熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)

1、熒光定量熒光定量PCRPCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)（FQ-PCR, Fluorescence quantitative PCR）實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR技術(shù)技術(shù)n所謂所謂real-time FQ-PCR技術(shù)，是指技術(shù)，是指在在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。知模板進(jìn)行定量分析的方法。 n是一種完全閉管式的是一種完全閉管式的PCR和熒光探針雜和熒光探針雜交技術(shù)相結(jié)合的定量交技術(shù)相結(jié)合的定量PCR方法。方法。n PCR的高效擴(kuò)增特性

2、的高效擴(kuò)增特性n 核酸探針的高特異性核酸探針的高特異性n 光譜技術(shù)的高靈敏性和可計(jì)量性光譜技術(shù)的高靈敏性和可計(jì)量性實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCRn定義定義利用熒光信號(hào)對(duì)利用熒光信號(hào)對(duì)PCR反應(yīng)的過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)的過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控n目的目的對(duì)起始模板進(jìn)行定量對(duì)起始模板進(jìn)行定量l優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 靈敏，重復(fù)性，動(dòng)態(tài)范圍寬，高通量靈敏，重復(fù)性，動(dòng)態(tài)范圍寬，高通量l原理原理 Ct 值與起始模板濃度的對(duì)數(shù)成比例值與起始模板濃度的對(duì)數(shù)成比例實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理nPCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終方式增加的

3、，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進(jìn)入平臺(tái)期。入平臺(tái)期。n在傳統(tǒng)的在傳統(tǒng)的PCR 中，常用凝膠電泳分離并用熒中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來(lái)檢測(cè)光染色來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物，因此用此終點(diǎn)法對(duì)此用此終點(diǎn)法對(duì)PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之產(chǎn)物定量存在不可靠之處。處。 利用電泳定量利用電泳定量11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理n在在real-time Q-PCR中，對(duì)整個(gè)中，對(duì)整個(gè)PCR反反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程

4、進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可間的進(jìn)行，監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。以繪制成一條曲線。實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理n在在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期，因因此可以在此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn)反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點(diǎn) 上來(lái)檢測(cè)上來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并且由此來(lái)推產(chǎn)物的量，并

5、且由此來(lái)推斷模板最初的含量。斷模板最初的含量。 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理n為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在為了便于對(duì)所檢測(cè)樣本進(jìn)行比較，在real-time Q-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值域值（threshold）。）。n以以PCR反應(yīng)的前反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底熒光本底信號(hào)信號(hào) （baseline），），熒光域值的缺省設(shè)置是熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。倍。 nthreshold = 10 ´ SD

6、cycle 6-15 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理n如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的域值域值循環(huán)數(shù)（循環(huán)數(shù)（Ct）。）。nCt值的含義是：值的含義是：n每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。什么是什么是C(t)C(t)值值C(t)Threshold（域值）（域值）為什么要引入為什么要引入C(t)C(t)值值CtEndpoints96 replicates of B7 gene molecular beacon實(shí)時(shí)熒

7、光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理n研究表明，研究表明，每個(gè)模板的每個(gè)模板的Ct值與該模值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。值越小。實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct shift) = 16 fold difference實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR原理原理n利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。值。因此只要因此只要獲得未知樣品的獲

8、得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。如何定量如何定量標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 未知樣品的未知樣品的C(t) 值值 定量定量熒光化學(xué)熒光化學(xué)n熒光定量熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：為兩種：熒光探針和熒光染料熒光探針和熒光染料。n熒光探針熒光探針：TaqMan熒光探針熒光探針 n熒光染料熒光染料：SYBR熒光染料熒光染料 一、一、TaqMan檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)原理原理nPCR擴(kuò)增時(shí)在擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物加入一對(duì)引物的同時(shí)的同時(shí)加入加入一個(gè)特異性的熒光探針一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡，該探針為一寡

9、核苷酸，核苷酸，與擴(kuò)增片斷內(nèi)部某一段系列相與擴(kuò)增片斷內(nèi)部某一段系列相同或互補(bǔ)同或互補(bǔ)，兩端分別標(biāo)記一個(gè)，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光報(bào)告熒光基團(tuán)基團(tuán)和一個(gè)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)淬滅熒光基團(tuán)。n探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的酶的53外切外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積

