重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對阿爾茨海默病學(xué)習(xí)記憶功能的預(yù)保護研究_圖文

1、重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對阿爾茨海默病學(xué)習(xí)記憶功能的預(yù) 保護研究陶華英 1,田心 2*1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所神經(jīng)生理室,天津(3000522天津醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系,天津 (300070E-mail :摘 要:重復(fù)經(jīng)顱磁刺激 (repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS可對有記憶主訴者 的腦認知功能產(chǎn)生積極的影響 22。本文針對經(jīng)顱磁刺激的神經(jīng)保護作用,將其用于 AD 的保 護性干預(yù),通過 Morris 行為學(xué)檢測及電鏡下形態(tài)學(xué)觀察在進行 AD 造模之前,預(yù)先給予大鼠 rTMS 對 AD 學(xué)習(xí)記憶功能的預(yù)保護作用。結(jié)果顯示預(yù)先施加低

2、頻 (LFrTMS-AD及高頻 (HFrTMS-AD rTMS組、直接造模組(AD 較對照組 Morris 水迷宮行為測試的全時程及末 2天平均逃避潛伏期顯著均延長; 在平臺象限的游泳時間和路程占總游泳時間和總路程的百分 比均明顯下降;這一結(jié)果在 AD 組更為顯著,與兩個 rTMS 干預(yù)組均存在統(tǒng)計學(xué)差異;而 LFrTMS-AD 組較 HFrTMS-AD 組潛伏期短,百分比值高 (P<0.05。電鏡下 AD 組海馬 CA3區(qū)神 經(jīng)細胞突起腫脹,線粒體腫脹嵴消失,突觸結(jié)構(gòu)扭曲變形; rTMS 干預(yù)組神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)大致 完整,突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)稍有改變或基本正常。上述結(jié)果說明:1. 預(yù)先施加 rTM

3、S 能減輕 AD 造 模對神經(jīng)元及突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷,對學(xué)習(xí)記憶功能具有一定的保護作用,且低頻 rTMS 較 高頻效果更顯著; 2. rTMS對 AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能保護作用的可能機制是:通過交變磁場 (感 應(yīng)電流的生物學(xué)效應(yīng),增高了與學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)營養(yǎng)、保護有關(guān)的物質(zhì)(如 BDNF 水平, 進而實現(xiàn)其對神經(jīng)元、突觸結(jié)構(gòu)以及學(xué)習(xí)記憶功能的保護作用。關(guān)鍵詞 :重復(fù)經(jīng)顱磁刺激;阿爾茨海默病; Morris 水迷宮; 淀粉樣蛋白;鵝膏酸;預(yù)保護; 學(xué)習(xí)記憶阿爾茨海默病, ( Alzheimers Disease , AD , 是人類老年期最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng) 原發(fā)性退行性病癥之一。 我國六十歲以上

4、人 群患病率為 3-5%, 85歲以上為 40-60%, 估計我國現(xiàn)有 700-800萬 AD 患者,這一數(shù) 字還將隨人口老化程度增加而增長。 該病起 病隱匿,早期可能僅有記憶困難或輕度健 忘, 往往難以及早察覺。 當病人逐漸出現(xiàn)記 憶障礙 (近記憶及記憶保持障礙為主 、 認 知功能障礙、 行為異常和社交障礙時, 往往 病情進行性加重,通常在 2-3年內(nèi)喪失獨立 生活能力,并常因并發(fā)癥而死亡。當前對 AD 尚缺乏有效的防治手段和 客觀的特異性早期診斷的生物學(xué)標志 , 對 于 AD 的治療只限于延緩發(fā)病和疾病進展, 因此對 AD 的防治已成為 21世紀醫(yī)學(xué)研究 的熱點和難點, 尋找有效、 費用低

