解析大孔樹脂對葛根總黃酮的吸附及分離純化

1、解析大孔樹脂對葛根總黃酮的吸附及分離純化    【摘要】  以三峽庫區(qū)豐富的葛根為材料，研究葛根黃酮的分離純化工藝。方法利用柱層析技術(shù)，比較了4種大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的效果。結(jié)果用AB-8樹脂柱進(jìn)行吸附洗脫，洗脫液為60%乙醇，流速2.4 ml/min，得到的葛根總黃酮（以葛根素計）純度為53.5%，AB-8樹脂的吸附容量為103.2 mg/g。結(jié)論建立了AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的適宜條件，發(fā)現(xiàn)AB-8大孔吸附樹脂在葛根總黃酮的分離純化中有好的表現(xiàn)。 【關(guān)鍵詞】 

2、0;葛根 黃酮 大孔吸附樹脂 分離 純化Abstract:Objective Flavonoids were purified from Radix Puerarise of Yichang.MethodsFour excellent macroretiaclar resins were selected for separating flavonoid in Radix

3、60;Puerarise. ResultsThe extract was absorbed by AB-8 macroporous absorption resin and was eluted with 60% ethanol at 2.4 ml/min eluting speed. The purity of total flavonoids&

4、#160;was 53.5%. The absorptive capacity of AB-8 resin was 103.2% mg/g.Conclusion A feasible technnology was AB-8 for sublimating the total flavonoids in Radix puerariae.Key words:R

5、adix Puerarise;    Flavonoid     Separation    Purification前言大孔吸附樹脂（Macro-reticular Resins）是一種不含交換基團(tuán)的具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。主要是以苯乙烯二乙烯苯為原料，在0.5%的明膠水混懸液中，加入一定比例的致孔劑聚合而成。國外大孔吸附樹脂商品主要是Amberilite XAD1-11Diaion Hp10-20；我國國內(nèi)現(xiàn)以自行試制

6、的大孔吸附樹脂也有很多，包括如天津南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)的X-5，H107，S-8，NKA-9，AB-8，D3520，D4006樹脂；上海醫(yī)藥工業(yè)研究所生產(chǎn)的SIP1300，SIP1400樹脂；天津正天成澄清技術(shù)有限公司生產(chǎn)的ZTC(黃酮專用)樹脂等等。本文利用葛根70%乙醇回流得到的粗提液為原料，比較了AB-8、NKA-9，D3520，D4006等4種優(yōu)良大孔吸附樹脂分別在不同工藝條件下，分離純化葛根總黃酮的效果。探討了AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的工藝方法。1  器材1.1 儀器UV-2201紫外分光光度計；自動柱層析分析系統(tǒng)：層析柱(15mm×

7、;500),HL-2恒流泵，HD-A電腦采集器，HD-3紫外檢測儀（上海瀘西分析儀器廠）。1.2 材料葛根：采自五峰土家族自治縣。葛根素標(biāo)準(zhǔn)品：購于中國藥品生物制品檢定所；AB-8，NKA-9 ，D3520 ，D4006大孔吸附樹脂：購于天津南開大學(xué)化工廠；其它化學(xué)試劑均為分析純。2  方法132.1  葛根粗提液制備采用70%乙醇，對葛根粉以1:10的固液比在85先后浸提兩次，每次3 h；合并濾液調(diào)pH8.5在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓濃縮，以5 000 r/min 在高速離心機(jī)上離心30&#

8、160;min過濾，棄沉淀，得到葛根粗提液也即為吸附原液。2.2  葛根總黃酮含量測定葛根總黃酮含量的測定采用以葛根素為對照品的紫外分光光度法。2.2.1  標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取干燥至恒重的葛根素25mg于50 ml容量瓶中，以95%乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，含葛根素0.5 mg·ml-1，作為儲備液。精密量取儲備液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml，以95%乙醇稀至25.00 ml，搖勻。分別于254 nm波長處測定吸光度，制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并計算回歸方程。2.2

