細(xì)胞工程學(xué)專業(yè)復(fù)習(xí)資

1、緒論一.細(xì)胞工程（Cell Engineering ）:（定義）是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，借助工程學(xué) 的實(shí)驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞、 細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的學(xué)科。分類（包括）：（填空）植物細(xì)胞工程和動(dòng)物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程：（定義）以植物細(xì)胞組織為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物種，或 加速繁殖植物新個(gè)體，或獲得有用物質(zhì)的過程。動(dòng)物細(xì)胞工程：（定義）是根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)原理，定向改變動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)從而獲得新型生物或特種細(xì)

2、胞產(chǎn)品的一門技術(shù)。二.（填空）細(xì)胞學(xué)說的提出：施旺，施萊登（1838年）三.1902年，H aberlandt提出了細(xì)胞全能性學(xué)說。第一章基本技術(shù)一.濕熱滅菌：103-137kPa（121-126 ° C）,15-30min.二.干熱滅菌：利用烘箱加熱到位60-180 ° C三.培養(yǎng)基基本成分：無機(jī)鹽（大量元素，微量元素），有機(jī)成分（激素，植物生長調(diào)節(jié)劑），水常用有機(jī)成分：糖類（蔗糖），維生素，肌醇，腺喋吟，氨基酸激素：生長素（根），細(xì)胞分裂素（芽），赤霉素（細(xì)胞伸長）四.基本培養(yǎng)基種類：MS,B5,N6,White（P26）（1）高鹽平衡培養(yǎng)基：MSg養(yǎng)基、LS培養(yǎng)基、B

3、L培養(yǎng)基、 BM培養(yǎng)基和 ER培養(yǎng)基。特點(diǎn)：無 機(jī)鹽濃度較高，元素間的比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性；營養(yǎng)豐富；微量元素 種類全，濃度高。（2）高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：B5培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基及SH培養(yǎng)基等。特點(diǎn)：硝酸鉀的含量高，氨態(tài)氮 的含量低，含有較高的鹽酸硫胺素。（3）中鹽培養(yǎng)基： H培養(yǎng)基、Nitsch 培養(yǎng)基、Miller 培養(yǎng)基和 Blaydes培養(yǎng)基。特點(diǎn)：大量元素?zé)o機(jī)鹽約為 MS的一般，微量元素種類減少而含量增高，維生素種類比MSo（4）低鹽培養(yǎng)基： White培養(yǎng)基、WS養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、改良 Nitsch 培養(yǎng)基及 HB培養(yǎng)基等。 特點(diǎn)：無機(jī)鹽含量低，有機(jī)成分含量相對(duì)也很低

4、。五.培養(yǎng)基配制：1000ml母液需100ml大量元素（10*）,10ml微量元素（100*）1培養(yǎng)基母液配制無機(jī)鹽按大量元素、微量元素和鐵鹽3部分分別配制。大量元素一般配制成（1020） X母液,微量元素和鐵鹽則配制成（100-200） X母液。有機(jī)成分最好單獨(dú)配制。配好的母液需貯存于24C冰箱中。植物激素使用的濃度很低，因此，一般分別配制成0.1-1mg/L濃度的溶液。2培養(yǎng)基制備制備培養(yǎng)基時(shí)是根據(jù)實(shí)際需要配制，首先按大量元素、微量元素、鐵鹽及有機(jī)成分的順序，依 次吸取各母液的需要量，加入一適當(dāng)體積的燒杯或其它配制培養(yǎng)基的容器中，再加入適當(dāng)體積 的蒸儲(chǔ)水，并稱取相應(yīng)量的蔗糖放入其中溶解，調(diào)

5、節(jié)pH值，加入瓊脂，加熱使其完全融化，最后用蒸儲(chǔ)水定容并分裝。六.外植體：指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織，器官等材料。三種來源：1.生長在自然環(huán)境下的植物2.在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物3.無菌環(huán)境下培養(yǎng)的植物（最優(yōu)）。第二章細(xì)胞全能性與形態(tài)發(fā)生一.細(xì)胞全能性：（定義）一個(gè)細(xì)胞所具有的產(chǎn)生完整個(gè)體的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實(shí)現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的前提，再分化是細(xì)胞全能性表達(dá)的最終體現(xiàn)。二.細(xì)胞脫分化（cell dedifferentiation ）：（定義）培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過程就