5、廉且易于 實現(xiàn)的預(yù)防方法具有重要社會意義。近十年來,作為一種非侵入性、無痛、 易行的刺激方法, 日益成為神經(jīng)科疾病的臨 床診斷治療和研究的新途徑。 rTMS 已被應(yīng) 用到神經(jīng)科學(xué)的許多研究領(lǐng)域, 如大腦感覺 和運動傳導(dǎo)通路的研究、學(xué)習(xí)和記憶的研 究、 認知和語言功能的定位研究等, 并對腦 血管病、 帕金森氏病、 偏頭痛和多種心理疾 患取得了較好的臨床治療療效。 多項研究表 明在常規(guī)臨床參數(shù)和標準情況下, rTMS 不 但不會引起神經(jīng)組織損傷和出血, 而且還具 有減輕腦水腫、保護缺血神經(jīng)元的作用 9,10,11,12。 最新研究還指出 rTMS 可募集參與 記憶編碼過程的代償性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò), 因而可

6、對 有記憶主訴者的腦認知功能產(chǎn)生積極的影 響 22。鑒于 AD 最早出現(xiàn)的臨床癥狀即為近 記憶減退, 即使僅有記憶主訴并保持正常認 知水平 , 亦有可能在未來一段時間進展為 AD , 因此在出現(xiàn)典型的 AD 臨床癥狀前, 施 加 rTMS ,有可能對有記憶主訴者的學(xué)習(xí)記 憶功產(chǎn)生保護作用。 以此為切入點, 本文針 對經(jīng)顱磁刺激的神經(jīng)保護作用, 首次將其用 于 AD 的 保 護 性 干 預(yù) , 即 在 造 模 前 給 予rTMS ,以研究 rTMS 對 AD 模型的學(xué)習(xí)記憶 功能的預(yù)保護作用,為 AD 的臨床預(yù)防提供 實驗依據(jù)和方法。1.材料與方法1.1 實驗動物及分組Sprague-Dawle

7、y (SD 大鼠, 5月齡, 雌雄各半,雌鼠體重 250-350g ,雄鼠體重 350-450g, 由軍事科學(xué)院實驗動物中心提 供(合格證號:0056093。 12h 光照, 12h 黑暗。室溫維持在 25±1 。所有涉及動物 的實驗均按美國國立衛(wèi)生研究院(NIH 頒 布的 “ 實驗動物的照料和使用指南 ” 的要求 進行。將全部大鼠按體重隨機分為 4組,每組 12只, 雌雄各半, 分別為:1. 預(yù)先低頻 rTMS 組 (LFrTMS-AD; 2. 預(yù) 先 高 頻 rTMS 組 (HFrTMS-AD; 3. 直接造模組(AD ; 4. 空白對照組。1.2 實驗方法預(yù) 先 分 別 對 L

8、FrTMS-AD 組 、 HFrTMS-AD 組大鼠施加低頻及高頻 rTMs 后 (參數(shù)見后述 ,采用腦內(nèi)立體定位,雙側(cè) NBM 核聯(lián)合注射 A 和鵝膏酸 (Ibo 的方法, 對 rTMS 干預(yù)組及 AD 組大鼠進行 AD 造模, 并分別進行大鼠學(xué)習(xí)記憶功能測試及形態(tài) 學(xué)檢測。1.2.1 AD模型大鼠的制備大鼠用烏拉坦腹腔注射 (33mg/Kg體重 麻醉后, 置于腦立體定位儀上, 定位腦 NBM 核, 位點為 Bregma 點向后 1.8mm ; 正中旁開 2.8mm ;硬腦膜下 7.0mm 。采用微型電鉆, 左右對稱各鉆一孔(直徑 0.8mm , 由微注 射泵每側(cè)分別注射 A 1-40 4&

