體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞功能的定量評(píng)定

1、    體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞功能的定量評(píng)定        摘要目的建立適用于體外藥理學(xué)研究的破骨細(xì)胞骨吸收功能的定量評(píng)定方法。方法機(jī)械分離法獲得破骨細(xì)胞，接種于象牙簿片底物上，分別于培養(yǎng)1d、3d、5d、7d取出象牙簿片各4張，采用光鏡和掃描電鏡觀察骨吸收陷窩數(shù)量的變化；對(duì)隨機(jī)拍攝的陷窩照片進(jìn)行計(jì)算機(jī)形態(tài)計(jì)量分析，測(cè)算陷窩的面積和深度。結(jié)果骨吸收陷窩計(jì)數(shù)光鏡法和掃描電鏡法具有良好的相關(guān)性，r0.9998，P0.001。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，陷窩數(shù)量逐漸增多、面積擴(kuò)大、深度加深。結(jié)論

2、骨吸收陷窩計(jì)數(shù)光鏡法可以用于體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞功能的定量評(píng)價(jià)，結(jié)合陷窩面積和深度分析，可以較為全面地評(píng)價(jià)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的骨吸收功能。關(guān)鍵詞破骨細(xì)胞骨吸收陷窩數(shù)量面積深度 Quantitative Evaluation of The Function of Osteoclast Gultured in VitroZhan Hongshenget al Zhejiang college of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou (310053)Shi Yinyu,Zhao Yongfang(Shanghai University of TCM)Objecti

3、ve To establish a quantitative evaluation method of absorptive function of osteoclast which is fit for pharmacological studies.Method Get osteoclast by mechanical dispersion method,inoculate it on thin ivory slices,take out four slices respectively after culturing for 1d,3d,5d,and 7d,observe the cha

4、nges of the lacuna amount of bone absorption with light mirror and scanning electric mirror,make a quantitative analysis of computer form to the randomly taken pictures of lacunae,measure the area and depth of the lacunae.Results Light mirror method of bone absorptive lacunae amount had a good corre

5、lation with scanning electric mirror method,r0.9998，P0.001.With increasing the culture time,there are more,larger and deeper lacunae.Conclusions Counting light mirror method of bone absorptive lacunae could be used for quantitative evaluation of the osteoclast function cultured in vitro,combining wi

6、th the analysis of lacunae area and depth,we could more completely evaluate the bone absorptive function of osteoclast cultured in vitro.Key words osteoclast,bone absorptive lacunae,amount,area,depth正常骨重建起始于破骨細(xì)胞的激活，破骨細(xì)胞性骨吸收伴隨生命活動(dòng)的始末，破骨細(xì)胞異?；钴S或功能低下，可誘發(fā)一系列臨床病癥，如骨質(zhì)疏松癥、Paget氏病、關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體松動(dòng)、牙周病變或骨硬化癥等。體外破骨細(xì)

7、胞培養(yǎng)方法的建立，將有助于豐富對(duì)破骨細(xì)胞活化和功能調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而穩(wěn)定、靈敏的破骨細(xì)胞功能評(píng)價(jià)方法，對(duì)新藥的研制和開發(fā)是十分必要的。1材料與方法1.1主要試劑和儀器Medium 199培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)為Gibco公司產(chǎn)品，戊二醛、甲苯胺藍(lán)為E.Merck公司產(chǎn)品，24孔培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品；Leitz 1600型鋸式切片機(jī)，SB 2200 型超聲波清洗儀，Nikon 102型光學(xué)顯微鏡，日立S-520型掃描電鏡，MTDS-B多功能顯微影像真彩色數(shù)字化分析系統(tǒng)。1.2象牙片制備與處理取直徑1.5cm的象牙毛胚，用鋸式切片機(jī)橫向切成50m薄

8、片，置蒸溜水中超聲波清洗10min×3次，自然晾干，紫外線照射后保存于4冰箱中備用。1.3破骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)參照文獻(xiàn)，取1日齡SD大鼠(由上海醫(yī)科大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，拉頸處死，75%酒精浸泡5min，無菌分離四肢長骨，剔凈軟組織，用Medium 199培養(yǎng)液清洗2次，然后于Medium 199全培養(yǎng)液(含20%FBS、100g/ml硫酸鏈霉素、100/ml青霉素鈉，pH7.2)中，用解剖刀縱向剖開骨干，將骨質(zhì)內(nèi)表面刮入培養(yǎng)液，再以圓頭吸管吹打骨碎片5min，靜置30s，吸取上層細(xì)胞懸液均勻接種于預(yù)置有象牙薄片的24孔培養(yǎng)板中，每孔加培養(yǎng)液至1ml，37、5%CO2環(huán)