6、是細(xì)胞脫分化。分化細(xì)胞脫分作分生細(xì)胞再分作分化細(xì)胞 靜止細(xì)胞啟訪熱分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志。蛋白體的出現(xiàn)和細(xì)胞質(zhì)密度增加被認(rèn)為是細(xì)胞開始脫分化的標(biāo)志。三.細(xì)胞分化（Differentiation ）：（定義）是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在 發(fā)育方式改變的過程。四.極性（polarity ）:（定義）是指植物的器官、組織、甚至單個(gè)細(xì)胞在不同的軸向上存在的 某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。五.激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的主要因素。先用生長素處理，后用細(xì)胞分裂素處理，有利于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有利于細(xì)胞分化。如果兩者同時(shí)處理，則可促使分化頻率的提

7、高。六.（簡答）植物的離體器官發(fā)生：是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不 定根、不定芽等器官的過程。不定根、不定芽：是指在一些非正常發(fā)生部位形成的根或芽，離體培養(yǎng)中通常是指從愈傷組織 上發(fā)生的根或芽。器官發(fā)生方式：1）先芽后根：先分化芽，芽形成后，在芽的基部長出根進(jìn)而形成完整植株。2）先根后芽：先分化根，再在根上產(chǎn)生不定芽進(jìn)而形成完整植株。3）在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。七.愈傷組織：實(shí)質(zhì)上是一團(tuán)無序生長的細(xì)胞，這些細(xì)胞大多處于隨機(jī)分裂的狀態(tài)。（器官、組織培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞分裂首先發(fā)生在傷口部位）八.體細(xì)胞胚或胚狀體（定義）：離體培養(yǎng)下沒有經(jīng)過受精過

8、程，但經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成 的胚的類似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體。界定：1）體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于離體培養(yǎng)范圍使用，以區(qū)別于無融合生殖胚。2）體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別于合子胚。3）體細(xì)胞經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程，以區(qū)別于離體培養(yǎng)中器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑。研究體細(xì)胞胚的模式植物：胡蘿卜。九.體細(xì)胞胚的形成途徑：（簡答）1 .體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生：誘導(dǎo)階段。胚胎發(fā)育階段2 .間接發(fā)生：A.經(jīng)過愈傷組織的體細(xì)胞胚的形成：誘導(dǎo)愈傷組織的形成一誘導(dǎo)愈傷組織胚 性化一體細(xì)胞胚的形成2, 4-D（濃度高）3 , 4-D（濃度低）2 , 4-D（濃度

9、更低）B.經(jīng)過懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚的形成：誘導(dǎo)愈傷組織的形成一誘導(dǎo)愈傷組織胚性化一懸浮培養(yǎng) 的胚性細(xì)胞團(tuán)一體細(xì)胞胚的形成。十.植株再生的兩種方式：器官發(fā)生，體細(xì)胞胚發(fā)生。第三章體細(xì)胞遺傳變異一.體細(xì)胞無性系：由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株統(tǒng)稱為體細(xì)胞無性系。體細(xì)胞無性系變異：由體細(xì)胞無性系表現(xiàn)出來的變異。從對(duì)生物遺傳的影響而言，細(xì)胞工程技術(shù)本身即包含了雙重性：遺傳穩(wěn)定性和變異性。2 .離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性；變異的普遍性；變異的局限性；嵌合性3 .非遺傳變異廣外遺傳變異 基因表達(dá)（生長素自養(yǎng)型變）工生理適應(yīng)性變異4 .體細(xì)胞無性系變A的誘導(dǎo)與選擇：（愈傷組織 再生植株（變異）誘

10、變起始材料的選擇原則：目標(biāo)性狀的可行性；實(shí)驗(yàn)植物的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)水平；適當(dāng)?shù)募?xì)胞類 型七.設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)抗紋枯病的水稻一一突變體的選擇：（1）直接選擇其方法是用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng) 基上只而突變細(xì)胞能夠生長非突變細(xì)胞不能生長，, 而直接締選出突變體.-賞效券等以小麥幼好焦佞細(xì)織為材料，有今滯L4#版CI的N他養(yǎng)基上 直接并選出小麥兩絲系.分析理L示.司叁系涪離氨基腰念堂是供在親本 的4.1售.邪企成竽也曾將小灰哧花花藥經(jīng)Y射線處理后口和%）.5* NaCl嬉 養(yǎng)費(fèi)直接舞選羲簾時(shí)最再生林系.-李愛置等以甘薯“菜子香”為利料逢導(dǎo)胚性細(xì)胞系.從如訃通過丫射線輻射箭如跑團(tuán)中,也含有2*