10、與光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)產(chǎn)物形成完全同步。物形成完全同步。 TaqMan檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)原理示意圖原理示意圖nPCR擴(kuò)增前擴(kuò)增前nPCR擴(kuò)增時(shí)擴(kuò)增時(shí)上游引物上游引物完好探針完好探針DNA合成合成熒熒光光物物質(zhì)質(zhì)熒光淬滅物質(zhì)熒光淬滅物質(zhì)探針?biāo)?，釋放熒光探針?biāo)?，釋放熒光模板?fù)鏈模板負(fù)鏈TaqMan 探針未結(jié)合的探針未結(jié)合的探針探針、引物與目的片段結(jié)合，探針、引物與目的片段結(jié)合，F(xiàn)RET光發(fā)射或者以熱量形式散失光發(fā)射或者以熱量形式散失Donor dye (Reporter)Acceptor dye (Quencher)LightEnergy transferTaqTaq 水解

11、探針，報(bào)告熒光素與淬滅熒光素分離水解探針，報(bào)告熒光素與淬滅熒光素分離TaqLight EmissionLightTaqManTaqMan檢測(cè)技術(shù)的設(shè)計(jì)檢測(cè)技術(shù)的設(shè)計(jì)n與普通與普通PCR的設(shè)計(jì)基本相同，區(qū)別的設(shè)計(jì)基本相同，區(qū)別在于引物與探針的設(shè)計(jì)一般需要特在于引物與探針的設(shè)計(jì)一般需要特定的軟件，如美國(guó)定的軟件，如美國(guó)ABI公司開(kāi)發(fā)的公司開(kāi)發(fā)的Primer Express軟件。軟件。（一）選擇靶基因（一）選擇靶基因nTaqMan技術(shù)主要用于檢測(cè)，所以其擴(kuò)增技術(shù)主要用于檢測(cè)，所以其擴(kuò)增的基因必須是特異的，如：的基因必須是特異的，如：n某種病原微生物所共有的保守基因某種病原微生物所共有的保守基因 （檢

12、測(cè)某種病原微生物檢測(cè)某種病原微生物）；）；n某個(gè)血清型所特有的基因序列某個(gè)血清型所特有的基因序列 （區(qū)分檢測(cè)某個(gè)血清型區(qū)分檢測(cè)某個(gè)血清型）；）；n選擇決定毒力強(qiáng)弱的基因選擇決定毒力強(qiáng)弱的基因 （區(qū)分強(qiáng)毒和弱毒區(qū)分強(qiáng)毒和弱毒）等。）等。（二）選擇探針（二）選擇探針n選擇探針需要同時(shí)滿足以下條件：選擇探針需要同時(shí)滿足以下條件：1、在靶基因的保守區(qū)域、在靶基因的保守區(qū)域2、G+C含量在含量在40%以上；以上；3、相同堿基連續(xù)不超過(guò)、相同堿基連續(xù)不超過(guò)4個(gè)；個(gè)；4、Tm值在值在712;（二）選擇探針（二）選擇探針5、內(nèi)部自身配對(duì)較少；、內(nèi)部自身配對(duì)較少；6、5端不為端不為G；7、G數(shù)目比數(shù)目比C數(shù)目少

13、；數(shù)目少； 如果如果6和和7難以滿足的時(shí)候，就要考難以滿足的時(shí)候，就要考慮用慮用互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列作探針。作探針。 （三）選擇引物（三）選擇引物n探針選好之后，在探針的上下游分別選探針選好之后，在探針的上下游分別選擇合適的引物序列，引物應(yīng)滿足如下的擇合適的引物序列，引物應(yīng)滿足如下的條件條件:n1、在靶基因保守和無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域；、在靶基因保守和無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域；n2、與探針?biāo)趨^(qū)域不重疊；、與探針?biāo)趨^(qū)域不重疊；（三）選擇引物（三）選擇引物n3、與靶基因其他區(qū)域配對(duì)較少；、與靶基因其他區(qū)域配對(duì)較少；n4、G+C含量在含量在40%以上；以上；n5、相同堿基連續(xù)不超過(guò)、相同堿基連續(xù)不超過(guò)4個(gè)；個(gè)；n

14、6、Tm值比探針值比探針Tm值低值低101;（三）選擇引物（三）選擇引物n7、探針與兩條引物之間的各種組合形成、探針與兩條引物之間的各種組合形成的二聚體都較少，特別是引物的二聚體都較少，特別是引物3端與探針端與探針配對(duì)很少；配對(duì)很少；n8、PCR擴(kuò)增片斷在擴(kuò)增片斷在70250個(gè)堿基之間。個(gè)堿基之間。n如果找不到合適的引物，可調(diào)整探針如果找不到合適的引物，可調(diào)整探針（向前或向后）的序列，或重新選擇一（向前或向后）的序列，或重新選擇一個(gè)探針，再尋找合適的引物。個(gè)探針，再尋找合適的引物。普通普通PCR臨床檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)臨床檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)普通普通PCR臨床檢測(cè)技術(shù)雖然解決了檢臨床檢測(cè)技術(shù)雖然解決了檢出

