時間分辨熒光免疫技術(shù)在乙肝病毒標(biāo)志物定量檢測中的臨床應(yīng)用

1、時間分辨熒光免疫技術(shù)在乙肝病毒標(biāo)志物定量檢測中的臨床應(yīng)用    摘要 目的：探討乙肝患者血清乙肝標(biāo)志物的相互關(guān)系，為乙肝的診治、預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。方法：用TRFIA法定量測定乙肝表面抗原、表面抗體、e抗原、e抗體和核心抗體指標(biāo)。結(jié)果：在720例血清中共檢出13種抗原抗體模式，HBsAg陽性的模式共6種533例，HBsAg檢出率為74.03，且在5 ngml及以下HBsAg檢出率為8.75(63720)；其中1+3+5模式167例占23.19，1+4+5模式313例占43.37，1+5模式21例占2.92%，1+3模式18例占2.5%，1+4模式9例占1.

2、25，1模式5例占0.69。HBsAg陰性模式共6種164例占病例總數(shù)的22.78；其中2模式23例占3.19，4+5模式15例占2.08，2+4+5模式16例占2.22%，2+5模式39例占5.42%，5模式18例占2.5%,2+4模式53例占7.36?？乖贵w全陰性23例占3.19。結(jié)論：TRFIA是測定乙肝患者血清中HBVM含量較特異、靈敏的方法，能反映乙肝病毒的復(fù)制水平和活躍程度；乙肝血清學(xué)標(biāo)志物定量檢測能反映患者體內(nèi)病毒的存在狀態(tài)和機(jī)體的免疫狀況，對疾病診斷、病情監(jiān)測、藥效評價、預(yù)后監(jiān)控及篩選用藥方案等都具有很高的實(shí)用價值。關(guān)鍵詞 乙肝病毒標(biāo)志物；時間分辨熒光免疫技術(shù)；臨床應(yīng)用我國為

3、乙肝病毒(HBV)感染高發(fā)區(qū)，約有1億人為乙肝表面抗原攜帶者。HBV感染后血清學(xué)檢測組合的標(biāo)志模式多且復(fù)雜，臨床常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行乙肝病毒標(biāo)志物(HBVM)的檢測和用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法進(jìn)行HBVDNA的檢測來判斷HBV的感染或療效。由于ELISA法簡單、方便、快速的優(yōu)點(diǎn)在臨床得到廣泛應(yīng)用，但受方法學(xué)本身的限制，它不能提供HBVM的具體含量，只能作為陰陽性判斷，故不可能完成HBV感染的動力學(xué)觀察。用PCR法進(jìn)行HBVDNA的檢測由于受到各種因數(shù)的影響，不能在臨床上廣泛使用，而時間分辨熒光免疫技術(shù)(TRFIA)的出現(xiàn)提供了對HBVM進(jìn)行定量檢測的手段。TRFIA法具有靈

4、敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、定量范圍寬等優(yōu)點(diǎn)1，2。作者采用TRFIA法對720份血清標(biāo)本進(jìn)行HBVM檢測，并對結(jié)果進(jìn)行了分析。現(xiàn)報告如下。1材料與方法1.1標(biāo)本來源本院門診和住院部的720例患者，男435例，女285例，年齡3歲78歲。清晨空腹靜脈取血3 ml送檢。1.2肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物檢測720例患者均以采用TRFIA法檢測血清HBVM(HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc)，TRFIA檢測儀泰萊1及配套試劑由廣州豐華生物工程有限公司提供。陽性標(biāo)準(zhǔn)為：HBsAg0.2 ngml；抗HBsAg10 mIUml；HBeAg0.03 Ncuml；抗HBe2.00 Ncuml；