9、#181;l(含 A 1-404µg, 已在 37 孵育 1周 及 Ibo 1µl(含 Ibo 1µg, 20min 內(nèi)注射完畢,留針 10min 。術(shù)后常規(guī) 飼養(yǎng), 對出現(xiàn)驚厥者給予少量安定 (肌肉注 射,視體溫情況給予抗生素。 1.2.2 AD模型大鼠的 Morris 水迷宮行為學(xué) 檢測各組大鼠均在購入后,經(jīng) 10天適應(yīng)性 飼養(yǎng),開始進行初次 Morris 水迷宮測試。于 造模術(shù)后 3周,各組大鼠再次進行 Morris 水 迷宮測試。 包括定位航行實驗和空間搜索試 驗。定位航行實驗:歷時 4天, 第 1天大鼠自 由游泳 2min (隨機點入水 , 無平臺,從第

10、 2天起,每天分為兩個訓(xùn)練時段(間隔大于 8小時,每個訓(xùn)練時段訓(xùn)練 4次,每次均由 不同象限入水, 記錄大鼠尋找并爬上平臺所 需時間 (即逃避潛伏期 。 本實驗設(shè)定大鼠在 平臺停留時間大于 2秒為找到平臺;如果在 120秒內(nèi)未找到平臺,則將其引至平臺,使 其停留 20秒,其逃避潛伏期記為 120秒。 空間搜索試驗:第 5天撤除平臺,大鼠 由 象限入水, 同步記錄其 120秒運動軌跡。 計算其在平臺所在象限的游泳時間及游泳 路徑長度占總游泳時間及總路徑長度的百 分比。1.2.3 rTMS的實施方法及參數(shù)確定采 用 丹 麥 Meditronic 公 司 Maglite Pro-25型磁刺激器,選用

11、聚焦效果較好的 “8” 字型刺激線圈, 內(nèi)徑 10mm , 外徑 80mm, 厚度 60mm 。施加刺激時,將 “8” 字線圈中 心對準清醒大鼠矢狀縫的中央點, 線圈表面 緊貼頭皮,平行于大鼠頂骨。本文中造模前對 LFrTMS-AD 組采用的 刺激參數(shù)為:20個串 /日, 20個 pulse/串,刺 激頻率為 1Hz ,連續(xù)刺激 5天為一療程,共 4個療程, 療程間隔為 1周; HFrTMS-AD 組刺 激頻率為 5Hz , 其他刺激參數(shù)同 LFrTMS-AD 組。限于實驗條件,本文參照 Luft 等人對大 鼠 rTMS 所測得的運動閾值 14,刺激強度選 定為 0.4-0.5 Tesla。1

12、.3 海馬 CA3區(qū)超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察的 動物取材隨機選取 HFrTMS 組、 LFrTMS 組、直接造模組及空白對照組大鼠各 1只,根據(jù) Pellegrino 大鼠腦立體定位圖譜,迅速切取 大鼠海馬 CA1及 CA3區(qū)腦組織,立即投入 2%戊二醛固定液中(含 3%新鮮多聚甲醛 1%鋨酸后固定 1h ,常規(guī)乙醇、丙酮脫水、 固定, Epon 8l2包埋, LKB 超薄切片,醋酸 鈾、檸檬酸鉛雙重染色,日立 H-600透射電 鏡觀察并拍片。1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計用 SPSS 統(tǒng)計軟件包進行處理,數(shù)據(jù)以 平均值加減標準差 (±s 表示。采用獨立樣 本 t 檢驗對以下各組指標均數(shù)進行比較,顯 著性

13、水平為 P<0.05.2.結(jié)果本課題采用 NBM 核雙側(cè)聯(lián)合微量注射 A 及 Ibo 的造模方法,由預(yù)先經(jīng)過 rTMS 保護性干預(yù)的大鼠制備 AD 模型, 并通過行 為學(xué) (Morris 水迷宮 及檢測, 與對照組比 較, 對 AD 大鼠模型進行驗證的同時, 通過 各組間的比較探索 rTMS 對 AD 認知功能的 保護作用,結(jié)果如下:2.1 造模前大鼠 Morris 水迷宮測試 結(jié)果SD 大鼠購入后飼養(yǎng) 10日,于造模前, 各組均進行首次 Morris 水迷宮行為學(xué)測試。 定位航行試驗結(jié)果顯示, 造模前各組大鼠在 第二天均可出現(xiàn)逃避潛伏期的大幅下降, 以 后逐漸趨于穩(wěn)定。 為比較大鼠獲取

