交聯(lián)型丙烯酸酯聚合物分子層用于固定寡核苷酸分子初探

1、交聯(lián)型丙烯酸酯聚合物分子層用于固定寡核苷酸分子初探        【摘要】     目的 探討在顯微玻片上衍生聚合物分子層用于固定寡核苷酸分子的方法，為基因芯片制備和應用提供技術(shù)支持。方法 利用交聯(lián)聚合反應，在顯微玻片表面衍生丙烯酸酯共聚物分子層，結(jié)合基因芯片技術(shù)制備寡核苷酸芯片。利用熒光標記的樣品和CMT芯片雜交系統(tǒng)對所制備的芯片進行雜交實驗，檢測寡核苷酸在芯片表面的固定性能，并進行對照實驗。結(jié)果 雜交后的熒光檢測表明寡核苷酸在丙烯酸酯共聚物表面上雜交點陣的熒光信

2、號多，信號強度強，雜交點圓潤、同一性好。結(jié)論 利用化學交聯(lián)法制備的芯片表面能用于寡核苷酸的固定且處理過程簡單，為進一步運用到生物芯片制作打下了良好的基礎(chǔ)。     【關(guān)鍵詞】  寡核苷酸的固定；基因芯片技術(shù)；丙烯酸類聚合物；共價交聯(lián)    The study of oligonucleotides immobilization film prepared with acrylic acidcoacrylamide copolymer    WU Qinghua, MA Wen

3、li, ZHU Lina, ZHANG Bao (Institute of Molecular Biology, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China)    Abstract: Objective   To explore the key technologies in DNA microarray fabrication is immobilizing DNA or oligonucleotide efficiently on modified surf

4、ace. Methods   The glass slides were modified with acrylic acidcoacrylamide copolymer and EDC/NHS by covalent linkage method. Results   A covalent immobilization of unmodified oligonucleotide on the glass surface was achieved. The platform was prepared for oligomicroarray fabrica

5、tion. Hybridization experiments were showed that the modified surfaces have high fluorescence intensity, low background in contrast unmodified slide. The uniform, steady and regular shaped signal spots of the microarrays indicated that the prepared surfaces were satisfactory in immobilizing unmodifi

6、ed oligonucleotides. Conclusion   The process of the surface preparation is simple and cost effective and can be used for attachment of protein, PNA et cetra.    Keywords: oligonucleotides immobilization; DNA microarray; acrylic acidcoacrylamide copolymer; covalent linkage&#

7、160;   核酸分子的固定是生物分子固定化技術(shù)中重要的組成部分，該技術(shù)在核酸化學、分子遺傳學及生物工程的研究中有著不可代替的作用。在近年發(fā)展起來的以特定核酸片段雜交檢測技術(shù)為基礎(chǔ)的基因芯片或生物傳感器技術(shù)中，生物分子的固定尤其是核酸分子在載體表面的固定是這些技術(shù)在藥物分析、基因表達和功能基因組研究、DNA測序、醫(yī)學診斷等應用中的基礎(chǔ)14。如何在平整致密的表面快速穩(wěn)定地固定核酸分子是芯片制備首先要解決的問題。為了克服目前核酸特別是短片段寡核苷酸在玻片上固定率低和穩(wěn)定性差的缺點，解決其在基因芯片制備和應用中需突破的化學上游技術(shù)問題，本實驗采用丙烯酸、丙烯酰胺這兩種常見的有機聚

8、合物單體，利用共聚反應在氨丙基三甲氧基硅烷硅化后的玻璃表面上進行交聯(lián)聚合，制備能共價結(jié)合(固定)寡核苷酸分子的表面，并打印寡核苷酸探針，最后對寡核苷酸芯片進行雜交檢測與分析。    1  材料與方法    1.1  試劑與儀器    氨丙基三甲氧基硅烷（APS）、碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）等購自美國Fluka公司；丙烯酸、丙烯酰胺、過硫酸胺、NaOH、HCl等購自汕頭試劑廠（分析純）；國產(chǎn)光學顯微載玻片。CMT芯片雜

