工業(yè)用溶菌酶行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)簡要編制說明

1、.工業(yè)用溶菌酶行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)簡要編制說明1、 工作簡況（一）任務(wù)來源、起草單位、起草人本標(biāo)準(zhǔn)由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院組織上報(bào)，被列入工業(yè)和信息化部2012年行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃，計(jì)劃名稱為工業(yè)用溶菌酶，項(xiàng)目編號2012-1187T-QB。本標(biāo)準(zhǔn)由中國輕工業(yè)聯(lián)合會提出，全國食品標(biāo)準(zhǔn)化中心歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位略。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人略。負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)資料查詢、收集及對比，檢測方法的驗(yàn)證比對，樣品檢測及數(shù)據(jù)整理，標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明的起草、撰寫，行業(yè)內(nèi)征求意見，組織標(biāo)準(zhǔn)的初審討論會及標(biāo)準(zhǔn)報(bào)送等。（二）簡要起草過程標(biāo)準(zhǔn)任務(wù)下達(dá)后，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院針對制定工業(yè)用溶菌酶行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的具體工作進(jìn)行了認(rèn)真研究，確定了總

2、體工作方案，于2012年12月組建了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組。起草工作組首先查閱相關(guān)的國內(nèi)外技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)資料，在參照國際和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合目前國內(nèi)市場產(chǎn)品的實(shí)際情況，初步確定了產(chǎn)品的質(zhì)量技術(shù)指標(biāo)和相應(yīng)的試驗(yàn)方法，形成了標(biāo)準(zhǔn)草案（第一稿）。2013年5月，工作組在北京召開第一次討論會對標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行討論研究，綜合各方意見，對一些尚存在異議的內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步整理，修改成標(biāo)準(zhǔn)草案（第二稿），同時(shí)確定了進(jìn)一步的對比驗(yàn)證工作，2013年6月2014年4月，起草組完成樣品的搜集，測定底物、標(biāo)準(zhǔn)品的購置、轉(zhuǎn)化及試驗(yàn)方法的驗(yàn)證調(diào)整工作。2014年5月，工作組在北京召開第二次討論會，經(jīng)過大家的認(rèn)真、細(xì)致的討論研究，對標(biāo)

3、準(zhǔn)中涉及的主要關(guān)鍵問題達(dá)成共識，會后又經(jīng)多次溝通研究，并于2015年11月修改形成征求意見稿，向行業(yè)內(nèi)公開征集意見。2、 對主要條款的說明（一） 主要內(nèi)容據(jù)起草工作組調(diào)研和查閱，目前FCC Lysozyme（溶菌酶）和JECFA（1992）Lysozyme Hydrochloride（鹽酸鹽溶菌酶）、日本食品添加劑公定書第八版-Lysozyme Japans specification & standard for food additives（食品添加劑溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范）及原衛(wèi)生部2010-23號公告均已公布了溶菌酶的質(zhì)量規(guī)格要求。JECFA的質(zhì)量規(guī)格特指鹽酸鹽溶菌酶；FCC只限定蛋清來源，給

4、出酶活力測定方法，不限工藝，也沒有給出特定質(zhì)量規(guī)格；日本公定書針對溶菌酶產(chǎn)品，工藝上涵蓋原衛(wèi)生部公告的溶菌酶產(chǎn)品，因此，本標(biāo)準(zhǔn)制定綜合考慮上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)給出本標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)要求。對比情況見附表1、附表2。本標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容說明如下：本標(biāo)準(zhǔn)編寫符合GB/T 1.1-2009的規(guī)定。1. 酶活力酶活力對于酶制劑產(chǎn)品即是性能指標(biāo)也相當(dāng)于鑒別指標(biāo)。FCC根據(jù)酶活力定義，直接測定計(jì)算溶菌酶活力，對活力大小沒有給出限值；JECFA針對鹽酸鹽工藝的溶菌酶，以純度指標(biāo)表達(dá)相對酶活，并規(guī)定純度指標(biāo)95%，原衛(wèi)生部2010-23號公告兩個(gè)指標(biāo)全部規(guī)定，但酶活力指標(biāo)的規(guī)定單位為企業(yè)申報(bào)的方法及單位。本標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為活力指標(biāo)與純

5、度指標(biāo)沒有必要同時(shí)設(shè)定，F(xiàn)CC酶活力測定方法快速、簡單，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)酶的使用，因而酶活力采納FCC的定義及計(jì)算，試劑的使用及溶液的配制，考慮操作的方便，給出細(xì)微調(diào)整。一個(gè)溶菌酶活力單位定義為25，pH6.2條件下，使用溶壁微球菌懸濁液在450nm處每分鐘引起吸光度變化為0.001的溶菌酶的量。直接采納FCC的活力單位定義。2. 水分原衛(wèi)生部2010-23號公告，JECFA及日本公定書對溶菌酶的水分要求均限定在6%（固體），本標(biāo)準(zhǔn)與之保持一致。檢測方法采用國標(biāo)GB 5009.3食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定。3. 灰分與原衛(wèi)生部公告一致固體1.5%，液體0.3%。檢測方法采用國標(biāo)GB 500

