熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)EB病毒感染

1、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)EB病毒感染        【摘要】     目的 建立檢測(cè)EBV感染的新方法并觀察EBV與鼻咽癌的關(guān)系。方法 鼻咽部活檢組織和石蠟包埋標(biāo)本66例,采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ|PCR)和原位雜交(ISH)兩種方法檢測(cè)EBV,其檢測(cè)結(jié)果與病理診斷對(duì)照。結(jié)果 FQ|PCR檢測(cè)EBV|DNA陰性52例,其中51例為炎性病變,另1例為腺癌;EBV|DNA陽性14例,其中13例為鱗狀細(xì)胞癌,另1例雖為炎癥,但部分上皮細(xì)胞呈不典型增生。ISH檢測(cè)EB

2、V陰性49例,其中47例為炎性病變,2例為癌。EBV陽性17例,其中12例為癌,5例為炎性病變。FQ|PCR和ISH檢測(cè)EBV結(jié)果,經(jīng)卡方檢測(cè)差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論 EBV感染與鼻咽癌有高度相關(guān)性。FQ|PCR檢測(cè)EBV具有方法簡單、快速、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。     【關(guān)鍵詞】  EB病毒;聚合酶鏈反應(yīng);熒光光度測(cè)定法;鼻咽癌        Fluorescence quantitative PCR detected Infection of Epstein|

3、Barr virus    ZOU Xian|jing,LUO Kai,LIU Yin,et al    Jingmen First Renmin  Hospital,Hubei 448000,China    Abstract: Objective  To establish a novel method for detecting infection of Epstein|Barr Virus(EBV)and to observe relation between EBV and

4、nasopharyngeal carcinoma.Method  Real time fluorescence quantitative PCR(FQ|PCR) and in situ hybridization(ISH) method were used to detect infection of EBV in 66 cases specimens of nasopharyngeal biopsy and embeded in paraffin,the results were compared with pathologic diagnosis.Results  FQ

5、|PCR detected EBV|DNA negative 52 cases,51 cases was inflammatory disease,1 cases was adenocarcinoma; EBV|DNA positive 14 cases,13 cases was squamous cell carcinoma,1 case was inflammation,but epithelium atypical hyperplasia.ISH detected EBV|DNA negative 49 cases,47 cases was inflammatory disease,2

6、cases was carcinoma;EBV|DNA positive 17 cases,12 cases was carcinoma,5 cases was inflammation.EBV|DNA was detected by FQ|PCR and ISH,but results was not significantly different(P>0.05). Conclusion  Infection of EBV was frequently associated with nasopharyngeal carcinoma.Real time FQ|PCR is a

7、 simple,rapid and accurate method for detecting EBV.    Key words: Epstein|Earr virus;Polymerase chain reaction;Fluorophotometry;Nasopharyngeal carcinome    Epstein|Barr病毒(EBV)感染與伯基特淋巴瘤、何杰金氏病等多種腫瘤發(fā)生有關(guān),尤其與鼻咽癌關(guān)系密切1,目前檢測(cè)EBV感染主要是測(cè)定血清EBV抗體,我們采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ|PCR)技術(shù),檢測(cè)鼻咽部活檢組織中

8、EBV感染狀況,以探討EBV與鼻咽癌關(guān)系,報(bào)告如下:    1  材料與方法    1.1  標(biāo)本來源    收集1998年11月1999年12月,我院鼻咽部活檢組織標(biāo)本41例,隨機(jī)抽取前2年鼻咽部活檢組織蠟塊25例。標(biāo)本經(jīng)10福爾馬林液固定12小時(shí)后取材,切下2mm3組織12塊,放入試管內(nèi),剩余組織做常規(guī)病理檢驗(yàn)。石蠟包埋標(biāo)本切5um厚切片58張放入1.5ml帶蓋試管內(nèi)。    1.2  儀器及試劑來源    儀器

9、為美國PE7700型自動(dòng)熒光PCR儀。FQ|PCR|EBV試劑盒為廣州中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心產(chǎn)品。EBV原位雜交試劑盒系購自武漢博士德公司產(chǎn)品。    1.3  方法    所有標(biāo)本均用FQ|PCR和原位雜交(ISH)兩種方法檢測(cè)EBV。采用FQ|PCR檢測(cè)EBV時(shí),組織經(jīng)漂洗、碾碎或經(jīng)脫蠟、漂洗后,按常規(guī)堿裂解法提取EBV|DNA。各反應(yīng)管放入PE7700自動(dòng)熒光檢測(cè)儀,按下列條件擴(kuò)增:935min預(yù)變性,然后按9345s55120s共做40個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后,電腦自動(dòng)分析計(jì)算出定量結(jié)果。原位雜交按說明書操作。