15、率低、周期長(zhǎng)的問(wèn)題，但由于假陽(yáng)出率低、周期長(zhǎng)的問(wèn)題，但由于假陽(yáng)性率高，不能正確指導(dǎo)臨床實(shí)踐。性率高，不能正確指導(dǎo)臨床實(shí)踐。因此國(guó)家衛(wèi)生部曾在因此國(guó)家衛(wèi)生部曾在1997年行文禁年行文禁止將普通止將普通PCR技術(shù)用于臨床診斷。技術(shù)用于臨床診斷。 n1、采用閉管檢測(cè)，不需、采用閉管檢測(cè)，不需PCR后處理，后處理，并采用并采用dUTP-UNG酶的防污染系統(tǒng)，擴(kuò)酶的防污染系統(tǒng)，擴(kuò)增和檢測(cè)一次同時(shí)完成。不需開(kāi)蓋，不增和檢測(cè)一次同時(shí)完成。不需開(kāi)蓋，不產(chǎn)生污染，避免了假陽(yáng)性。產(chǎn)生污染，避免了假陽(yáng)性。FQ-PCR與普通與普通PCR的區(qū)別的區(qū)別n2、探針與被檢、探針與被檢DNA序列特異雜交，序列特異雜交， 增強(qiáng)了

16、特異性。增強(qiáng)了特異性。nA、上下游引物和探針三道關(guān)卡控制其、上下游引物和探針三道關(guān)卡控制其特異性；特異性；nB、引物和探針都比較長(zhǎng)，退火溫度較、引物和探針都比較長(zhǎng)，退火溫度較高，非特異性擴(kuò)增幾率減少。高，非特異性擴(kuò)增幾率減少。FQ-PCR與普通與普通PCR的區(qū)別的區(qū)別3、可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了、可定量結(jié)果，準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治療恢復(fù)情況。病原體的感染和治療恢復(fù)情況。FQ-PCR與普通與普通PCR的區(qū)別的區(qū)別FQ-PCR與普通與普通PCR的區(qū)別的區(qū)別n4、光譜分析儀直讀結(jié)果，自動(dòng)分析，、光譜分析儀直讀結(jié)果，自動(dòng)分析， 增強(qiáng)了增強(qiáng)了靈敏性和客觀性。靈敏性和客觀性。能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)能夠

17、實(shí)時(shí)檢測(cè)，即一邊，即一邊PCR，一邊檢測(cè)一邊檢測(cè)PCR的結(jié)果，而不需要在的結(jié)果，而不需要在PCR結(jié)束之結(jié)束之后進(jìn)行核酸電泳來(lái)顯示后進(jìn)行核酸電泳來(lái)顯示PCR反應(yīng)的結(jié)果，（反應(yīng)的結(jié)果，（因因此實(shí)時(shí)熒光此實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)操作更簡(jiǎn)單；也避免檢測(cè)技術(shù)操作更簡(jiǎn)單；也避免了核酸電泳非常難以回避的化學(xué)污染和核酸污了核酸電泳非常難以回避的化學(xué)污染和核酸污染等嚴(yán)重問(wèn)題染等嚴(yán)重問(wèn)題）；）；FQ-PCR與普通與普通PCR的區(qū)別的區(qū)別n5、可以多重檢測(cè)。、可以多重檢測(cè)。n如果檢測(cè)兩種以上的基因片斷，可以對(duì)各個(gè)如果檢測(cè)兩種以上的基因片斷，可以對(duì)各個(gè)基因分別設(shè)計(jì)探針和引物，在不同的反應(yīng)管基因分別設(shè)計(jì)探針和引物，在不同

18、的反應(yīng)管中進(jìn)行中進(jìn)行TaqMan檢測(cè)，或者將各自的探針?lè)謾z測(cè)，或者將各自的探針?lè)謩e標(biāo)記不同的熒光信號(hào)，在同一個(gè)反應(yīng)體系別標(biāo)記不同的熒光信號(hào)，在同一個(gè)反應(yīng)體系中檢測(cè)多個(gè)基因片斷。中檢測(cè)多個(gè)基因片斷。二、二、SYBRSYBR熒光染料原理熒光染料原理n在在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒熒光染料，光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺霟晒馊玖咸禺愋缘負(fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。產(chǎn)物的增加完全同步。ssDNA = free dye(weak fluorophore)dsDNA =Binds minor groove(intense fluorophore)SYBR Green I (雙鏈雙鏈DNA結(jié)合染料結(jié)合染料)人醫(yī)現(xiàn)所開(kāi)展的檢測(cè)項(xiàng)目人醫(yī)現(xiàn)所開(kāi)展的檢測(cè)項(xiàng)目n乙肝病毒乙肝病毒（HBV）熒