9、.2  含量測定操作取干燥至恒重的干浸膏粉末（或洗脫液的干燥品）25 mg放入50 ml容量瓶中，加入25 ml 95%乙醇，置磁力加熱攪拌器上溫?zé)崛芙?，加乙醇稀釋至刻度，搖勻。吸取1.00 ml于25 ml容量瓶中,加蒸餾水至刻度，搖勻。取1.0 ml乙醇同樣稀釋作空白對照,在254 nm波長處測定吸光度。換算出葛根總黃酮的含量。2.3  柱層析分離純化2.3.1  大孔吸附樹脂預(yù)處理95%的乙醇浸泡35 d，待其充分溶脹后，用乙醇洗至流出液加

10、適量水無白色渾濁現(xiàn)象，再用去離子水洗盡乙醇。2.3.2  樹脂對葛根黃酮的吸附量與解吸率測定準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂裝入帶塞磨口三角瓶中，精密加入葛根浸出原液置磁力加熱攪拌器上，振蕩24 h，待充分吸附后，濾過，測定濾液中剩余黃酮濃度。計算各樹脂室溫下的吸附量和吸附率。向吸附的飽和樹脂中，精密加入95%乙醇，浸泡振蕩24 h，濾過，測定濾液黃酮濃度，根據(jù)黃酮解吸量計算解吸率。2.3.3  提取液吸附及洗脫根據(jù)待分離的提取液樣品中總黃酮含量，選用合適量的處理好的大孔吸附樹脂以濕法裝柱，連接柱層析系統(tǒng)，加入樣品，以去離子水洗脫糖等雜質(zhì)，同時

11、紫外檢測器于280 nm 處檢測。當(dāng)糖等雜質(zhì)被洗脫后，再以60%乙醇洗脫，洗脫液濃縮，檢測總黃酮含量。3  結(jié)果3.1  含量測定的回歸方程建立以“2.2.1”方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立濃度對吸光度的線性回歸方程：A=67.150 7C +0.062 14；相關(guān)系數(shù)r=0.995 8，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.52%，n=6。3.2  吸附量的測定以“2.3.2”方法對AB-8，NKA-9，D4006，D4520等4種大孔吸附樹脂對葛根黃酮浸提液原液的吸附量做測定。結(jié)果見表1。表

12、1  幾種大孔吸附樹脂吸附性能的比較（略）用95%乙醇和70%乙醇對充分吸附后的樹脂進(jìn)行解吸率的測定：向吸附飽和的等量樹脂中精密加入70%乙醇、95%乙醇各30ml浸泡振搖1d，濾過，測定濾液黃酮濃度，根據(jù)吸附量計算解吸率(%)。結(jié)果見表2 。表2  在不同解吸劑中4種大孔樹脂對葛根黃酮的解吸率（略）從表1可看出 AB-8大孔吸附樹脂對葛根黃酮浸提液原液的吸附量最大，NKA-9次之。說明對葛根總黃酮的樹脂柱分離應(yīng)優(yōu)先選用弱極性或極性的樹脂。這是因為葛根黃酮具有酚羥基和糖苷鏈，有一定的極性和親水性，生成氫鍵的能力較強(qiáng)，這樣就有利于弱極性

13、和極性樹脂的吸附，而相對于非極性的樹脂, 對葛根黃酮的吸附量會偏小。從表2可以看出，AB-8大孔吸附樹脂對葛根黃酮浸提液原液的解吸率無論是在95%乙醇還是在70%乙醇中都較其它3種具有較大值。3.3  吸附流速對吸附效果的影響吸附流速對吸附效果的影響主要是影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴(kuò)散。如果流速太高，溶質(zhì)分子來不及擴(kuò)散到樹脂表面，就會發(fā)生漏過。對相同的葛根浸提液在相同條件下，分別進(jìn)行了AB-8樹脂在吸附流速為小流速(2.4 ml/min)，中檔流速(4.8 ml/min)、最高流速(8.6 ml/min)的吸附實驗，結(jié)果見表3。同時比較了這3種情況