9、境中培養(yǎng)30min，以Medium 199培養(yǎng)液沖去未貼壁的細(xì)胞，更換為全培養(yǎng)液至每孔2ml，每組4孔，繼續(xù)培養(yǎng)，3d更換1次培養(yǎng)液。1.4骨吸收陷窩定量分析分別于培養(yǎng)1、3、5、7d取出培養(yǎng)板中的象牙薄片各4張，2.5%戊二醛固定7min，于0.25mol/L氫氧化銨中超聲波清洗5min×3次，系列梯度酒精脫水，自然涼干，1%甲苯胺藍(lán)染液室溫染色34min，蒸溜水清洗，于光鏡100倍下對(duì)整張象牙薄片上的吸收陷窩計(jì)數(shù)；然后對(duì)同一張象牙薄片再經(jīng)超聲波清洗10min×3次，常規(guī)處理后掃描電鏡300倍下對(duì)整張象牙薄片上的吸收陷窩計(jì)數(shù)。結(jié)果以陷窩數(shù)/片表示，組間進(jìn)行線性相關(guān)分析。同

10、等條件下每組隨機(jī)拍攝照片各6張，采用計(jì)算機(jī)象分析系統(tǒng)分別測(cè)算陷窩與背景面積的比值，以及陷窩的平均光密度值。     2結(jié)果2.1骨吸收陷窩的形態(tài)特征光鏡下，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后吸收陷窩呈紫色或藍(lán)紫色，培養(yǎng)1d的象牙薄片上可偶見著色較淡的吸收陷窩，呈圓形或橢圓形；3d時(shí)有臘腸形吸收陷窩出現(xiàn)；5d后吸收陷窩絕大部分呈梅花瓣形或臘腸形，邊界輪廓清晰，陷窩底部纖維紋路隱約可見(1-A)。掃描電鏡下觀察，骨吸收陷窩的變化趨勢(shì)與光鏡結(jié)果一致，同一標(biāo)本可清楚識(shí)別形態(tài)相似的骨吸收陷窩，邊界輪廓清晰，陷窩底部粗糙，纖維紋路清晰可見(1)。接種在象牙薄片上的破骨細(xì)胞所形成的骨吸

11、收陷窩。A：甲苯胺藍(lán)染色，骨陷窩呈紫色，邊界輪廓清晰，基底部纖維紋理隱約可見，×400。B：同一視野掃描電鏡觀察，骨陷窩輪廓一致，基底部纖維紋理清晰可見，×100。     1破骨細(xì)胞骨吸收陷窩的形態(tài)2.2骨吸收陷窩計(jì)數(shù)結(jié)果根據(jù)上述骨吸收陷窩的特征，光鏡和電鏡下可清楚辨認(rèn)骨吸收陷窩，計(jì)數(shù)結(jié)果基本一致，培養(yǎng)1d即有極少量的吸收陷窩出現(xiàn)，3d時(shí)稍有增多，5d后陷窩數(shù)量急劇增多。光鏡計(jì)數(shù)結(jié)果與電鏡計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析(2)：相關(guān)系數(shù)r0.9998，P0.001。     2骨吸收陷窩計(jì)數(shù)結(jié)果光鏡與電鏡

12、相關(guān)性分析(n4，<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100318183026499" 12 14>±s)2.3骨吸收陷窩面積分析結(jié)果對(duì)培養(yǎng)1d、3d、5d、7d的象牙薄片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，隨機(jī)拍攝照片各6張，采用計(jì)算機(jī)象分析系統(tǒng)勾畫出陷窩輪廓(3)，分別計(jì)算陷窩和背景的面積，結(jié)果以兩者的比值表示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，陷窩面積逐漸擴(kuò)大(4)。     3骨吸收陷窩面積分析A：甲苯胺藍(lán)染色的光鏡照片。×400。B：同一照片，由計(jì)算機(jī)象分析系

13、統(tǒng)所勾畫出的陷窩輪廓。×400。     4骨吸收陷窩面積隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(n6)2.4吸收陷窩深度分析對(duì)培養(yǎng)1d、3d、5d、7d的象牙薄片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，隨機(jī)拍攝照片各6張。由于陷窩著色深淺與其深度有關(guān)(5)，采用計(jì)算機(jī)象分析系統(tǒng)計(jì)算每張照片上陷窩的平均光密度值，以此反映陷窩的深度。結(jié)果顯示，培養(yǎng)13d陷窩深度變化不明顯，35d陷窩深度不斷加深，57d陷窩深度變化不明顯(6)。     5骨吸收陷窩深度分析A：甲苯胺藍(lán)染色的光鏡照片，實(shí)心箭頭所示處著色深，空心箭頭所示處著色淺。×200；B

