代寫醫(yī)學(xué)職稱論文大孔樹脂對(duì)葛根總黃酮的吸附及分離純化研究

1、代寫醫(yī)學(xué)職稱論文大孔樹脂對(duì)葛根總黃酮的吸附及分離純化研究【摘要】 以三峽庫區(qū)豐富的葛根為材料，研究葛根黃酮的分離純化工藝。方法利用柱層析技術(shù)，比較了4種大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的效果。結(jié)果用AB-8樹脂柱進(jìn)行吸附洗脫，洗脫液為60%乙醇，流速2.4 ml/min，得到的葛根總黃酮（以葛根素計(jì)）純度為53.5%，AB-8樹脂的吸附容量為103.2 mg/g。結(jié)論建立了AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的適宜條件，發(fā)現(xiàn)AB-8大孔吸附樹脂在葛根總黃酮的分離純化中有好的表現(xiàn)。【關(guān)鍵詞】 葛根 黃酮 大孔吸附樹脂 分離 純化Research of the Separation and Pur

2、ification for Flavonoids in Radix PuerariseZHOU Yuan， CHENG Fan，LUO Shaohua(Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Chemistry and Life Sciences, China Three Gorges University, Yichang 443002，China)Abstract:Objective Flavonoids were purified from Radix Puerarise

3、of Yichang.MethodsFour excellent macroretiaclar resins were selected for separating flavonoid in Radix Puerarise. ResultsThe extract was absorbed by AB-8 macroporous absorption resin and was eluted with 60% ethanol at 2.4 ml/min eluting speed. The purity of total flavonoids was 53.5%. The absorptive

4、 capacity of AB-8 resin was 103.2% mg/g.Conclusion A feasible technnology was AB-8 for sublimating the total flavonoids in Radix puerariae.Key words:Radix Puerarise; Flavonoid ; Separation ; Purification大孔吸附樹脂（Macro-reticular Resins）是一種不含交換基團(tuán)的具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。主要是以苯乙烯二乙烯苯為原料，在0.5%的明膠水混懸液中，加入一定比例的致孔劑聚合而成

5、。國(guó)外大孔吸附樹脂商品主要是Amberilite XAD1-11Diaion Hp10-20；我國(guó)國(guó)內(nèi)現(xiàn)以自行試制的大孔吸附樹脂也有很多，包括如天津南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)的X-5，H107，S-8，NKA-9，AB-8，D3520，D4006樹脂；上海醫(yī)藥工業(yè)研究所生產(chǎn)的SIP1300，SIP1400樹脂；天津正天成澄清技術(shù)有限公司生產(chǎn)的ZTC(黃酮專用)樹脂等等。本文利用葛根70%乙醇回流得到的粗提液為原料，比較了AB-8、NKA-9，D3520，D4006等4種優(yōu)良大孔吸附樹脂分別在不同工藝條件下，分離純化葛根總黃酮的效果。探討了AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的工藝方法。1 器材1.1

6、 儀器UV-2201紫外分光光度計(jì)；自動(dòng)柱層析分析系統(tǒng)：層析柱(15mm500),HL-2恒流泵，HD-A電腦采集器，HD-3紫外檢測(cè)儀（上海瀘西分析儀器廠）。1.2 材料葛根：采自五峰土家族自治縣。葛根素標(biāo)準(zhǔn)品：購于中國(guó)藥品生物制品檢定所；AB-8，NKA-9 ，D3520 ，D4006大孔吸附樹脂：購于天津南開大學(xué)化工廠；其它化學(xué)試劑均為分析純。2 方法132.1 葛根粗提液制備采用70%乙醇，對(duì)葛根粉以1:10的固液比在85先后浸提兩次，每次3 h；合并濾液調(diào)pH8.5在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓濃縮，以5 000 r/min 在高速離心機(jī)上離心30 min過濾，棄沉淀，得到葛根粗提液也即為吸附原

7、液。2.2 葛根總黃酮含量測(cè)定葛根總黃酮含量的測(cè)定采用以葛根素為對(duì)照品的紫外分光光度法。2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取干燥至恒重的葛根素25mg于50 ml容量瓶中，以95%乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，含葛根素0.5 mgml-1，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml，以95%乙醇稀至25.00 ml，搖勻。分別于254 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并計(jì)算回歸方程。2.2.2 含量測(cè)定操作取干燥至恒重的干浸膏粉末（或洗脫液的干燥品）25 mg放入50 ml容量瓶中，加入25 ml 95%乙醇，置磁力加熱攪拌器上溫?zé)崛芙?，加乙醇?/p>

