第二章 雙碟制備

1、第二章 雙碟的制備 主要內(nèi)容： 一、培養(yǎng)基的制備 二、雙碟的制備方法 一、培養(yǎng)基 培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。 任何培養(yǎng)基中均需含有微生物所必需的能源、碳源、氮源、礦質(zhì)元素、水和生長(zhǎng)因素 不同營(yíng)養(yǎng)類型、不同種類的微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的要求有很大差異。 目前已使用的各種培養(yǎng)基都是前人經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)踐，比較設(shè)計(jì)的成果。 自養(yǎng)微生物以含氮無(wú)機(jī)物銨鹽、硝酸鹽等為氮素營(yíng)養(yǎng) 異養(yǎng)微生物以無(wú)機(jī)物銨鹽、硝酸鹽或含氮有機(jī)物為氮源 礦質(zhì)元素、生長(zhǎng)因子：微生物生長(zhǎng)繁殖需要P、K、Na、S、Mg、Ca等主要礦質(zhì)元素以及Fe、Cu等微量元素，因此培養(yǎng)基中常加入K2HPO4、KH2PO4、MgS

2、O4、NaCl、KCl、FeSO4等無(wú)機(jī)鹽類；生長(zhǎng)因子主要是調(diào)節(jié)微生物代謝活動(dòng)的B族維生素，常由酵母膏、肝浸出液等提供。許多天然成分的原料如牛肉膏、麥芽汁、玉米粉、豆芽汁等，含有各種無(wú)機(jī)元素和生長(zhǎng)因子，不需另外添加。 培養(yǎng)基分類 按物理狀態(tài)分為 液體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基：用各種營(yíng)養(yǎng)成分加水配成，或用天然物質(zhì)的浸汁(麥芽汁、豆芽汁等)制成。組分均一，適宜各類微生物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究及大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，有利于廣泛獲得大量菌體或代謝產(chǎn)物。 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑，或用麩皮等固體原料配制。常用的凝固劑是瓊脂(又稱瓊膠、洋菜)，由石花菜等海藻中提取加工制

3、成。市售瓊脂為條狀、片狀或粉末狀，主要成分為多聚半乳糖的硫酸酯，絕大多數(shù)微生物不能將其分解，在培養(yǎng)基中僅起支撐作用。其熔點(diǎn)約98，凝固點(diǎn)42，1.52的水溶液在一般培養(yǎng)溫度下呈凝膠狀態(tài)。瓊脂固體培養(yǎng)基廣泛應(yīng)用于微生物的分離培養(yǎng)、菌種鑒定和保藏。 新買來(lái)的瓊脂要先試一下它的凝固能力，一般只要它能穩(wěn)定地凝固住就不要多加。通常培養(yǎng)室溫度較低時(shí)可適當(dāng)少放一點(diǎn)，溫度高時(shí)要多放一點(diǎn)。瓊脂以顏色淺，透明度好，潔凈的為上品。近來(lái)有些廠家生產(chǎn)瓊脂粉，它比條狀的使用更方便。同一廠家的產(chǎn)品，往往粉狀的比條狀的用量要少。 培養(yǎng)基簡(jiǎn)單來(lái)講就是一種人工提供的生長(zhǎng)環(huán)境，但人類提供這種環(huán)境的目的并不只是讓其簡(jiǎn)單的生存，而是要

4、求其在生長(zhǎng)、繁育的同時(shí)還要達(dá)到人類要求的質(zhì)與量。 培養(yǎng)基中的物質(zhì)配比是經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)論證和實(shí)踐的，與自然環(huán)境相比，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是極度豐富的，可以讓目標(biāo)微生物達(dá)到“吃喝不愁”的“小康”狀態(tài)。 培養(yǎng)基號(hào) 胨 5g 牛肉浸出粉 3g 磷酸氫二鉀 3g 瓊脂 15g 蒸餾水 1000ml PH7.88.0或6.56.6 胨：不同來(lái)源的蛋白質(zhì)經(jīng)部分酶解或酸水解后，得到的可溶性產(chǎn)物混合物，一般是（6003000D），主要作為微生物的培養(yǎng)基。牛肉膏即為主要碳源和能源 葡萄糖、蔗糖或麥芽糖、乳糖等單糖或雙糖，有的可利用淀粉、纖維素等多糖為碳源和能源 1、將胨、牛肉浸出粉、磷酸氫二鉀、瓊脂加入約900ml的蒸餾水內(nèi)，加熱