14、信息的能 力, 本文分別計算了各組在訓(xùn)練末 2天內(nèi)及 全部訓(xùn)練時段的總平均逃避潛伏期, 如圖 1所 示 , 各 組 間 差 異 均 無 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 (p>0.05 。在空間探索試驗中,各組間在 平臺所在象限的游泳時間及在原平臺象限 游泳路徑長度占總路徑長度的百分比均差 異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (p>0.05 , 見圖 2所示。 Fig.1 The result of place navigation test before AD model established Fig.2 The result of special probe test before AD model est

15、ablished Fig.3 The latest 2 days average escape latency before and after AD model established2.2造模后 Morris 水迷宮測試結(jié)果 (1定位航行試驗聯(lián)合注射 A 與 Ibo 的各造模組大鼠末 2天逃避潛伏期及全時段總平均逃避潛伏 期均較自身造模前及 對照組均不同程度延 長(圖 3、圖 4 ;其中 AD 組較 rTMS 組更 為顯著 (P<0.01。而在兩個 rTMS 組中, HFrTMS-AD 組又較 LFrTMS-AD 各潛伏期 長 (P<0.05 。 Fig.4 The whole

16、 average escape latency before andafter AD model established a.marginal b.random c. tendency dstraightFig.5 4 typical traces of movement in spacial probetestFig.6 Swimming time in platform-quadrant beforeand after AD model establishedFig.7 The percentage of swimming distance in platform-quadrant bef

17、ore and after AD established(2空間探索試驗經(jīng)過 4天訓(xùn)練, 第 5天撤去 Morris 水迷宮的平臺,各組大鼠均由 I 象限入水,進行空 間探索試驗, 游泳時間為 120s 。 各組大鼠搜 索 平 臺 的 運 動 策 略 包 括 :直 線 式(straight、趨向式 (tendency、邊緣式 (marginal及隨機式 (random, 如圖 5所示。 其中直接造模組為邊緣式及隨機式 (大 約各占 50% ; 空白對照組中, 約 70%為直 線式,其它為趨向式; rTMS 組多為隨機式 及趨向式。由此可見 AD 模型大鼠的空間記 憶能力受損最為嚴重, rTMS

18、 組受損程度較 AD 輕。此外, A 與 Ibo 藥物注射組的平臺所 在象限游泳時間、 在原平臺象限游泳路徑長 度占總路徑長度的百分比均較造模前明顯 下降(p<0.01 ,見圖 6、圖 7;其中以直接 造模組最為顯著; 同時, 其在平臺所在象限 游泳時間及在原平臺象限游泳路徑長度占 總路徑長度的百分比均較未造模組降低。2.3 各組大鼠海馬 CA3區(qū)的電鏡觀察結(jié)果 對 LFrTMS-AD 組、 HFrTMS-AD 組、 直接造模組 (AD組 及對照組大鼠海馬 CA3區(qū)組織進行電鏡檢測, 從神經(jīng)元胞體及細胞 器、突觸結(jié)構(gòu),血腦屏障等方面進行觀察:在 AD 組大鼠海馬 CA3區(qū),可見神經(jīng)細胞

19、突起腫脹, 線粒體腫脹細胞核皺縮變形, 染 色質(zhì)聚集成大的團塊, 邊緣化、 附著核糖體 脫顆?，F(xiàn)象及多聚核糖體解聚,空泡較多。 突觸多有腫脹, 結(jié)構(gòu)扭曲不清, 微血管管腔 狹窄,內(nèi)皮細胞腫脹,參見 Fig.8, Fig.9。 LFrTMS-AD 及 HFrTMS-AD 組突觸形態(tài)較 好, 結(jié)構(gòu)清晰, 突觸前小泡豐富, 突觸膜和 突觸間隙基本正常, 僅在 HFrTMS-AD 組可 見部分樹突輕度腫脹,其內(nèi)可見少量微管, 多為不整形物質(zhì)及變性的管腔樣結(jié)構(gòu), 參 見 Fig.10、 Fig.11。 Fig. 8 Marked synaptic alteration (arrow in the CA3

