分散介質(zhì)后，體積顯著縮小，彈性凝膠失去分散介質(zhì)后，體積顯著縮小，而當(dāng)重新吸收分散介質(zhì)時(shí)，體積又重新而當(dāng)重新吸收分散介質(zhì)時(shí)，體積又重新膨脹膨脹。 2022-2-1369v凝膠粒度的選擇：凝膠粒度的選擇： 一般來(lái)說(shuō)，細(xì)顆粒分離效果好，但流速一般來(lái)說(shuō)，細(xì)顆粒分離效果好，但流速慢；而粗顆粒流速快，但會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，使慢；而粗顆粒流速快，但會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，使洗脫峰變平而寬。因此，如用細(xì)顆粒凝膠宜洗脫峰變平而寬。因此，如用細(xì)顆粒凝膠宜用大直徑的層析柱，用粗顆粒時(shí)用小直徑的用大直徑的層析柱，用粗顆粒時(shí)用小直徑的層析柱。在實(shí)際操作中，要根據(jù)工作需要，層析柱。在實(shí)際操作中，要根據(jù)工作需要，選擇

49、選擇適當(dāng)?shù)念w粒大小適當(dāng)?shù)念w粒大小并調(diào)整流速。并調(diào)整流速。2022-2-1370v凝膠溶脹方法：凝膠溶脹方法： 稱取葡聚糖凝膠，緩慢地傾倒入稱取葡聚糖凝膠，緩慢地傾倒入510倍倍的的去離子水中去離子水中或或蒸餾水蒸餾水，攪拌均勻，在室溫，攪拌均勻，在室溫溶脹溶脹6小時(shí)，或小時(shí)，或沸水浴溶脹沸水浴溶脹 2小時(shí)小時(shí)，一般采用，一般采用后一種方法（能除去凝膠中污染的細(xì)菌，同后一種方法（能除去凝膠中污染的細(xì)菌，同時(shí)排除氣泡）時(shí)排除氣泡） 。再用傾瀉法除去凝膠上層水。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，最后及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，最后減壓抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，準(zhǔn)備裝減

50、壓抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡，準(zhǔn)備裝柱。柱。 商品凝膠是干燥的顆粒，使用時(shí)需經(jīng)溶脹商品凝膠是干燥的顆粒，使用時(shí)需經(jīng)溶脹處理，根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠處理，根據(jù)所需凝膠體積，估計(jì)所需干膠的量。的量。 一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的約為其吸水量的2倍，例如倍，例如Sephadex G-20的吸水量為的吸水量為20，1 克克Sephadex G20吸水吸水后形成的凝膠體積約后形成的凝膠體積約40ml。 2022-2-1371v凝膠再生：凝膠再生： 對(duì)于不銹鋼色譜柱對(duì)于不銹鋼色譜柱其方法是其方法是:先用水反復(fù)進(jìn)行逆向先用水反復(fù)進(jìn)行逆向沖洗，再用緩沖溶液

51、平衡，即可進(jìn)行下一次分析。沖洗，再用緩沖溶液平衡，即可進(jìn)行下一次分析。 對(duì)于玻璃層析柱對(duì)于玻璃層析柱其方法是：將凝膠從柱柱中取出，其方法是：將凝膠從柱柱中取出，將已使用過(guò)的凝膠先用將已使用過(guò)的凝膠先用0.2mol/L氫氧化鈉與氫氧化鈉與0.2mol/L氯化鈉混合液浸泡半小時(shí)后，用水洗至中氯化鈉混合液浸泡半小時(shí)后，用水洗至中性，再裝柱。性，再裝柱。 對(duì)于長(zhǎng)期不使用的硅膠對(duì)于長(zhǎng)期不使用的硅膠其方法是：將洗好的凝膠其方法是：將洗好的凝膠用用50%乙醇浸泡，抽干，然后，依次用乙醇浸泡，抽干，然后，依次用75%、95%和無(wú)水乙醇浸泡抽干，最后用乙醚浸泡抽干置和無(wú)水乙醇浸泡抽干，最后用乙醚浸泡抽干置37烘

