蘇提取物抗氧化活性及酚性成分的研究

1、蘇提取物抗氧化活性及酚性成分的研究    【摘要】     目的研究紫蘇體外抗氧化活性。方法在測定紫蘇各酚性成分含量基礎(chǔ)上，采用體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，研究其DPPH清除能力、總還原力和抗脂質(zhì)體氧化能力。結(jié)果75%乙醇和50%丙酮提取物具有良好的抗氧化活性；紫蘇提取物中總黃酮、原花色素含量與其抗氧化能力之間呈正相關(guān)。結(jié)論紫蘇有顯著的抗氧化活性，呈一定的量-效關(guān)系。其抗氧化活性可能與黃酮類化合物有關(guān)。紫蘇提取物可作為一種良好的天然抗氧化劑應(yīng)用于臨床。     【關(guān)鍵詞】

2、60; 紫蘇 總黃酮 原花色素 抗氧化活性    紫蘇為唇形科紫蘇屬Perilla frutescens (L.) Britt.一年生草本植物，是傳統(tǒng)的藥食兩用中藥，在江浙各地均有種植，資源豐富，價(jià)格低廉。其主要含有紫蘇苷、原花色素、紫蘇素、木犀草素和芹黃素等多酚類化合物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗衰老、清除和抑制自由基等作用1。有研究表明，紫蘇葉中含有豐富的黃酮類化合物，具有清除自由基、抗衰老作用；紫蘇的水溶性色素亦具有一定的抗氧化活性23。目前國內(nèi)外研究主要集中在紫蘇籽揮發(fā)油成分上，對紫蘇尤其是紫蘇的酚性成分研究較少。本文通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，確定紫蘇有效部位

3、抗氧化活性及酚性成分組成，為其臨床應(yīng)用及各種成分的抗氧化藥理作用研究提供理論依據(jù)。1  儀器及試劑1.1  儀器BS224S精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司），KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。1.2  試劑和材料紫蘇采自浙江杭州，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)資源鑒定教研室姚振生教授鑒定為唇形科紫蘇屬植物Perilla frutescens (L.) Britt.，粉碎后過40目篩。蘆?。ㄅ?00080-20030）、兒茶素（批號877-200001）、沒食子酸（批號11

4、0831-200302），均購自中國藥品生物制品檢定所；大豆卵磷脂（批號2075523）、DPPH（批號095K1452），均購自sigma公司。其他試劑均為分析純。2  方法與結(jié)果2.1  供試品溶液的制備取5 g紫蘇藥材粉末，分別按表1加入20倍量提取溶劑，70水浴提取2次，1 h/次，合并濾液，濃縮至干，臨用前配成所需濃度，作為供試品溶液。2.2  紫蘇酚性物質(zhì)的含量測定46采用FeCl3-K3Fe(CN)6比色法，以沒食子酸為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定紫蘇中總酚酸含量；采用香草醛/硫酸比色法，以兒茶素為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定其原花色素含量；采用堿式鋁鹽比色法，

5、以蘆丁為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定其總黃酮含量。2.3  抗氧化活性實(shí)驗(yàn)792.3.1  清除自由基活力取提取物適量，加入25 g/ml的DPPH甲醇溶液3.5 ml，快速混勻，30 min后測定在516 nm處的吸光度。計(jì)算DPPH清除率：清除率(%)=（1- DPPHt/DPPHt=0）×100%。    其中DPPHt表示30 min時(shí)體系的吸光度；DPPHt=0表示0時(shí)刻體系的吸光度。2.3.2  還原力測定取提取物適量，加入磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）2.5 ml及1%鐵氰化鉀溶液1.5 ml，50保

6、溫20 min后，加入10%三氯乙酸1.5 ml，混勻后取2.5 ml，加入蒸餾水2.5 ml及0.1%三氯化鐵0.3 ml。在700 nm處測定反應(yīng)液吸光度值。吸光度值越大，表示還原力越強(qiáng)。2.3.3  脂質(zhì)體氧化法將大豆卵磷脂分散于去離子水中，20 kHz超聲波處理30 min，周圍以冰水冷卻，制得大豆磷脂濃度為0.8%的人工脂質(zhì)體。取20 ml脂質(zhì)體，加入提取物，以10 mmol乙酸銅20 l催化氧化反應(yīng)，混勻后放置于回轉(zhuǎn)式恒溫水浴振蕩器上，于暗處37、100 r/min進(jìn)行開口氧化實(shí)驗(yàn)，每隔一定時(shí)間測定共軛二烯氫過氧化物及丙二醛生成量。    共

7、軛二烯氫過氧化物(CD)的測定：取1 ml氧化液，溶于3 ml甲醇，于234 nm處測定其吸光度，以摩爾消光系數(shù)=26 000 L·mol-1·cm-1計(jì)算脂質(zhì)體體系中共軛二烯氫過氧化物的生成量（mmol/kg卵磷脂）。    丙二醛（MDA）的測定：取1.5 ml氧化液，加入1 ml MDA溶液，測定在532 nm處的吸光度，以摩爾消光系數(shù)=1.56×105 L·mol-1·cm-1計(jì)算丙二醛的生成量（mmol/kg卵磷脂）。    抗氧化效果用抑制率表示：抑制率(%)=（1-處理氧