20、hippocampus in AD group (×12,000.Fig. 9 The nucleus alteration and the vacuoles in CA3(arrow hippocampus in AD group (×10,000Fig.10 The quasi-normal synapse and neuron in CA3 hippocampus in LFrTMS-AD group (×12,000Fig.11 The quasi-normal synaptic Morpheus andstructure with light dendr

21、ite intumesce(arrow inCA3 hippocampus in HFrTMS-AD group (×12,000 3. 討論 AD 動物模型的制備方法有多種。注射 藥物采用 A，部位選擇海馬區(qū)的 AD 造模 方法最為常見。不僅如此, 在 AD 臨床的早 早期以顯著的單純性記憶損害為特征癥狀， 大量研究證實這一癥狀始于海馬突觸效率 的細微下降， 這種改變先于神經(jīng)元直接發(fā)生 變性， 并且突觸的這種功能障礙可能由可播 散的 A 寡聚體引起15?；诖?，本文采用 A 作為制備 AD 突觸功能及認知功能障礙 模型的藥物之一。 鑒于 A 及 Ibo 可導(dǎo)致 NBM 膽堿能大 神

22、經(jīng)元潰變， 神經(jīng)核團的面積變小， 從而損 害從 NBM 到新皮層膽堿能投射系統(tǒng)， 大腦 皮層和海馬 ChAT 活性和 AChE 活性降低， 大腦皮層和 M 受體結(jié)合位點（Rt）下調(diào)， 最終導(dǎo)致明顯的學(xué)習(xí)和記憶功能改變,并發(fā) 現(xiàn)隔內(nèi)側(cè)損害產(chǎn)生短期或工作記憶損害， 雙 側(cè)損害時還可產(chǎn)生長期記憶損害 23,24 HFrTMS-AD 組更為顯著 (P<0.05。以上結(jié) 果顯示預(yù)先給予 rTMS 可對 AD 模型大鼠的 學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生一定的保護作用; 但是 這一保護作用是在一定程度上的， 不能根本 消除 A 及 Ibo 對突觸及神經(jīng)元的毒性作 用。 雖然rTMS對神經(jīng)保護作用機理尚須探 索，但已

23、有研究證實對正常大鼠施加rTMS 后可在海馬區(qū)觀察到BDNF表達增加，特別 CA 是在海馬CA3、 3c區(qū)和顆粒細胞層及皮層 內(nèi) BDNF mRNA及其蛋白質(zhì)含量顯著增 高，而且BDNF是海馬依賴性學(xué)習(xí)及LTP誘 導(dǎo)的重要組成 19,20并可使二者的功能受損 成為可逆的過程21。 此外，BDNF還對正 常成年大腦中的前腦膽堿能神經(jīng)元具有神 經(jīng)營養(yǎng)、 保護和修復(fù)作用， 且可調(diào)節(jié)突觸功 能和神經(jīng)元對外界信號的敏感性。 大量的證 據(jù)顯示BDNF可阻止動物實驗性損傷或與 正常老年有關(guān)的膽堿神經(jīng)元退化， 改善動物 行為缺失。 另有研究報告在對正常大鼠施加 rTMS后，在其腦脊液及其體外海馬HT22細 胞

