芪龍膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1、芪龍膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究葉素艷1，李振1，周海洋1, 謝敏1,劉瑞琛2,許麗麗3(1.濟(jì)寧華能制藥廠有限公司，山東 濟(jì)寧 272000；2. 山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 2500003.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟(jì)南 250101)摘要：目的：修訂芪龍膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對方中丹參、赤芍進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm,5 µm）, 以乙腈為流動相A，以0.2%甲酸溶液為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為260nm，柱溫30，流速1.0ml/min。結(jié)果：TLC鑒別專屬性強，分離度好；毛

2、蕊異黃酮葡萄糖苷在濃度2575µg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。平均回收率為99.9%。結(jié)論：本方法簡便，靈敏，準(zhǔn)確，快速，專屬性強，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適合于該藥的質(zhì)量分析檢驗。關(guān)鍵詞：芪龍膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；丹參；赤芍；毛蕊異黃酮葡萄糖苷Quality standard of Qilong CapsuleYE Su-yan1, LI Zhen1, ZHOU Hai-yang1, XIE Ming1，LIU Rui-chen2,XU Li-li3 (1. Jining Huaneng Pharmaceutical Factory, Jining 272000, China; 2.

3、School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250000, China；3. Shandomg Provincial Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China)ABSTRACT: OBJECTIVE: To revise the quality standard of Qilong Capsule. METHODS: Using TLC method to identify the Radix Salviae Miltiorrhizae and

4、 Radix Paeoniae Rubra, and the content of Calycosin-7-glucoside was determined by HPLC. The chromatographic column is C18（250 mm×4.6 mm,5 µm）, with acetonitrile as mobile phase A and 0.2% formic acid solution as mobile phase B for gradient elution, the detection wavelength is 260nm, the co

5、lumn temperature is 30 , and the velocity is 1.0ml/min. RESULTS: The specificity of TLC identification is strong, and the separation degree is good. Calycosin-7-glucoside has a good linear relationship in the 2575µg/ml range of concentration, and the average recovery rate is 99.9%. CONCLUSION:

6、The advantages of this method were simple, sensitive, accurate and rapid, with a good specificity and reproducible, so it's suitable for the quality analysis and testing of Qilong Capsule.KEY WORDS: Qilong Capsule; quality standard; Radix Salviae Miltiorrhizae; Radix Paeoniae Rubra; Calycosin-7-

7、glucoside 收稿日期：作者簡介：葉素艷（1982），女，執(zhí)業(yè)藥師，從事藥物檢驗分析，電話，“芪龍膠囊”以一組溶栓酶（蚓激酶）為基礎(chǔ)，加之特殊工藝提取的黃芪、丹參、當(dāng)歸等中藥的有效成分，具有活血化瘀、溶栓通絡(luò)的功效。為了提高標(biāo)準(zhǔn)對產(chǎn)品質(zhì)量的可控性，在原有已修訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1和局頒標(biāo)準(zhǔn)2的基礎(chǔ)上，對標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善與提高。其中黃芪為君藥，根據(jù)2015年版中國藥典規(guī)定，黃芪含量指標(biāo)新增毛蕊異黃酮葡萄糖苷，為了制劑的質(zhì)量得到更大的提高，新增毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定項。中藥成份復(fù)雜，且在不同中藥中可能含同一個成份，如芍藥苷在白芍3等中藥中也可檢測到。因此，單一用標(biāo)準(zhǔn)品去對復(fù)方中藥進(jìn)行定性鑒別存在一

8、定的缺陷。本文修訂了赤芍和丹參的TLC鑒別，在以標(biāo)準(zhǔn)品為對照的基礎(chǔ)上，加以標(biāo)準(zhǔn)藥材對芪龍膠囊中赤芍和丹參進(jìn)行定性鑒別。1 儀器與試藥1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm×5 µm），分析天平（Sartorius,BS210S,Max 210g,d=0.1 mg）。1.2 試藥 丹參，批號120923-201414；丹酚酸B，批號111562-201009；芍藥苷，批號110736-200934；赤芍，批號121093-200402；毛蕊異黃酮葡萄糖苷（供含量測定用，批號111920-2015