14、：同一陷窩的掃描電鏡照片，實(shí)心箭頭所示處陷窩深，空心箭頭所示處陷窩淺。×300。     6骨吸收陷窩深度隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(n6)3討論骨吸收陷窩觀察是評(píng)價(jià)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞功能的可靠方法之一，以往多在掃描電鏡下進(jìn)行陷窩計(jì)數(shù)，其技術(shù)要求高、難度大，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便推廣。新近有研究者采用甲苯胺藍(lán)染色，骨吸收陷窩異染明顯，光鏡下可以清晰辨認(rèn)其輪廓，計(jì)數(shù)結(jié)果與電鏡法具有良好的相關(guān)性1，本實(shí)驗(yàn)取得了與之相近的結(jié)果，因此可以認(rèn)為，骨吸收陷窩光鏡計(jì)數(shù)法能夠用于體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞骨吸收功能的定量評(píng)定。由于陷窩的大小不同，陷窩面積分析可以彌補(bǔ)計(jì)數(shù)方法所可能存在的缺

15、陷28，通常是采用計(jì)算機(jī)像分析系統(tǒng)對(duì)隨機(jī)拍攝的同一批次陷窩照片進(jìn)行分析，結(jié)果以陷窩面積與背景面積的比值表示。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常情況下，陷窩數(shù)量和面積隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增加，變化趨勢(shì)基本一致，第1天陷窩少而面積小，前3天稍有增加和擴(kuò)大，第5天以后無論是數(shù)量還是面積都明顯增多或擴(kuò)大。破骨細(xì)胞吸收骨質(zhì)的過程中，通過移行不斷增加陷窩面積的同時(shí)，陷窩深度也在加深，對(duì)于一根被破骨細(xì)胞侵蝕的骨小梁而言，陷窩深度的不斷加深更易于引起小梁的穿孔和斷裂，因此，陷窩深度測(cè)量較之陷窩面積分析的意義有所不同。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，同一張象牙薄片經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，陷窩著色存在明顯的深淺差異，即便同一陷窩有時(shí)也存在類

16、似現(xiàn)象，與掃描電鏡對(duì)照觀察發(fā)現(xiàn)，著色深的部位陷窩也較深，著色淺的部位陷窩則較淺，基于這一現(xiàn)象，通過計(jì)算機(jī)像分析系統(tǒng)，測(cè)定被甲苯胺藍(lán)異染的陷窩光密度值，然后再除以陷窩的面積，以陷窩的平均光密度值來間接反映其深度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常情況下，培養(yǎng)13d象牙薄片上的骨吸收陷窩深度較淺，且基本無變化，35d深度明顯增加，57d也基本無變化。這一方法的建立，為定量評(píng)定陷窩深度提供了一種新的嘗試。綜上，陷窩計(jì)數(shù)、面積和深度測(cè)定相結(jié)合，可以較為全面地評(píng)價(jià)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的骨吸收功能，正常培養(yǎng)條件下，57d陷窩的數(shù)量明顯增多、面積擴(kuò)大、深度加深，因此，選擇加藥后第57d終止培養(yǎng)，可以觀察藥物干預(yù)的效果。致謝：本

17、文細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的學(xué)習(xí)得到上海醫(yī)科大學(xué)王洪復(fù)、金慰芳及高建軍的指導(dǎo)和幫助，謹(jǐn)致謝意!浙江省自然科學(xué)基金(NO399010)和國家九五攻關(guān)項(xiàng)目基金(NO969060905)資助詹紅生(浙江中醫(yī)醫(yī)院杭州310053)石印玉(上海中醫(yī)藥大學(xué))趙詠芳(上海中醫(yī)藥大學(xué))參考文獻(xiàn)1，高建軍，金慰芳，王洪復(fù).骨片吸收陷窩光鏡計(jì)數(shù)法定量測(cè)定破骨細(xì)胞功能.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，25(1)：71732，Carano A,Teitelbaum SL,Konsek JD,et al.Bisphosphonates directly inhibit the bone resorption activity of isolated avian osteoclasts in vitro.J Clin Invest.1990,85(2):4564613，楊雁，葛志東，李衛(wèi)平，等.體外破骨細(xì)胞性骨吸收陷窩的動(dòng)態(tài)觀察.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，32(4)：3003034，楊雁，葛志東，周愛武，等.國產(chǎn)帕屈磷酸鈉對(duì)體外破骨細(xì)胞性骨吸收影響的研究.中國藥理學(xué)通報(bào)，1997，13(2)：141