8、化產(chǎn)物生成量/空白氧化產(chǎn)物生成量）×100%    結(jié)果見表1及圖14。表1  紫蘇酚性物質(zhì)組成及抗氧化作用結(jié)果（略）圖1  紫蘇提取物的還原力圖2  紫蘇提取物對DPPH的清除作用（略）圖3  丙二醛的生成（略）    由表1和圖14可知，紫蘇各提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可提高自由基的清除率，促進(jìn)Fe3+的還原和抑制卵磷脂氧化產(chǎn)物的生成。其中，75%乙醇提取物自由基的清除率最強(qiáng)，50%丙酮提取物的還原力最強(qiáng)，兩者均可顯著抑制自由基的產(chǎn)生，延長CD生成的峰值時(shí)間，減少同期各時(shí)段MD

9、A的生成量。圖4  共軛二烯氫過氧化物的生成（略）2.4  酚性物質(zhì)組成與抗氧化活性相關(guān)性分析以原花色素(X1)、總黃酮(X2)和總酚酸(X3)含量為橫坐標(biāo)，還原力(Y)為縱坐標(biāo)，采用SPSS11.5軟件對表1結(jié)果進(jìn)行線性關(guān)系考察，得方差分析結(jié)果(見表2)和回歸標(biāo)準(zhǔn)殘差正態(tài)P-P圖（圖5）。表2  方差分析表（略）由表2和圖5可知，P<0.01，自變量(Xn)與因變量(Y)服從正態(tài)分布，證明紫蘇各酚性物質(zhì)含量與還原力之間存在顯著的線性關(guān)系。進(jìn)而作多元線性回歸分析，得回歸系數(shù)分析。結(jié)果見表3。圖5  回歸標(biāo)準(zhǔn)殘差正態(tài)P-P圖（略）表3  回

10、歸系數(shù)分析（略）由表3可知，紫蘇酚性物質(zhì)含量對還原力的總體回歸方程為：Y=0.160-0.534X1+0.024 92X2+0.018 29X3。    為消除度量單位的影響，進(jìn)一步采用標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)化回歸方程：Y=-0.491X1+0.468X2+0.056X3。    在95%可信區(qū)間內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)r=0.982 8。證明回歸方程真實(shí)、可靠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可用于替代實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，并對回歸方程各項(xiàng)作顯著性檢驗(yàn)。    其中，總酚酸含量對還原力的影響P>0.05，無顯著性差異。而

11、原花色素及總黃酮含量P圖6  紫蘇提取物抗氧化活力與原花色素含量的關(guān)系（略）圖7  紫蘇提取物抗氧化活力與總黃酮含量的關(guān)系（略）    同法，對紫蘇提取物與自由基清除率、CD抑制率及MDA抑制率進(jìn)行相關(guān)性研究，結(jié)果表明，總黃酮及原花色素含量與自由基清除率之間相關(guān)系數(shù)分別為0.827 1和0.807 3，具有一定相關(guān)性。其余相關(guān)性均較差（R20.6，P>0.10），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    因此，紫蘇體外抗氧化作用主要可能與其總黃酮及原花色素含量有關(guān)，并且其抗氧化作用隨著提取溶劑極性增大而增強(qiáng)。3  討論

12、    自由基是生物體生化反應(yīng)的普遍介質(zhì)?，F(xiàn)代研究表明，許多疾病如心腦血管疾病、肝硬化、癌癥以及人體衰老等過程都與自由基的作用有關(guān)10。目前在醫(yī)療和食品領(lǐng)域使用較多的是合成抗氧化劑，如BHT、BHA等，對生物體有潛在的毒副作用。黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。其主要通過酚羥基與自由基進(jìn)行抽氫反應(yīng)生成穩(wěn)定的半醌自由基，從而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到抗氧化作用，且高效、低毒11。因此，越來越受到國內(nèi)外醫(yī)藥工作者的重視。    現(xiàn)代研究表明，紫蘇中黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗衰老、清除和抑制自由基等作用,幾乎可

13、與人工合成抗氧化劑BHA 媲美,且安全無毒副作用12。本研究通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，考察紫蘇各提取部位DPPH清除能力、總還原力和抗脂質(zhì)體氧化能力，并對各酚性成分進(jìn)行含量測定。實(shí)驗(yàn)表明，75%乙醇和50%丙酮提取物具有良好的抗氧化活性；其中總黃酮和原花色素含量與自由基清除率、還原力呈正相關(guān)，黃酮類化合物可能是其抗氧化作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，可為紫蘇的開發(fā)利用及其藥理作用機(jī)制的研究提供參考。    【參考文獻(xiàn)】  1 王玉萍,楊峻山,趙楊景,等.紫蘇類中藥化學(xué)和藥理的研究概況J.中國藥學(xué)雜志,2003,38(4): 250.2 殷朝洲,李保存,何林沖.紫

14、蘇的開發(fā)利用J.植物雜志,1999,4: 18.3 余小林,徐步前,胡卓炎,等.兩種紫蘇水溶性色素物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的研究J.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,1(1):85.4 付煜榮,張萬明,陳桂敏,等.景天三七中沒食子酸和總酚酸含量測定J.中成藥,2006,28(7): 1016.5 Sun B,Ricardo-da-Silva JM,Spranger I.Critical factors of vanillin assay for catechins and proanthocyanidinsJ.J Agric Food Chem,1998,46:4267.6 王薇,余陳歡,吳巧鳳.響應(yīng)面分析法優(yōu)

15、化白蘇中總黃酮的超聲提取工藝J.中藥材,2007,30 (12):1606.7 Sánchez-Moreno C, Larrauri JA, Saura-Calixto F. Free radical scavenging capacity and inhibition of liqid oxidation of wines,grape juices and related polyphenolic constituentsJ.Food Resint ,1999,32:407.8 Jayaprakasha GK,Singh RP,Sakariah KK.Antioxidant activity of grape seed (Vitis vinifera) extracts on peroxidation models in vitroJ.Food Chem,2001,73:285.9 孫 蕓