11、。 WC1的培養(yǎng)人中瓏行蔣選，武警2撲杭曲會(huì)傷細(xì)奴，并春停2。個(gè)抗空再生植般（2）間接選擇:間接選擇法是一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性 狀作為選擇指標(biāo)的篩選方法.-DorfTling等以Pro類似物羥膈氨酸(UYP)為選擇劑，躍得 了耐HYP的體細(xì)胞變芹系，方抗寒性比供體親本增強(qiáng)，昆能 穩(wěn)定遣傳.-林定波等將錦橙株心細(xì)胞愈傷組織的懸浮細(xì)胞經(jīng)Y射線黑 射，然后在高濃度麻氨減培養(yǎng)基中培養(yǎng)彝選，獲得了抗寒 體細(xì)胞變異愈傷組織，井再生植株.筆定顯示.阮裒愈傷 組織及其再生植株的抗親性分別比供體賽奇L 4 P和2.4 七，突變系體內(nèi)的Proi比侯體增加了一借.第四章植物組織細(xì)胞培養(yǎng)1 .植物脫毒：利用植

12、物組織培養(yǎng)技術(shù)脫出植物細(xì)胞中侵染的病毒，生產(chǎn)健康的繁殖材料。2 .脫毒 基本原理：病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性。3 .脫毒苗制備流程：索取材料的病毒檢測(cè) 夕鵬的選擇及預(yù)處理莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株脫毒效果檢測(cè) M兌毒苗的保存與繁殖4 .(填空、簡答)培養(yǎng)物的增殖方式：1.腋芽增殖2.不定芽增殖3.體細(xì)胞胚增殖4.愈傷組織增殖5 .花藥培養(yǎng)(定義)：把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育和分化成為植株的過程。從培養(yǎng)類型來講，花藥培養(yǎng)仍然屬于器官培養(yǎng)的范疇?；ǚ叟囵B(yǎng)(定義)：又叫小抱子培養(yǎng)，是從花藥中分離除花粉粒，使之成為分散的或游離的狀態(tài)，通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化，進(jìn)而發(fā)育成完整植

13、株的過程?；ǚ叟囵B(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇?；ǚ叟囵B(yǎng)取材時(shí)期：四分體小抱了時(shí)期；花藥培養(yǎng)取材時(shí)期：單核晚期，雙核早期。6 .花藥培養(yǎng)的基本程序：外植體選擇一外植體預(yù)處理一外植體消毒一剝?nèi)』ㄋ幰唤臃N一誘導(dǎo)培養(yǎng)一分化培養(yǎng)。7 .花粉分離方法：(1)機(jī)械分離法：將花藥置于盛有少量液體培養(yǎng)基或與培養(yǎng)基等滲的蔗糖溶液的培養(yǎng)皿中，用平頭的玻璃棒或注射器內(nèi)管輕輕擠壓花藥，使其散出花粉。(2)花藥漂浮培養(yǎng)自然釋放法：將經(jīng)過一定時(shí)間低溫處理的花藥，接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)數(shù)天后，花藥開裂，釋放出花粉粒。(3)磁拌法：將花藥接種于含有液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后放入一根磁棒，置于磁力攪拌器上，低速轉(zhuǎn)至花藥呈透明狀。8 .

14、根據(jù)在培養(yǎng)中所取的外植體的部位不同，植物胚胎培養(yǎng)包括：胚培養(yǎng)，胚乳培養(yǎng)，胚珠培養(yǎng)，子房培養(yǎng)。9 .幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)：取材時(shí)期：多為球形胚至魚雷形胚階段。十.幼胚離體培養(yǎng)的常見的生長發(fā)育方式：胚性發(fā)育，早熟萌發(fā)，愈傷組織。十一.懸浮培養(yǎng)：是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行 培養(yǎng)增殖的技術(shù)。應(yīng)用：1,愈傷組織誘導(dǎo)：要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤鮮艷的乳 白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎。誘導(dǎo)愈傷組織選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。誘導(dǎo)愈傷組織選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。2,懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)