5、抗HBc0.1 Ncuml。操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。對可疑結(jié)果：如低濃度陽性結(jié)果，HBsAg和抗HBs或HBeAg和抗HBe同時陽性的均進(jìn)行雙孔復(fù)查。1.3統(tǒng)計與分析抗原抗體排列順序：HBsAg；抗HBs；HBeAg；抗HBe；抗HBc。以陽性項(xiàng)目的序號代表該陽性項(xiàng)，同一患者血清HBVM組合稱抗原抗體模式(如1+3+5代表HBsAg，HBeAg，抗HBc同時陽性)，按抗原抗體模式統(tǒng)計分析。2結(jié)果2.1抗原抗體模式實(shí)驗(yàn)中共檢出13種抗原抗體模式，HBsAg陽性的模式共6種，533例，HBsAg檢出率為74.03，且在5 ngml及以下HBsAg檢出率為8.75(63720)；其中1+3+5模式

6、167例占23.19；1+4+5模式313例占43.37；1+5模式21例占2.92；1+3模式18例占2.5；1+4模式9例占1.25；1模式5例占0.69。HBsAg陰性的模式共6種，164例占病例總數(shù)的22.78%；其中2模式23例占3.19；4+5模式15例占2.08%，2+4+5模式16例占2.22；2+5模式39例占5.42；5模式18例占2.5%，2+4模式53例占7.36?？乖贵w全陰性23例占3.19。2.2HBVM濃度在1+3+5模式中HBsAg、HBeAg、抗HBc的濃度分別為：(215.38±98.76) ngml、(1.15±0.82) Ncuml

7、、(12.32±5.16) Ncuml；在1+4+5模式中HBsAg、抗HBe、抗HBc的濃度分別為：(152.59±113.38) ngml、(25.73±12.54) Ncuml、(14.12±8.74) Ncuml；在1+5模式中HBsAg、抗HBc的濃度分別為：(125.38±98.73) ngml、(12.52±5.79) Ncuml；在1+3模式中HBsAg、HBeAg的濃度分別為：(183.56±75.24 )ngml、(1.02±0.74) Ncuml；在1+4模式中HBsAg、抗HBe的濃度分別為

8、：(118.28±67.23) ngml、(24.49±6.89) Ncuml；1模式中HBsAg的濃度為(2.12±0.75) ngml。且1+3+5模式中HBsAg分布在200 ngml以上的占此模式的74.85%(125例)；在1+4+5模式中HBsAg分布在200 ngml以上的占此模式的39.62(124例)；1模式中HBsAg的濃度在0.3 ng/ml6 ng/ml之間。2+4+5模式中抗HBs、抗HBe、抗HBc的濃度分別為：(637.52±578.25) mIUml、(18.24±10.92) Ncuml、(6.34±

9、5.70) Ncuml；2+5模式中抗HBs、抗HBc的濃度分別為：(260.17±75.36) mIUml、0.29±0.11(Ncuml)；2+4模式中抗HBs、抗HBe的濃度分別為：(536.56±300.34) mIUml、(15.12±8.13) Ncuml；4+5模式中抗HBe、抗HBc的濃度分別為：(15.12±11.35) Ncuml、(12.24±10.11) Ncuml；2模式中抗HBs的濃度為(289.34±156.29) mIUml；2+4+5模式中抗HBs的濃度主要分布在870 mlUml以上；2+

10、5模式和2+4模式、2模式中抗HBs的濃度主要分布分別在130 mIUml260 mIUml、130 mIUml420 mIUml之間，5模式中抗HBc的濃度為：0.60 Ncuml±0.28 Ncuml。3討論本實(shí)驗(yàn)中檢出率居前5位的是1+4+5模式(43.47)、1+3+5模式(23.19%)、2+4模式(7.36%)、2+5模式(5.42%)、2模式(3.19%)?？赡芡行┪墨I(xiàn)報道不一致，主要是本資料收集的標(biāo)本絕大部分為乙肝患者血清。對乙肝抗原抗體模式及標(biāo)志物濃度檢測分布情況研究中，在一定程度上可看出乙肝標(biāo)志物出現(xiàn)次序或乙肝臨床轉(zhuǎn)歸情況。感染HBV后，最早出現(xiàn)HBsAg，其次