8、釋至刻度，搖勻。吸取1.00 ml于25 ml容量瓶中,加蒸餾水至刻度，搖勻。取1.0 ml乙醇同樣稀釋作空白對(duì)照,在254 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。換算出葛根總黃酮的含量。2.3 柱層析分離純化2.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理95%的乙醇浸泡35 d，待其充分溶脹后，用乙醇洗至流出液加適量水無白色渾濁現(xiàn)象，再用去離子水洗盡乙醇。2.3.2 樹脂對(duì)葛根黃酮的吸附量與解吸率測(cè)定準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂裝入帶塞磨口三角瓶中，精密加入葛根浸出原液置磁力加熱攪拌器上，振蕩24 h，待充分吸附后，濾過，測(cè)定濾液中剩余黃酮濃度。計(jì)算各樹脂室溫下的吸附量和吸附率。向吸附的飽和樹脂中，精密加入95%乙醇，浸泡振蕩2

9、4 h，濾過，測(cè)定濾液黃酮濃度，根據(jù)黃酮解吸量計(jì)算解吸率。2.3.3 提取液吸附及洗脫根據(jù)待分離的提取液樣品中總黃酮含量，選用合適量的處理好的大孔吸附樹脂以濕法裝柱，連接柱層析系統(tǒng)，加入樣品，以去離子水洗脫糖等雜質(zhì)，同時(shí)紫外檢測(cè)器于280 nm 處檢測(cè)。當(dāng)糖等雜質(zhì)被洗脫后，再以60%乙醇洗脫，洗脫液濃縮，檢測(cè)總黃酮含量。3 結(jié)果3.1 含量測(cè)定的回歸方程建立以“2.2.1”方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立濃度對(duì)吸光度的線性回歸方程：A=67.150 7C +0.062 14；相關(guān)系數(shù)r=0.995 8，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.52%，n=6。3.2 吸附量的測(cè)定以“2.3.2”方法對(duì)AB-8，NKA-

10、9，D4006，D4520等4種大孔吸附樹脂對(duì)葛根黃酮浸提液原液的吸附量做測(cè)定。結(jié)果見表1。表1 幾種大孔吸附樹脂吸附性能的比較（略）用95%乙醇和70%乙醇對(duì)充分吸附后的樹脂進(jìn)行解吸率的測(cè)定：向吸附飽和的等量樹脂中精密加入70%乙醇、95%乙醇各30ml浸泡振搖1d，濾過，測(cè)定濾液黃酮濃度，根據(jù)吸附量計(jì)算解吸率(%)。結(jié)果見表2 。表2 在不同解吸劑中4種大孔樹脂對(duì)葛根黃酮的解吸率（略）從表1可看出 AB-8大孔吸附樹脂對(duì)葛根黃酮浸提液原液的吸附量最大，NKA-9次之。說明對(duì)葛根總黃酮的樹脂柱分離應(yīng)優(yōu)先選用弱極性或極性的樹脂。這是因?yàn)楦鸶S酮具有酚羥基和糖苷鏈，有一定的極性和親水性，生成氫鍵

11、的能力較強(qiáng)，這樣就有利于弱極性和極性樹脂的吸附，而相對(duì)于非極性的樹脂, 對(duì)葛根黃酮的吸附量會(huì)偏小。從表2可以看出，AB-8大孔吸附樹脂對(duì)葛根黃酮浸提液原液的解吸率無論是在95%乙醇還是在70%乙醇中都較其它3種具有較大值。3.3 吸附流速對(duì)吸附效果的影響吸附流速對(duì)吸附效果的影響主要是影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴(kuò)散。如果流速太高，溶質(zhì)分子來不及擴(kuò)散到樹脂表面，就會(huì)發(fā)生漏過。對(duì)相同的葛根浸提液在相同條件下，分別進(jìn)行了AB-8樹脂在吸附流速為小流速(2.4 ml/min)，中檔流速(4.8 ml/min)、最高流速(8.6 ml/min)的吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。同時(shí)比較了這3種情況下的吸附曲線，見圖2。從

12、表3和圖2中發(fā)現(xiàn)存在如下規(guī)律：1）流速快，吸附峰出現(xiàn)早；流速慢，吸附峰出現(xiàn)遲； 2）流速快，峰值回零的時(shí)間短； 反之，流速慢，回零的時(shí)間也就長(zhǎng)；3）流速快，收集的流出液較同時(shí)期慢流速收集液吸光度值高，即濃度偏大，泄漏率大些；4）流速快，可以適當(dāng)增高柱長(zhǎng)，加大處理量；流速慢，可采用半柱法，保證實(shí)驗(yàn)操作的穩(wěn)定性。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，隨著上柱的吸附原液流速的加快，黃酮類化合物的泄漏越來越嚴(yán)重，吸附流速為8.6 ml/min時(shí)泄漏率明顯加大，顯然此流速不適宜。吸附流速以慢速為好，但過慢會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，從而提高成本，故綜合考慮，實(shí)驗(yàn)時(shí)吸附流速控制在2.4 ml/min為宜。表3 吸附流速對(duì)吸附效果的影響（略

