耐熱DNA聚合酶常見問題

1、耐熱DNA聚合酶常見問題(Thermpholic Polymerases FAQ)  NEB公司研發(fā)的VentR和Deep VentR DNA聚合酶都是克隆于海底高溫噴泉的微生物，其耐熱性能和保真性能遠(yuǎn)高于Taq DNA聚合酶。VentR的半衰期在100°C時是1.8小時，是Taq DNA聚合酶的18倍，而Deep VentR則對高溫的耐受性更強(qiáng)，半衰期是8小時。兩者的保真性能是Taq DNA聚合酶的5-15倍。由于具有3'5'的外切酶活性，可去除錯配的堿基，從而使延伸反應(yīng)順利地進(jìn)行下去，因此，更適用于long PCR反應(yīng)。 在

2、不斷尋找新酶的基礎(chǔ)上，NEB還致力于對原有酶的修飾和改造，VentR（exo-）和 Deep VentR(exo-) DNA聚合酶就是在原有酶的基礎(chǔ)上，去除其3'5'的外切酶活性，使其更適用于雙脫氧法測序和高效率的PCR。雖然保真性能比VentR和Deep VentR有所降低，但仍是Taq DNA聚合酶的2倍。 如何應(yīng)用DNA聚合酶合成415 kb的PCR產(chǎn)物？ 使用正確的酶量。使用具有校讀功能的VentR DNA聚合酶時，有時用量少，效果會更好。使用不具有校讀功能的VentR（exo-）或Deep VentR（exo-）DNA聚合酶時，每100 l反應(yīng)體系

3、中，用24個單位的酶量。如果反應(yīng)體系縮小，相應(yīng)調(diào)整酶量。 采用正確的引物延伸時間，按每延伸1 kb需要1分鐘來計算。當(dāng)使用具有校讀功能的DNA聚合酶時，延伸反應(yīng)時間不要超過計算時間的20。使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶時，請分別嘗試2、4和6 mM的MgSO4濃度。 為什么PCR反應(yīng)后，沒有產(chǎn)物或條帶模糊？ 檢查Mg2+濃度、聚合酶用量及延伸反應(yīng)時間。嘗試不同退火溫度及Mg2+的濃度。用酚/氯仿抽提及酒精沉淀法純化DNA。避免高鹽帶入PCR反應(yīng)體系中。確保dNTP沒有被水解。某些助溶劑如：100 g/ml BSA，110甲酰胺（formamid

4、e）或110DMSO有助于一些引物和模板的結(jié)合。 什么原因可以造成沒有加入模板的陰性對照出現(xiàn)模糊條帶？ 一旦某些Km值較低的DNA聚合酶（特別是具有校讀功能的聚合酶）不能有效地結(jié)合到引物的3'末端，可使引物形成一種特殊結(jié)構(gòu)（primer artifact)。這種結(jié)構(gòu)含有單鏈和雙鏈的區(qū)域，形成引物單鏈或雙鏈的多聚體，很難遷移出上樣孔，或自上樣孔形成模糊條帶。如果出現(xiàn)這種情況，建議降低引物濃度，縮短反應(yīng)時間，或使用VentR（exo-）、Deep VentR（exo-）和Taq DNA聚合酶。 使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶，產(chǎn)生什么樣末端

5、的DNA片段？ 具有校讀功能的DNA聚合酶（如VentR、Deep VentR和9oNm）產(chǎn)生95的平末端。與Taq DNA聚合酶相似，不具有校讀功能的DNA聚合酶，如VentR（exo-）和Deep VentR（exo-）產(chǎn)生兩種末端，其中70是平末端，30是3'末端單個堿基突出的粘性末端。 我想克隆PCR產(chǎn)物，這個PCR產(chǎn)物是用VentR 或Deep VentR DNA聚合酶合成的，選用哪種克隆方法更好？ 最好的方法是：用平末端克隆法將片段插入已去磷酸化的載體上，（或使用NEB平端克隆試劑盒 #E0103)。插入片段的5'末端應(yīng)磷酸化，除非在引

6、物合成時，引物的5'末端已有磷酸基。 PCR產(chǎn)物是否能在PCR反應(yīng)體系中直接磷酸化？ 不能，因為PCR反應(yīng)中的硫酸胺會抑制T4多聚核苷酸激酶活性。可采用膠回收或G25離心柱法來純化DNA。在50 l反應(yīng)體系，加入1×T4 Polynucleotide Kinase Buffer、1 mM ATP 和 小于200 pmol的5'羥基末端的DNA，70°C溫育5分鐘，冰上冷卻后，再加入20個單位的T4多聚核苷酸激酶，37°C溫育30分鐘。 怎樣才能提高PCR產(chǎn)物平滑末端的連接效率？ 載體應(yīng)該去磷酸化以降低自身環(huán)化

7、，插入片段的5'末端應(yīng)具有磷酸基。其它提高連接效率的方法還有：降低ATP在連接反應(yīng)緩沖液中的濃度，增加插入片段與載體的比例或使用快速連接試劑盒（NEB #M2200）。另外，可使用平端克隆試劑盒（NEB #E0103）。 VentR或Deep VentR DNA聚合酶產(chǎn)生平滑末端，可是我要用的克隆試劑盒是針對3'末端單個腺嘌呤堿基突出的粘性末端而設(shè)計的，怎么辦？ 用Taq DNA聚合酶處理PCR產(chǎn)物的平末端。首先用酚、氯仿抽提及2倍異丙醇沉淀，純化DNA，然后將純化后的DNA溶于1× Thermopol Reaction Buffer（隨Taq DNA聚合酶提供），再加入1個單位的Taq DNA聚合酶和200 M dATP，混勻，72°C溫育20分鐘。 能否用VentR或Deep VentR DNA聚合酶來處理Taq DNA聚合酶產(chǎn)物，得到平滑末端的PCR產(chǎn)物？ 能。首先將Taq DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物用酚、氯仿抽提及2倍異丙醇沉淀，得到進(jìn)一步純化的DNA，然后將純化后的DNA溶于1× Thermopol Reactio