6、9.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定。4. pH原衛(wèi)生部公告值固體產(chǎn)品3.03.6，液體產(chǎn)品3.04.0；JECFA3.03.6；日本規(guī)定5.0。由于該指標(biāo)與工藝有關(guān)，且溶菌酶在酸性條件下化學(xué)性質(zhì)、熱穩(wěn)定性均較好，且該指標(biāo)與安全性無直接關(guān)系，因此本標(biāo)準(zhǔn)綜合考慮pH規(guī)定在3.07.0的范圍內(nèi)。固體產(chǎn)品1.5%水溶液測定pH。5. 抑菌作用在目前市場上溶菌酶有微生物發(fā)酵、蛋清提取等不同來源，來源不同抑菌作用也差別很大。為了確保溶菌酶的質(zhì)量，在溶菌酶行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，增加定性抑菌試驗(yàn)檢測。抑菌環(huán)直徑6 mm，判為有抑菌作用；抑菌環(huán)直徑6 mm，判為無抑菌作用。2次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用，判為合格。6.

7、食品安全要求應(yīng)符合國家相關(guān)規(guī)定。7. 酶活力的測定標(biāo)準(zhǔn)草稿中酶活測定方法等同轉(zhuǎn)化FCC的方法，但實(shí)驗(yàn)室在驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)直接按FCC方法，無法獲得酶活測定結(jié)果，測定底物濃度與儀器初始濃度存在不匹配的問題，且實(shí)驗(yàn)過程中必須規(guī)定相關(guān)細(xì)節(jié)才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、一致性。因此，本標(biāo)準(zhǔn)中的酶活測定方法參照FCC的測定方法做適當(dāng)調(diào)整，具體調(diào)整如下：測定用底物：為了保證酶活測定的準(zhǔn)確性及一致性，必須指定測定用底物，其中JECFA指定使用ATCC4689溶壁微球菌，底物配制時(shí)按干菌粉給出配制方法及初始底物溶液吸光值；FCC直接指定Sigma M-3700，或同等分析效果的產(chǎn)品。作為一般企業(yè)或質(zhì)檢機(jī)構(gòu)ACTT4689

8、菌種購進(jìn)手續(xù)繁瑣，且存在被告知為國內(nèi)限制購入產(chǎn)品而無法購得的可能。Sigma M-3700為ACTT4689的活菌制品，價(jià)格昂貴，且為一次性使用產(chǎn)品，對于企業(yè)連續(xù)測定成本較高。為了便于標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后測定方法的有效執(zhí)行，起草組委托食發(fā)院菌種中心引進(jìn)ACTT4689菌種，并接種培養(yǎng)配制成不同濃度，配合起草組各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行FCC方法的有效轉(zhuǎn)化。起草過程中有關(guān)單位提出，菌種的接種培養(yǎng)及稀釋度的控制專業(yè)性較強(qiáng)，如果直接要求菌種中心提供合適濃度的菌懸液，又存在運(yùn)輸困難且由于運(yùn)輸、儲存條件的變化造成菌液不穩(wěn)定的情況。因此，本標(biāo)準(zhǔn)制定也考慮自制標(biāo)準(zhǔn)測定用菌粉的可能。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比對，文本給出ACTT4689編號及對應(yīng)CI

9、CC菌種編號，同時(shí)考慮給出CICC菌粉編號。日本也是制定本國菌種編號及標(biāo)準(zhǔn)酶編號。底物溶液：FCC以空氣調(diào)分光光度計(jì)零點(diǎn)，底物溶液的吸光度，450nm下讀數(shù)應(yīng)為1.70.1，或吸光度降低的速度應(yīng)在0.030.06單位/min；本標(biāo)準(zhǔn)以磷酸鹽緩沖液調(diào)分光光度計(jì)零點(diǎn)，然后測定底物溶液的吸光度，450nm下讀數(shù)應(yīng)為0.700.1。酶活力測定步驟：增加“3min之內(nèi)初始吸光度值變化應(yīng)小于等于0.003時(shí)，方可開始測定”，確保底物溶液的穩(wěn)定且沒有受到溶菌酶的污染；增加“反應(yīng)1min后穩(wěn)定，計(jì)算時(shí)忽略最初1min的讀數(shù)”，以保證酶活測定在有效的線性范圍內(nèi)，保證酶活測定的準(zhǔn)確性。；附表1：國內(nèi)外溶菌酶質(zhì)量規(guī)