52、干后，即可長(zhǎng)期保存。烘干后，即可長(zhǎng)期保存。2022-2-1372v2.裝柱裝柱 取層析柱一根，底部用玻璃纖維或砂蕊取層析柱一根，底部用玻璃纖維或砂蕊濾板襯托，并要求濾板下的體積濾板襯托，并要求濾板下的體積盡可能小盡可能小。將柱垂直至于鐵架上，然后在柱頂連接一長(zhǎng)將柱垂直至于鐵架上，然后在柱頂連接一長(zhǎng)頸漏斗（漏斗頸直徑約為柱直徑的一半）。頸漏斗（漏斗頸直徑約為柱直徑的一半）。在柱中加水或洗脫液，并趕凈濾板下方氣泡，在柱中加水或洗脫液，并趕凈濾板下方氣泡，使支持濾板底部完全充滿液體，然后將柱的使支持濾板底部完全充滿液體，然后將柱的出口關(guān)閉。把已經(jīng)溶脹好的凝膠調(diào)成薄漿，出口關(guān)閉。把已經(jīng)溶脹好的凝膠調(diào)成

53、薄漿，從漏斗倒入柱內(nèi)，膠粒逐漸擴(kuò)散下沉，薄漿從漏斗倒入柱內(nèi)，膠粒逐漸擴(kuò)散下沉，薄漿連續(xù)加入。連續(xù)加入。 2022-2-1373v裝柱要點(diǎn)：裝柱要點(diǎn)： 1）凝膠漿濃度應(yīng)適宜（一般為）凝膠漿濃度應(yīng)適宜（一般為70%水混水混懸液），分散均勻不結(jié)團(tuán)（不宜強(qiáng)烈攪拌）。懸液），分散均勻不結(jié)團(tuán)（不宜強(qiáng)烈攪拌）。 2）一根理想的凝膠柱要求柱中的填料）一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝凝膠膠)密度均勻一致，沒(méi)有空隙和氣泡。密度均勻一致，沒(méi)有空隙和氣泡。 3）通常新裝的凝膠柱用適當(dāng)?shù)木彌_溶液）通常新裝的凝膠柱用適當(dāng)?shù)木彌_溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖平衡后，將帶色的蘭葡聚糖2000溶液過(guò)柱，溶液過(guò)柱，觀察色帶是否均

54、勻下移，以鑒定新裝柱的技觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術(shù)質(zhì)量是否合格，否則，必須重新裝填。術(shù)質(zhì)量是否合格，否則，必須重新裝填。2022-2-1374v3.加樣加樣 加樣方法：加樣方法：凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時(shí)，關(guān)閉流出口，體，待平衡液下降至床表面時(shí)，關(guān)閉流出口，用滴管加入樣品液，打開(kāi)流出口，使樣品液用滴管加入樣品液，打開(kāi)流出口，使樣品液緩慢滲入凝膠床內(nèi)。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床緩慢滲入凝膠床內(nèi)。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面持平時(shí)，小心加入數(shù)表面持平時(shí)，小心加入數(shù)mL洗脫液沖洗管壁。洗脫液沖洗管壁。然后繼續(xù)用大量洗脫液洗脫。然后繼續(xù)用大量洗脫

55、液洗脫。 2022-2-1375v加樣量：加樣量：加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有關(guān)。如果檢測(cè)方法靈敏度高或柱床體積小，關(guān)。如果檢測(cè)方法靈敏度高或柱床體積小，加樣量可小；否則，加樣量增大。一般來(lái)說(shuō)，加樣量可小；否則，加樣量增大。一般來(lái)說(shuō)，加樣量越少或加樣體積越小加樣量越少或加樣體積越小(樣品濃度高樣品濃度高)，分辨率越高。通常樣品液的加入量應(yīng)掌握在分辨率越高。通常樣品液的加入量應(yīng)掌握在凝膠床總體積的凝膠床總體積的510。樣品體積過(guò)大，。樣品體積過(guò)大，分離效果不好。分離效果不好。2022-2-1376v4.洗脫洗脫 加完樣品后，將層析床與洗脫液儲(chǔ)瓶、檢加完樣品后，將層

56、析床與洗脫液儲(chǔ)瓶、檢測(cè)儀、及記錄儀相連，根據(jù)被分離物質(zhì)的性測(cè)儀、及記錄儀相連，根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，預(yù)先估計(jì)好一個(gè)適宜的流速。質(zhì)，預(yù)先估計(jì)好一個(gè)適宜的流速。 凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時(shí)甚至可用蒸餾水。洗脫液作為洗脫液，有時(shí)甚至可用蒸餾水。洗脫時(shí)用于流速控制的裝置最好的是恒流泵。時(shí)用于流速控制的裝置最好的是恒流泵。 2022-2-1377色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)v玻璃層析柱：玻璃層析柱：v1.裝柱要均勻，不要過(guò)松也不要過(guò)緊，最好裝柱要均勻，不要過(guò)松也不要過(guò)緊，最好也在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過(guò)快，也在要求的操作壓下裝柱，