9、05，含量以97.1%計），以上對照品和對照藥材均由中國食品藥品檢定研究院提供。芪龍膠囊(濟(jì)寧華能制藥廠有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.2 mg/粒；批號160613，160614，161122,161223,170101），乙腈為色譜純，其余為分析純。2 試驗方法和結(jié)果2.1 丹參的鑒別參考中國藥典2015年版白蝕丸品種項下的薄層色譜條件4，具體試驗如下：供試品溶液的制備：取本品內(nèi)容物8 g，加甲醇50 ml，加熱回流30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 ml使溶解，用石油醚（6090）40 ml振搖提取，分取水層，加稀鹽酸調(diào)pH值至23，再用乙醚振搖提取2次，每次30 ml，合并乙醚提取液，揮干

10、，殘渣加甲醇l ml使溶解，作為供試品溶液。點樣量5 µl。對照藥材溶液的制備：取丹參對照藥材0.5 g，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至l ml，作為對照藥材溶液。點樣量5µl。對照品溶液制備：取丹酚酸B對照品，加甲醇制成每l ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。點樣量5 µl。陰性對照藥材溶液的制備：取處方中除去丹參的其他藥味，按處方比例制成缺丹參的陰性對照樣品。取陰性對照樣品8 g，同供試品溶液的制法，制成陰性對照溶液。點樣量5 µl。薄層板：青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)的硅膠G薄層板，批號：20150912 Merck公司

11、G板，批號：HC30863956展開劑：甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（4:6:8:1:4） 顯色：5%三氯化鐵乙醇溶液結(jié)果：優(yōu)化后的譜圖中，日光下，供試品色譜中，在與丹參對照藥材和丹酚酸B對照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。比較不同的薄層板及不同溫濕度條件，結(jié)果色譜圖中均斑點清晰、分離效果較好。如圖1所示，樣品分別為1. 陰性對照2. 樣品（批號：161122）3. 樣品（批號：161223）4. 樣品（批號：170101）5. 丹參對照藥材。 圖1 丹參的TLC鑒別圖譜（A：Merck硅膠G板，溫度20，濕度50%；B：青島海洋化工廠硅膠G板，溫度4，濕度30%)Fig

12、.1. TLC identification of Salvia (A: Merck silica gel G plate, temperature 20 , humidity 50%; B: Qingdao Ocean Chemical Plant silica gel G plate, temperature 4 , humidity 30%)2.2 赤芍的鑒別原標(biāo)準(zhǔn)方法中2，供試品色譜中在與對照品芍藥苷相應(yīng)的位置上有其他斑點干擾，分離效果不是很好，如圖2（A)所示。增加柱分離純化，同時增加赤芍對照藥材的鑒別，具體試驗如下：供試品溶液的制備：取本品內(nèi)容物3g，加80%乙醇50ml，超聲處理

13、10分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次15ml，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，加在中性氧化鋁柱（100200目，2g，內(nèi)徑1cm）上，用甲醇-乙酸乙酯（1:1）50ml洗脫，收集洗脫液蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。點樣量5µl。對照品溶液的制備：取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。點樣量5µl。對照藥材溶液的制備：取赤芍對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。點樣量5µl。陰性對照藥材溶液的制備：取處方中除去赤芍的其他藥味，按處方比例制成缺赤芍的陰性對照樣品。取陰性對照樣

14、品3g，同供試品溶液的制法，制成陰性對照溶液。點樣量5µl。薄層板：青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)的硅膠G薄層板，批號：20150912 Merck公司G板，批號：HC30863956展開劑：三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40:5:10:0.2）顯色：噴以5%香草醛硫酸溶液，在105加熱至斑點顯色清晰結(jié)果：優(yōu)化后的譜圖中，日光下，供試品色譜中，在與赤芍對照藥材和芍藥苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。比較不同的薄層板及不同溫濕度條件，結(jié)果色譜圖中均斑點清晰、分離效果較好，如圖2所示，圖A為赤芍藥材原標(biāo)準(zhǔn)方法（Merck硅膠G板），圖B、圖C為優(yōu)化后薄層鑒別結(jié)果，其中1.