13、）3.4 洗脫劑及洗脫濃度的選擇黃酮類化合物的水溶液呈弱酸性，可用堿液洗脫；黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，可用有機(jī)溶劑洗脫。出于不破壞生物活性考慮，一般不用堿液洗脫；甲醇存在毒性，一般不贊成用甲醇作為洗脫液；丙酮有揮發(fā)性，洗脫過程不穩(wěn)定。乙醇無毒又易得，操作方便，可用作葛根總黃酮的洗脫劑。分別準(zhǔn)確配制了30%，60%，70%，90%4種濃度的乙醇洗脫劑，分別檢測(cè)它們?cè)谙嗤瑮l件下通過樹脂柱時(shí)的解吸率，結(jié)果見表4。其洗脫曲線見圖3。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)70%以下乙醇洗脫柱床情況較穩(wěn)定，70%濃度以上乙醇在洗脫時(shí)將產(chǎn)生大量的氣泡（放熱反應(yīng)），且氣泡產(chǎn)生程度隨樹脂量、洗脫劑濃度的增加而增長(zhǎng)，從而使

14、洗脫時(shí)間延長(zhǎng)?？梢圆捎玫慕鉀Q辦法是在保證樹脂飽和吸附的同時(shí)，采用半柱法上柱，即降低柱高，增加有效柱高，通過提高液柱比，高位壓氣，保證洗脫的穩(wěn)定性。故選用60%乙醇洗脫，其解吸率適中，洗脫濃度也較高，洗脫液總量相應(yīng)也少，其原因就是在其洗脫過程保持了樹脂柱的相對(duì)穩(wěn)定性。同時(shí)合理的使用半柱法與高位壓柱法，對(duì)避免出現(xiàn)“氣泡柱”或“空心柱”可起到較好的作用。表4 乙醇洗脫劑濃度對(duì)葛根黃酮解吸率的影響（略）3.5 以“1.2.1”法制備的葛根浸提原液為原料采用4種大孔吸附樹脂柱層析分離純化葛根總黃酮，并分別用“1.2.2”法測(cè)定葛根總黃酮含量見表5。表5 柱層析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表（略）對(duì)表5進(jìn)行分析可以得出以下結(jié)

15、論：4種大孔樹脂分離純化葛根總黃酮以AB-8和NKA-9有較高的得率，洗脫液干重分別為0.043 0 mg和0.045 6 mg。 以60%的乙醇為洗脫液，在2.4 ml/min流速下對(duì)AB-8樹脂柱進(jìn)行吸附洗脫，得到的葛根總黃酮（以葛根素計(jì)）純度為53.5%，為最好。4 小結(jié)樹脂柱層析實(shí)驗(yàn)中，會(huì)出現(xiàn)加入乙醇后柱內(nèi)氣泡大量生成的現(xiàn)象，這將會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性與數(shù)據(jù)重復(fù)性。通過摸索，發(fā)現(xiàn)在半柱與高位液壓的條件下，60%乙醇洗脫過程穩(wěn)定性相對(duì)突出，并在基礎(chǔ)上，對(duì)4種較優(yōu)良大孔吸附樹脂在吸附分離純化葛根黃酮類化合物時(shí)的表現(xiàn)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)AB-8大孔吸附樹脂在樹脂拄層析分離提取葛根總黃酮實(shí)驗(yàn)中有最好的表現(xiàn)，是一種結(jié)果重復(fù)性較好的實(shí)驗(yàn)用樹脂。以“2.1”方法制備的葛根浸提原液經(jīng)AB-8大孔樹脂分離，當(dāng)最佳流速為2.4 ml/min，最佳乙醇洗脫濃度為60%時(shí)，葛根素收率為25.57%，葛根素純度由5.50%提高到53.5%。并測(cè)定了實(shí)驗(yàn)用AB-8樹脂的吸附容量為103.2 mg/g?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1許永興, 瞿海斌.葛根素大孔吸附樹脂層析分離動(dòng)力學(xué)J.高?；W(xué)報(bào), 2005，19（6）：751.2LIU Huo-an, WANG Bo-chu, DAI