57、流速不宜過(guò)快，避免因此而壓緊凝膠。但也不要過(guò)慢，使柱避免因此而壓緊凝膠。但也不要過(guò)慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過(guò)程中，凝膠床高度下裝得太松，導(dǎo)致層析過(guò)程中，凝膠床高度下降。降。 v2.始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。分揮發(fā)，凝膠變干。 2022-2-1378色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)v3.葡聚糖凝膠耐受壓力為葡聚糖凝膠耐受壓力為0.3兆帕，過(guò)高壓力兆帕，過(guò)高壓力會(huì)損傷填料性能。會(huì)損傷填料性能。 v4.防止柱長(zhǎng)霉：可用防止柱長(zhǎng)霉：可用20%乙醇或乙醇或0.04%疊氮疊氮鈉保存。鈉保存。v5.防止柱受污染：可用防止柱受污染：可用 0.2

58、mol/L氫氧化鈉與氫氧化鈉與0.2mol/L氯化鈉混合液清洗。氯化鈉混合液清洗。2022-2-1379色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)v不銹鋼色譜柱：不銹鋼色譜柱：v1.在高于室溫的條件下使用時(shí)，不要在測(cè)量在高于室溫的條件下使用時(shí)，不要在測(cè)量完畢立即停泵，應(yīng)該是繼續(xù)通流動(dòng)相直到色完畢立即停泵，應(yīng)該是繼續(xù)通流動(dòng)相直到色譜柱的溫度低于室溫為止。如果在色譜柱很譜柱的溫度低于室溫為止。如果在色譜柱很熱的時(shí)候停泵，當(dāng)流動(dòng)相冷卻過(guò)程中色譜柱熱的時(shí)候停泵，當(dāng)流動(dòng)相冷卻過(guò)程中色譜柱就會(huì)進(jìn)入氣泡。就會(huì)進(jìn)入氣泡。2022-2-1380色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)色譜柱的維護(hù)保養(yǎng)v2.若色譜柱在短期內(nèi)不再使用，應(yīng)用蒸餾水若色

59、譜柱在短期內(nèi)不再使用，應(yīng)用蒸餾水將含鹽的流動(dòng)相從色譜柱中替換掉，將色譜將含鹽的流動(dòng)相從色譜柱中替換掉，將色譜柱從儀器上取下，擰上塑料堵頭。柱從儀器上取下，擰上塑料堵頭。v3.色譜柱長(zhǎng)期不用，應(yīng)在色譜柱長(zhǎng)期不用，應(yīng)在4儲(chǔ)藏。若儲(chǔ)藏溫儲(chǔ)藏。若儲(chǔ)藏溫度低于度低于0 ，則會(huì)降低柱效。，則會(huì)降低柱效。v4.避免陽(yáng)光直射，避免與腐蝕性氣體接觸。避免陽(yáng)光直射，避免與腐蝕性氣體接觸。2022-2-1381總總 結(jié)結(jié)v對(duì)抗生素中高分子雜質(zhì)的分析根據(jù)不同品種對(duì)抗生素中高分子雜質(zhì)的分析根據(jù)不同品種的特點(diǎn)和不同質(zhì)控要求靈活掌握，優(yōu)先采用的特點(diǎn)和不同質(zhì)控要求靈活掌握，優(yōu)先采用凝膠色譜法，但不排除其它驗(yàn)證良好的其它凝膠色

60、譜法，但不排除其它驗(yàn)證良好的其它分析系統(tǒng)的應(yīng)用，對(duì)不同品種，視分離情況分析系統(tǒng)的應(yīng)用，對(duì)不同品種，視分離情況和分離要求，將和分離要求，將Sephadex G-10 和高效凝膠和高效凝膠色譜系統(tǒng)綜合應(yīng)用。色譜系統(tǒng)綜合應(yīng)用。2022-2-1382總總 結(jié)結(jié)v高效、快速、簡(jiǎn)便是抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定高效、快速、簡(jiǎn)便是抗生素高分子雜質(zhì)測(cè)定方法的發(fā)展目標(biāo)，也是必然趨勢(shì)。在方法的發(fā)展目標(biāo)，也是必然趨勢(shì)。在2005版版中國(guó)藥典中，發(fā)展較為完善的中國(guó)藥典中，發(fā)展較為完善的Sephadex G-10 凝膠色譜系統(tǒng)對(duì)多個(gè)品種抗生素高分子雜凝膠色譜系統(tǒng)對(duì)多個(gè)品種抗生素高分子雜質(zhì)的控制有著重要的意義。現(xiàn)在已有專門的質(zhì)的