10、格指標(biāo)對照表項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)本標(biāo)準(zhǔn)原衛(wèi)生部2010-23號公告日本公定書第八版（溶菌酶）JECFA 1992（鹽酸鹽溶菌酶）范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于從雞蛋清中提取、精制等工藝制得的工業(yè)用溶菌酶用離子交換樹脂從雞蛋清中提取溶菌酶，然后經(jīng)洗脫、離心過濾、低壓反滲透過濾、巴氏殺菌制得液體型溶菌酶產(chǎn)品；將液體型溶菌酶進(jìn)行噴霧干燥制得粉末型溶菌酶產(chǎn)品能溶解細(xì)菌細(xì)胞壁物質(zhì)的一種酶制劑，來源于蛋清，用堿性水溶液或鹽溶液處理后用樹脂純化，或用柱純化，或樹脂純化后再結(jié)晶，或加鹽處理從雞蛋蛋清中提取的，由129個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量大約為14000，等電點(diǎn)為10.7。具有酶活性，可以水解細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽性細(xì)菌的外膜中的連

11、接N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的（1-4）鍵；通常以鹽酸鹽型的形式獲取，用于食品加工。必須符合食品加工處理所用酶制品的通用技術(shù)指標(biāo)性狀白色至淡黃色粉末；淺黃色至深褐色液體白色至淡黃色粉末；淺黃色至深褐色液體無味白色粉末白色無味粉末鑒別B：0.01%，pH5.4醋酸鹽緩沖液于279nm281nm處有最大吸收A：可溶于水，不溶于有機(jī)溶劑和濃鹽溶液B：25mg/100mL水溶液，紫外吸光度值252nm281nm含量測定（純度）95%95%溶液透明度80.0%（5mL，1%溶液，pH3.0，必要時(shí)可用稀鹽酸調(diào)pH）pH3.07.03.03.6；3.0-4.0（液體）5.0（3.0g，200mL水

12、）3.03.6水分，%6（固體）6（固體）6.0（固體）6（固體）總干物質(zhì)94%；22%（液體）酶活力符合聲稱3.5107FIP/g；9106FIP/g以干基計(jì)酶活性不小于0.9mg/mg灰分，%1.5（固體）0.3（液體）1.5（固體）0.3（液體）1.5抑菌作用合格氮，%16.817.816.817.8氯，%3.24.2；1.0（液體）4.53.24.2鈉，%0.60.6附表2：國內(nèi)外溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法對照表 標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目本標(biāo)準(zhǔn)FCC日本公定書第八版（溶菌酶）中國藥典（CP）水分，%GB 5009.3取樣1.0g，硅膠減壓2小時(shí)減壓干燥酶活力修改采用FCC，初始吸光度0.70.1（參照藥典）比

13、濁法，以溶壁微球菌培養(yǎng)液為底物，溶菌酶可以溶解溶壁微球菌，使吸光度降低，且其降低程度與溶菌酶的活性成正比。緩沖液pH6.2測定溫度（25）底物溶液球菌濃度3040mg/100mL；對照標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液濃度1mg/ml；將1cm比色皿放入分光光度計(jì)，調(diào)整吸光度零點(diǎn)；吸2.9mL底物溶液于比色皿；最初450nm處吸光度應(yīng)為1.70.1；吸0.1mL標(biāo)準(zhǔn)制備液加入底物溶液，充分混合。記錄3min的吸光度的降低，每15s記錄一次吸光值，吸光值得變化應(yīng)呈線性，每分鐘的變化范圍應(yīng)在0.030.06。重復(fù)操作測定樣品溶液.1個(gè)溶菌酶活力單位定義為25，pH6.2條件下，使用溶壁微球菌懸濁液在450nm處每

14、分鐘引起吸光度變化為0.001的溶菌酶的量。分析1分鐘后穩(wěn)定，計(jì)算時(shí)忽略最初1分鐘的讀數(shù)。用曲線的線性部分（通常在后2分鐘）確定每分鐘吸光度變化的平均值。精確稱取相當(dāng)于50mg活力效能的樣品（以干基計(jì)）用pH6.2磷酸緩沖液配制成一定濃度的樣品溶液；用真空干燥器烘干0.1g酶標(biāo)樣2小時(shí)，精確稱取相當(dāng)于50mg活力效能的標(biāo)準(zhǔn)參考酶，用pH6.2磷酸緩沖液配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取3mL底物溶液至試管35預(yù)熱3min；底物溶液，樣品溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液35預(yù)熱3min；準(zhǔn)確吸取3mL預(yù)熱過的溶液至試管中35反應(yīng)10min；640nm測定吸光度，計(jì)算酶活力底物懸浮液的制備稱取溶酶小球菌3040mg，加磷酸鹽緩沖液(pH6.2)0.51ml,在研缽內(nèi)研磨3分鐘，再加磷酸鹽緩沖液(pH6.2)適量，使總體積約為100ml，使懸浮液于250.1時(shí)，在450nm的波長處測得的吸收度為0.700.05(臨用前配制)。測定法精密量取250.1的底物懸浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波長處測定吸收度，作為零秒