11、為HBeAg、抗HBc、抗HBe、抗HBs3。實(shí)驗(yàn)中，1+3+5模式中HBsAg濃度顯著高于1+4+5模式、1+5模式、1+3模式、1+4模式、1模式HBsAg濃度，且從實(shí)驗(yàn)中也可見HBeAg及抗HBe的出現(xiàn)與HBsAg的濃度呈一定的關(guān)系4，HBsAg濃度越高HBeAg檢出率越高；有文獻(xiàn)5報道HBVDNA含量與HBeAg、HBsAg的存在有明顯關(guān)系，HBeAg、HBsAg在一定程度上也能反映HBVDNA的復(fù)制程度；1模式HBsAg濃度低，多為急性感染早期或隱性攜帶。2+4+5模式、2+4模式、2模式、2+5模式中抗HBs濃度差異有顯著性(P<0.01)，HBsAg的體液免疫應(yīng)答是T細(xì)胞依

12、賴的，產(chǎn)生的抗HBs認(rèn)為與循環(huán)中病毒清除有關(guān)，故抗HBs是一種保護(hù)性抗體，是對乙肝感染后獲得免疫力的標(biāo)志，乙肝治愈或趨向治愈的象征。1+4+5模式、1+4模式中抗HBe濃度顯著高于2+4+5模式、4+5模式中的抗HBe濃度；有HBsAg陽性或抗HBe陽性模式中抗HBc的濃度顯著高于抗HBs陽性模式中抗HBc的濃度(P<0.01)；隨著HBsAg陰轉(zhuǎn)或抗HBs出現(xiàn)，抗HBc陽性率及濃度也隨之降低，抗HBs出現(xiàn)時抗HBc濃度更低，這與機(jī)體對HBV的免疫應(yīng)答有關(guān)?？笻Be與抗HBc不是保護(hù)性抗體，且抗HBe陽性常伴抗HBc陽性。研究表明抗HBe檢出率為肝癌>肝硬化>慢性乙肝，提示多

13、數(shù)患者HBV感染時間較長，且抗HBe主要見于低濃度HBsAg或抗HBs陽性的急、慢性患者；抗HBc濃度波動與病情呈平行關(guān)系，與病毒增殖和肝細(xì)胞損害有關(guān)，在臨床上常用高濃度或低濃度來判斷乙肝的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，如果檢出高濃度提示患病中，且抗HBc是HBV感染后血清中最早出現(xiàn)的標(biāo)志抗體，是流行病學(xué)調(diào)查的良好指標(biāo)，其效價高，持續(xù)時間長，甚至終生攜帶。近年來醫(yī)學(xué)臨床和預(yù)防的要求對低水平存在的血清學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行有效檢測，具有更重要的臨床和流行病學(xué)意義。在部分HBV感染的人群中，血清表面抗原呈低水平存在，容易造成漏檢。尤其是目前普遍采用的ELISA檢測方法，對低水平人群更容易造成漏檢(ELISA檢測的靈敏度是2

14、ng/ml)。多方面研究表明，低水平血清HBsAg人群占有不小的比例，尤其我國是乙肝的高發(fā)區(qū)，加之人口眾多，此類人群不容忽視。由于檢查方法上的不靈敏，還可導(dǎo)致乙肝病毒通過手術(shù)，輸血等途徑發(fā)生傳播等嚴(yán)重后果。因此，運(yùn)用TRFIA法(靈敏度可達(dá)0.2 ngml)對乙肝5項(xiàng)進(jìn)行定量檢測極大地彌補(bǔ)了ELISA法定性檢測的不足，成為乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物現(xiàn)代臨床檢驗(yàn)的發(fā)展方向。TRFIA技術(shù)具有定量檢測功能，它對HBVM臨床檢測的意義可簡述為：動態(tài)觀察療效和監(jiān)測病情；定量分析HBeAg和抗HBe的濃度變化，可反映病情變化和治療效果；抗HBc濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài)；有利于對慢性肝炎活動性或非活動性的判斷；TRFIA和定量PCR技術(shù)可互相補(bǔ)充；抗HBs的定量測定能夠?qū)σ腋蔚念A(yù)防起到監(jiān)督作用。參考文獻(xiàn)：1Diamandis EP Timeresolved fluorometry in nucleic acid hybridization and western blotting techni