15、陰性對照2.樣品（批號：161122）3.樣品（批號：161223）4.樣品（批號：170101）5.芍藥苷對照品6. 赤芍對照藥材 圖2 赤芍藥材的TLC鑒別圖譜（A：Merck硅膠G板原標(biāo)準(zhǔn)圖譜，溫度 20；濕度 45%；B 優(yōu)化后Merck硅膠G板譜圖，溫度 20，濕度45%；C優(yōu)化后青島海洋化工廠硅膠G板譜圖，溫度4，濕度25%）Fig.2. TLC identification results of Radix Paeoniae Rubra (A:standard chromatogram of Merck silica gel G plate,temperature 20 ; hu

16、midity 45%; B optimized result of Merck silica gel G plate , temperature 20 , humidity 45%; C optimized result of Qingdao Ocean Chemical Factory silica gel G plate, temperature 4 , humidity 25%)2.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定 參考中國藥典2015年版黃芪項下的含量測定條件5，具體試驗如下。2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.2%甲酸溶液為流動

17、相B，按表8中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為260nm，柱溫30，流速1.0ml/min。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算應(yīng)不低于3000。表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution table時間（分鐘）流動相A（%）流動相B（%）02020408060203040602.3.2 對照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含50µg的溶液，搖勻，即得。2.3.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物2g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)

18、濾液25ml，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。2.3.4 陰性對照溶液的制備 取處方中除去黃芪的其他藥味，按處方比例制成缺黃芪的陰性對照樣品。取陰性對照樣品2g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。2.3.5 穩(wěn)定性考察 稱取160614批芪龍膠囊2.0574g，制備成供試品溶液，進(jìn)樣10µl測定，分別于0、2、4、6、8小時進(jìn)樣，測得峰面積，結(jié)果見表2。表2 穩(wěn)定性試驗測定結(jié)果Table 2 Result of stability test時間（h）02468峰面積1680.554811713.630371681.334961658

19、.537721664.31165RSD(%)1.28 測定結(jié)果表明供試品溶液在8小時內(nèi)穩(wěn)定，能滿足測定要求。2.3.6 線性關(guān)系的考察 精密稱取對照品12.60mg，加甲醇溶解并稀釋至25ml量瓶中，分別精密量取0.5，0.75，1.0，1.25，1.5ml對照品溶液置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣10µl，測得峰面積，結(jié)果見表3。以濃度C（µg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3，得回歸方程y=30.4575x+37.0256,r=0.9997。表3 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 3 Results of linear relationsh

20、ip量取體積（ml）濃度(µg/ml)峰面積1峰面積2峰面積平均值0.525795.68231772.35199784.017150.7537.51198.222661199.827761199.025211.0501553.383671557.818481555.6010751.2562.51950.500241944.471071947.4856551.5752337.353032289.412842313.382935圖3線性關(guān)系考察圖Fig. 3. Linear relationship result 結(jié)果表明,毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品在濃度2575µg/ml范圍內(nèi)

21、與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.3.7 重復(fù)性試驗 取芪龍膠囊（批號為160613），按正文所述供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，并測定含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性良好。表4 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 4 Repeatability test results面積平均值取樣量/g含量/mg/粒RSD/%芪龍160613A1677.364082.00580.1051.51芪龍160613B1750.497622.00150.110芪龍160613C1717.259952.00480.107芪龍160613D1709.589852.00030.107芪龍160613E1691.

22、231142.00110.106芪龍160613F1716.288582.00540.1072.3.8 專屬性試驗 分別精密吸取重復(fù)性試驗中的對照品溶液，供試品溶液及陰性對照溶液各10µl，注入液相色譜儀，進(jìn)行測定，結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜保留時間相同的位置上，有相應(yīng)的色譜峰，而陰性對照色譜中無相應(yīng)色譜峰。說明處方中其他藥味對測定結(jié)果無干擾。見圖4。從上到下分別是陰性對照，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品，芪龍膠囊樣品。圖4 專屬性試驗HPLC色譜圖Fig.4. HPLC chromatogram of specificity test2.3.9 準(zhǔn)確度考察精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品約13mg，加甲醇溶解并定容至25ml量瓶中，搖勻。精密吸取10ml，用甲醇定容至200ml量瓶中，搖勻，即得對照品稀釋溶液。精密稱取已知含量為0.11mg/粒的160613批芪龍膠囊約1g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇25ml，再加入對照品稀釋溶液25ml，按正文含量測定方法依法測定。平行制備同批供試品6份，分別計算回收率，結(jié)果見表5，結(jié)果表明方法的回收