24、培養(yǎng)液距發(fā)現(xiàn)分泌性淀粉樣蛋白前體 （sAPP）的濃度明顯增加，提示了神經(jīng)保 護作用。sAPP 可由神經(jīng)元釋放出來，具有 神經(jīng)營養(yǎng)保護機能， 可促進神經(jīng)元突起和突 觸發(fā)生作用。由此筆者有理由推測，rTMS 對于AD大鼠認知功能的保護作用的機制可 能是： 通過其磁場的生物學(xué)效應(yīng)， 增強了與 認知及神經(jīng)營養(yǎng)、保護有關(guān)的物質(zhì)BDNF及 sAPP水平進而實現(xiàn)其對神經(jīng)元、突觸以及 認知功能的保護作用。因此, rTMS 后 BDNF及sAPP在AD模型大鼠海馬區(qū)的水平 變化值得進行深入研究, 以明確其作用發(fā) 作機理。 鑒于外源性 BDNF 不能通過血腦屏障， 只有直接注入腦內(nèi)才具有神經(jīng)元保護作用， 所以通過

25、 rTMS 提高腦內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶密切 相關(guān)的海馬部位的 BDNF 水平是目前腦內(nèi) 獲取 BDNF 的經(jīng)濟、有效途徑，這也可能 正是 rTMS 神經(jīng)保護作用的主要機制。 由此 筆者認為低頻率、 安全強度的 rTMS 可保護 -6- ，故 本研究中采用雙側(cè) NBM 核聯(lián)合注射 A 及 Ibo 的造模方法對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能造成損 害， 其中長期記憶的損害在本實驗中可將再 次進行 Morris 水迷宮時前次測試的殘留記 憶對實驗結(jié)果的影響降至最低， 顯示出較為 明顯的優(yōu)越性。 Morris 水迷宮測試結(jié)果顯示， 造模后預(yù) 先 施 加 低 頻 (LFrTMS-AD 及 高 頻 (HFrTMS-AD rTM

26、S 組、 直接造模組 （AD） 較對照組的全時程及末 2 天平均逃避潛伏 期均顯著延長； 在平臺所在象限的游泳時間 和路程占總游泳時間和總路程的百分比也 明顯下降； 表明在大鼠雙側(cè)腦基底 NBM 核 微注射泵聯(lián)合微量注射 A 和 Ibo 這一造模 方法， 可成功地從行為學(xué)上模擬臨床 AD 的 學(xué)習(xí)記憶功能障礙； 而施加磁刺激組較直接 造模組潛伏期更短，百分比值更高；說明 rTMS 無論高頻、低頻刺激均可在一定程度 上降低大鼠腦部組織對 AD 造模所致?lián)p害 的敏感程度,減少對于大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能 的 損 害 ； 并 且 LFrTMS-AD 組 較 神經(jīng)元和突觸功能， 減少內(nèi)外環(huán)境中不良因 素。對

27、其造成的損害目前腦內(nèi)獲取 BDNF 的經(jīng)濟、有效途徑，這也可能正是 rTMS 神 經(jīng)保護作用的主要機制。 由此筆者認為低頻 率、 安全強度的 rTMS 可保護神經(jīng)元和突觸 功能， 減少內(nèi)外環(huán)境中不良因素對其造成的 損害。 參考文獻 1. 盛樹立，主編.老年性癡呆：從分子生物學(xué)到 臨床診治 北 京：科學(xué) 技術(shù) 文獻出版社， 1998,216-247。 2. Elias MF, Beiser A, Wolf PA,et al. The preclinical phase of Alzheimer disease: a 22-year prospective study of the Framing

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40、rons of the basal forebrain in Alzheimers disease. Ann Neural, 1986;20(4:482-8 -7- A study on Preventing Rats from AD Via rTMS Tao Huaying1，Tian Xin2* 1 Lab of Neurophysiology, Neurological Institute，Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin （300052） 2 Department of Biomedical Engineering

41、，Tianjin Medical University，Tianjin （300070） Abstract Objective: By the methods of ethology, electrophysiology and ultramicropathology， from the view of both Neurology and Neuroinformatics, on micro- and macro-levels of the neural system, the effects of preventing rats from AD were studied via repetitive transcranial magnetic stimulation. Methods: Altogether 4 groups ( 12 rats for each groupinvolved. 2 of 4 were given low-frequency rTMS, high-frequency rTMS respectively as non-medicine pre-intervention, 1 of 4 as control,