9、交盒（美國Corning公司）；Pixsys5500基因芯片點樣儀（美國Cartesin公司）；ScanArray Lite基因芯片掃描儀（美國Parkard公司）；GS Gene Linker紫外交聯(lián)儀（美國BIORAD公司）。    1.2  丙烯酸酯聚合物表面的制備方法    顯微玻片的清洗與硅烷化按文獻5所述方法進行，其中硅烷化溶液為10%的APS溶于90%的甲醇溶液。將100片經(jīng)APS硅烷化的玻片浸入11包被液和活化液的混合液中3 h，反應時不斷搖晃，隨后用的ddH2O清洗玻片3次，玻片放入離心機中500 r/mi

10、n離心5 min，烘干，暗盒保存?zhèn)溆?。包被液的配制?.8%丙烯酸和0.2%丙烯酰胺溶于ddH2O中，70 加熱，加熱過程中緩慢加入0.8%過硫酸胺作催化劑。包被液可以在4 保存?zhèn)溆??；罨旱呐渲疲?.1 mol/L碳二亞胺和20 mmol/L N羥基琥珀亞胺酯溶于0.1 mol/L pH為6.0的K2HPO4和KH2PO4的緩沖液中。    1.3  寡核苷酸探針的合成與純化    本實驗中寡核苷酸探針序列見表1，寡核苷酸的合成與純化按照文獻6的方法制備。表1  寡核苷酸探針序列   

11、; 1.4  寡核苷酸微陣列的制備與雜交檢測    1.4.1  寡核苷酸微陣列的制備    將探針1探針12、陽性對照、陰性對照、空白對照（H2O）溶于50%DMSO，充分混勻，終濃度分別調(diào)整至10 mol/L后轉(zhuǎn)移到384孔板中備用。陣列設計成12×12的陣列，每個探針打印6個點，點與點之間的間距為300  m。用Cartesin Pixsys5500基因芯片點樣儀將探針依次打印到未做任何處理潔凈玻片和被丙烯酸酯聚合物修飾后的玻片上，同時進行對照實驗。將打印好的玻片正面朝下置于3×

12、SSC熱水濕盒上方再水合化，然后迅速置入100 烤箱中烤干，用紫外交聯(lián)儀以每塊玻片65 mJ的總能量進行交聯(lián)固定。接著將玻片放入飽和的NaCl濕盒中42 過夜，最后用50 mL封閉液（四氫呋喃、醋酸酐、吡啶的混合液，pH8.0）對芯片表面進行滅活處理，干燥后備用。    1.4.2  寡核苷酸分子的雜交實驗與檢測    首先雜交樣品的制備、雜交樣品的熒光標記按文獻7的方法進行。然后把熒光標記的樣品雜交前加入等體積的2×雜交液（50%甲酰胺、10×SSC、0.2%SDS）95 變性5 min，最大速度離心2

13、 min后冷卻，取2 L滴加到陣列上，蓋上蓋玻片，42 雜交2 h，再依次在2×SSC0.1%SDS、0.1×SSC0.1%SDS、0.1×SSC溶液中清洗芯片，最后滅菌水清洗后，無水乙醇脫水，室溫下干燥。檢測過程：用ScanArray Lite進行熒光信號掃描檢測，掃描分辨率5 m，PMT設置為70%，掃描時激光強度為90%。    2  結(jié)果    經(jīng)丙烯酸酯聚合物表面修飾，寡核苷酸微陣列的制備及雜交檢測，玻片處理前后的雜交結(jié)果見圖1。玻片處理后的探針在芯片上的點雜交熒光信號多，信號強度強，

14、雜交點圓潤，陣列第1行16列和第12行712列為陽性信號點。而未處理的芯片效果明顯較差，僅陽性對照的信號強度比較強。ScanArray Lite基因芯片掃描儀掃描結(jié)果用ArrayPro軟件進行圖象分析和數(shù)據(jù)采集，將每點所有像素的熒光強度均值輸出到Excel軟件進行統(tǒng)計處理。采用公式：均一化值=（該探針所有點熒光強度均值-空白對照所有點熒光強度均值）/（陽性對照所有點熒光強度均值-空白對照所有點熒光強度均值），對數(shù)據(jù)進行扣除背景及均一化處理，結(jié)果顯示玻片處理后的芯片同一性較好（表2）。    3  討論    2.1 