10、60;   1.4  對(duì)照    FQ|PCR和ISH檢測(cè)EBV時(shí)均做陽性和陰性對(duì)照。    2  結(jié)果    2.1  FQ|PCR檢測(cè)EBV結(jié)果    66例標(biāo)本經(jīng)病理診斷為炎性病變52例(1例伴部分上皮細(xì)胞輕度不典型增生),鼻咽癌14例(鱗狀細(xì)胞癌13例,腺癌1例)。FQ|PCR檢測(cè)EBV|DNA陰性標(biāo)本52例,其中51例為炎性病變,另1例為腺癌。FQ|PCR檢測(cè)EBV|DNA陽性標(biāo)本14例其中13例為鱗狀細(xì)胞癌,另1例

11、雖為炎癥,但部分上皮細(xì)胞呈輕度不典型增生。提示EBV感染與鼻咽癌有高度相關(guān)性。同時(shí),我們還觀察到EBV|DNA拷貝數(shù)高低與癌細(xì)胞分化程度無相關(guān)性。    2.2  ISH檢測(cè)EBV結(jié)果    EBV陰性49例,其中47例為炎性病變,2例為癌。EBV陽性17例其中12例為癌,5例為炎性病變。FQ|PCR和ISH檢測(cè)EBV結(jié)果,經(jīng)卡方檢測(cè)差異無顯著性(2=0.379,P>0.05)。    2.3  活檢組織標(biāo)本與石蠟包埋標(biāo)本檢測(cè)EBV結(jié)果    FQ|

12、PCR檢測(cè)EBV|DNA陽性14例,其中活檢組織標(biāo)本10例,石蠟包埋標(biāo)本4例?；顧z組織標(biāo)本EBV|DNA平均拷貝數(shù)為4×104,其變動(dòng)范圍為3.1×1038.9×107。石蠟包埋標(biāo)本EBV|DNA平均拷貝數(shù)為2.5×103,變動(dòng)范圍為5.5×1021.8×104,活檢組織標(biāo)本EBV|DNA平均拷貝數(shù)高于石蠟包埋標(biāo)本。因樣本例數(shù)少未做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。    3  討論    FQ|PCR是近幾年發(fā)展起來的新的核酸檢測(cè)技術(shù)2|4,該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,加入了一條用熒光基

13、團(tuán)標(biāo)記的特異性探針。探針一端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，另一端標(biāo)記熒光抑制基團(tuán)，探針完整時(shí)，抑制基團(tuán)吸收或抑制了報(bào)告基團(tuán)的熒光.當(dāng)有特異性PCR發(fā)生時(shí)，探針與引物同時(shí)結(jié)合于模板鏈上，引物延伸時(shí)，探針被Taq酶的5'3'活性作用切斷,這時(shí)抑制基團(tuán)的作用消失,報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)增強(qiáng),被切斷的熒光探針的量與被擴(kuò)增的目的基因量呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此,熒光信號(hào)強(qiáng)度伴隨著PCR產(chǎn)物的增長而增長。FQ|PCR在PCR反應(yīng)過程中,實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化,待反應(yīng)結(jié)束后,自動(dòng)計(jì)算出起始DNA的拷貝數(shù)。    我們采用FQ|PCR和ISH方法對(duì)比檢測(cè)EBV感染的結(jié)果雖無統(tǒng)

14、計(jì)學(xué)意義,但參照病理診斷，顯然FQ|PCR檢測(cè)EBV結(jié)果更可靠。FQ|PCR方法簡便,快速,3h內(nèi)即可出檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)它采用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)技術(shù)，自動(dòng)計(jì)算檢測(cè)結(jié)果，定量準(zhǔn)確,不受觀察者主觀因素影響。ISH檢測(cè)EBV則有費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不能定量,判讀結(jié)果時(shí)還易受觀察者主觀因素影響等缺點(diǎn)。    本組FQ|PCR檢測(cè)EBV52例陰性病例中,僅1例為腺癌,14例陽性病例中,13例為鱗狀上皮癌,1例慢性炎伴部分上皮不典型增生。根據(jù)這些結(jié)果看,鼻咽鱗狀上皮癌和EBV關(guān)系密切,似乎表明在上皮增生階段EBV參與其作用。有趣的是本組一例腺癌和EBV感染沒有明顯關(guān)系。根據(jù)本組2種方法檢測(cè)E

15、BV感染的結(jié)果比較來看,我們體會(huì)到FQ|PCR檢測(cè)EBV具有方法簡單、快速、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。它既可用于臨床病理檢驗(yàn)日常工作中,更適合于做大批量防癌普查和用石蠟包埋標(biāo)本做回顧性研究。    【參考文獻(xiàn)】  1 Joseph S,Pagano MD.The Epstein|Barr virus and nasopharyngeal carcinomaJ.Cancer,1994,74（9）:2397|2398.    2 Gibson EM, Heid CA, Williams PM.A novel method for real time quantitative RT|PCRJ.Genome Res,1996,6(8):995 |1001.    3 Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al. Real time quantitative PCRJ.Genome Res,1996,6(8):986|994.   &