5、并不斷攪拌使完全溶解 2、加入預(yù)熱過(guò)的蒸餾水定容至1000ml， 3、調(diào)PH使比最終PH略高0.20.4 4、過(guò)濾 5、分裝滅菌錐形瓶 6、115 滅菌30min注意事項(xiàng)1、要通過(guò)預(yù)試驗(yàn)選擇適當(dāng)品牌的材料，確定瓊脂的具體用量2、培養(yǎng)基中的葡萄糖和其他糖類要在其他成分配好，瓊脂融化之后加入3、制成的培養(yǎng)基凝固后應(yīng)透明，不得有沉淀。如果產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在培養(yǎng)基各成分配制好之后，趁熱過(guò)濾后調(diào)PH，再分裝消毒4、調(diào)PH宜為一次性，避免反復(fù)加酸、堿影響培養(yǎng)基質(zhì)量5、配制好的培養(yǎng)基，使用期限為一個(gè)月，并貯存在冰箱中，分裝培養(yǎng)基的容器應(yīng)預(yù)先高壓蒸汽滅菌30min. 待溶化的培養(yǎng)基稍冷卻后，按配方要求調(diào)整pH值。

6、先取10毫升培養(yǎng)基裝入試管中，用pH試紙測(cè)其自然pH，再用1NaOH(或1HCl)調(diào)至所需pH，根據(jù)用量計(jì)算，換用10NaOH(或10HCl)調(diào)整所配全量培養(yǎng)基的pH。加堿(或酸)溶液時(shí)，應(yīng)邊滴加邊攪拌，至應(yīng)加量將近用完時(shí)，再次測(cè)試，最后調(diào)至要求的pH值。 培養(yǎng)基的過(guò)濾澄清液體培養(yǎng)基必須絕對(duì)澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無(wú)顯著沉淀，因此 ，須要采用過(guò)濾或其它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾法，濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過(guò)濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過(guò)濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去

7、，再用濾紙反復(fù)過(guò)濾。如過(guò)濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至5560C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶?jī)?nèi)，裝入量不得超過(guò)燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入12個(gè)雞蛋的蛋白，強(qiáng)力振搖35分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過(guò)濾即可。 配好的培養(yǎng)基，根據(jù)需要趁熱分裝至試管或錐形瓶中。分裝需用漏斗，以免瓊脂粘在管口或瓶口上。裝瓶量一般為瓶容量的1/31/2；裝試管一般為試管高度的1/51/4，以免滅菌時(shí)培養(yǎng)基上溢，粘濕棉塞。 用預(yù)先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞既有利于通氣，又有濾菌作用，故松緊、大小應(yīng)適當(dāng)，以免使用時(shí)影響操作(如圖)。 最后用牛皮紙或報(bào)紙包住

8、棉塞，扎緊在瓶頸或試管上方，以免滅菌時(shí)水蒸汽沾濕棉塞或脫落。 培養(yǎng)基號(hào) 胨 6g 牛肉浸出粉 1.5g 酵母粉 6g 葡萄糖 1g 瓊脂 1520g 蒸餾水 1000ml 中國(guó)藥典2005年版二部附錄的抗生素微生物檢定法中收載了13種不同處方的培養(yǎng)基及制備方法。目前，已有市售干燥培養(yǎng)基，使用方便。臨用時(shí)按照使用說(shuō)明進(jìn)行配制，但應(yīng)注意核對(duì)培養(yǎng)基的PH，必要時(shí)需調(diào)節(jié)PH，使其符合規(guī)定。另外，市售干燥培養(yǎng)基的質(zhì)量也存在差異，注意選擇合適的產(chǎn)品。第二章 雙碟的制備 雙碟制備 雙碟的制備應(yīng)在半無(wú)菌室或潔凈室內(nèi)進(jìn)行，并注意避免微生物及抗生素的污染。培養(yǎng)基應(yīng)在水浴中或微波爐內(nèi)融化，避免直火加熱。 底層用滅菌大口20ml吸管或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20ml 注入雙碟內(nèi)，待凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放置于3537培養(yǎng)箱中保溫，使菌層易于攤布。 雙碟： 在抗生素效價(jià)測(cè)定中，裝有培養(yǎng)基和試驗(yàn)菌的玻璃培養(yǎng)皿稱為雙碟。 分為底層（不含菌）和菌層。 雙碟制備 1、倒底層 調(diào)整臺(tái)面水平 已消毒的培養(yǎng)皿單個(gè)擺開(kāi) 水浴融化培養(yǎng)基，室溫冷至70， 大口滅菌刻度吸管迅速吸取20ML培養(yǎng)基，注入各個(gè)培養(yǎng)皿，均勻攤布，蓋上干燥的陶瓦圓蓋，待凝固。 2、倒菌層 從冰箱中取出菌液，回溫 菌液加入融化后的培養(yǎng)基中，搖勻，不得有氣泡 吸取含菌培養(yǎng)基5ml，注入已倒了底層的培養(yǎng)基表面，均勻攤布，蓋上陶瓦圓蓋，凝固即