15、; 丙烯酸-丙烯酰胺共聚物表面制備的化學過程    基因芯片研究中，能否快速、穩(wěn)定、精確地將目的DNA片段連接到被修飾的表面，直接影響到基因芯片的質(zhì)量。圖2表示了丙烯酸-丙烯酰胺聚合物表面的連接策略。化學反應過程中丙烯酸和丙烯酰胺單體的反應是一個加成聚合反應，所形成的聚合物中富含羧基（COOH），為與硅烷化的玻片表面連接和活化分子的引入打下了基礎(chǔ)。在玻片的處理中聚合反應和表面活化反應同時進行?；罨航M成中的EDC是一種優(yōu)良的固定化試劑，能夠加速羧酸和氨基之間形成酰胺鍵，保證了硅化的氨基與丙烯酸-丙烯酰胺聚合物反應。另外一種活化分子NHS，除了能與聚合物中的羧基反應

16、外，還可作為活化基團同氨基形成酰胺鍵，這樣所形成的表面成為活化狀態(tài)，易于寡核苷酸分子或DNA分子固定。同時這種衍生方式類似在表面增加的是網(wǎng)格狀的分子層，有利于增加樣品的上樣量。     2.2  寡核苷酸分子在聚合物表面的固定    利用基因芯片技術(shù)，寡核苷酸沉積在芯片表面后，在加熱或紫外照射下，核酸分子與活化表面的N-羥基琥珀酰亞胺發(fā)生共價連接，使DNA分子穩(wěn)定地固定在表面上。有研究報道在寡核苷酸的固定過程中紫外交聯(lián)有利于DNA的固定8。這主要是由于在紫外光照射下能促進核酸中的T堿基與玻片上的氨基作用產(chǎn)生交聯(lián)連接

17、。本實驗采用了每塊玻片65 mJ的總能量對芯片進行照射，促進其固定。    2.3  寡核苷酸芯片的雜交檢測    基因片段在載體表面的固定效率，是指連接在載體上的有效探針量，直接反應了芯片制作質(zhì)量的高低。特別在寡核苷酸固定中，固定效率的高低主要通過雜交實驗后的熒光檢測強度來判斷，它直接影響檢測的靈敏度，并衡量核酸分子的雜交動力學范圍。由圖1和表2的結(jié)果顯示，玻片處理后的探針在芯片上的點雜交熒光信號多，信號強度強，雜交點圓潤、同一性好，說明處理后芯片的固定效率好，達到芯片檢測的要求。    本實

18、驗重復多次，結(jié)果表明以丙烯酸、丙烯酰胺為聚合單體采用共價交聯(lián)法，在玻片上衍生聚合物分子層的方法是可行，處理過程簡單，該分子層能用于未修飾寡核苷酸分子的固定。在基因芯片制作的應用中，固定在該膜表面上的寡核苷酸分子固定效率高，雜交點陣的熒光信號強，穩(wěn)定性好，有著較好的應用前景。    【參考文獻】  1 Gong P, Harbers GM, Grainger DW. Multitechnique comparison of immobilized and hybridized oligonucleotide surface density on

19、commercial aminereactive microarray slidesJ. Anal Chem, 2006,78(7):2342-2351.    2 Lee CY, Gong P, Harbers GM, et al. Surface coverage and structure of mixed DNA/alkylthiol monolayers on gold: characterization by XPS, NEXAFS, and fluorescence intensity measurementsJ. Anal Chem, 2

20、006,78(10):3316-3325.    3 Hacia JG, Sun B, Hunt N, et al. Strategies for mutational analysis of the large multiexon ATM gene using highdensity oligonucleotide arraysJ. Genome Res, 1998,8(12):1245-1258.    4 Abdueva D, Skvortsov D, Tavare S. Nonlinear analysis of GeneChip arraysJ. Nucleic Acids Res, 2006,34(15):e105.    5 Qinghua Wu, Wenli Ma, Rong Shi, et al. An activated GOPSpolyLlysinecoated glass surface for immobilization of 60mer oligonucleotidesJ. En