15、：一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件（簡答）：A.懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在 30-50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng) 中很少會(huì)有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮體系。B.均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮體系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基 清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白色或淡黃色。C.細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般2-3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。3,懸浮細(xì)胞的生長動(dòng)態(tài)：P89圖5-6 （填空一一五個(gè)時(shí)期）延滯期，對(duì)數(shù)生長期，直線生長期，減慢期，靜止期。（在減慢期進(jìn)行繼代培養(yǎng)）4,懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化：細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特

16、定時(shí)期。（填空）同步化的方法：分選法；饑餓法；抑制劑法；低溫法 P91十二。單細(xì)胞培養(yǎng)方法：1、平板培養(yǎng)2、看護(hù)培養(yǎng)3、微室培養(yǎng)4、雙層濾紙植板培養(yǎng) 5、懸 浮培養(yǎng)（簡答）P86十三。培養(yǎng)條件下的植物細(xì)胞次生產(chǎn)物積累特性： 1,生長偶聯(lián)型：產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長成正比。 如長春花堿、煙堿的合成2,中間型：產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長下降時(shí)合成， 細(xì)胞處于指數(shù)生長期或停 止生長產(chǎn)物都不合成。如意醍類物質(zhì)合成的植物細(xì)胞 3,非生長偶聯(lián)型：產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長停 止以后。如紫草寧的合成。第五章原生質(zhì)體培養(yǎng)及雜交一.原生質(zhì)體（protoplast ）:除去細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞。二.原生質(zhì)體的純化方法：（填空）1、沉降法：甘

17、露醇作滲透壓調(diào)節(jié)劑，低速離心，原生質(zhì)體沉降于管底。2、漂浮法：蔗糖作滲透壓調(diào)節(jié)劑，離心，原生質(zhì)體漂浮于溶液表面。3、梯度離心法：利用比重不同的溶液，離心，原生質(zhì)體處在兩液相的界面之間。三.原生質(zhì)體培養(yǎng)方法：（P118） 1。液體淺層培養(yǎng) 2。固體平板培養(yǎng) 3。固液雙層培養(yǎng) 4,瓊脂 糖珠培養(yǎng)（搖床震蕩） 5,懸滴培養(yǎng)法：在培養(yǎng)皿蓋上滴懸浮液，皿底加入培養(yǎng)液，皿蓋翻過來 蓋于皿底上，封口培養(yǎng)。 6,微滴培養(yǎng)法：懸浮液滴于皿底，封口培養(yǎng)。7,飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：又稱看護(hù)培養(yǎng)。先制備飼養(yǎng)層，再在其上培養(yǎng)有活力的原生質(zhì)體。四.原生質(zhì)體活力測(cè)定方法：（P114）1 .形態(tài)識(shí)別法2.熒光素雙醋酸酯（FDA）染色

18、法：有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)生綠色熒光。3.酚藏花紅染色法：有活力的原生質(zhì)體不能被染色。4、熒光增白劑染色法：有活力的原生質(zhì)體隨著細(xì)胞壁的再生產(chǎn)生名色熒光。5、伊凡藍(lán)染色法：有活力的原生質(zhì)體不能被染色。五.植物體細(xì)胞雜交：又稱為原生質(zhì)體融合，是指將植物不同種、屬、甚至科間的原生質(zhì)體 通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞雜交的類型：1）體細(xì)胞雜交2）體細(xì)胞-配子雜交3）配子間細(xì)胞雜交 4）微細(xì)胞雜交 原生質(zhì)體融合的種類（完整程度）：1）對(duì)稱融合2）非對(duì)稱融合六.原生質(zhì)體的融合方法之一 ：PEG誘導(dǎo)融合法1）特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是成本低；融合子產(chǎn)生的異核率高；不受物種限制。缺點(diǎn)

19、是融合過程繁瑣，PEG對(duì)細(xì)胞有毒害。2）作用機(jī)理：PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可與帶正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，在原生質(zhì)體之間形成分子橋，使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；PEG還鞫增加類脂膜的流動(dòng)性，使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 七.原生質(zhì)體的融合方法之二：電融合的基本過程細(xì)胞膜的接觸：原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串。膜的擊穿：給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在起。優(yōu)點(diǎn)：1）不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題 2）融合效率高3）融合技術(shù)操作簡便八.（填空）原生質(zhì)體的融合產(chǎn)物：異核體（核未融合）、同

20、核體（同一親本融合 AA）、未發(fā)生融合的雙親原生質(zhì)體。九.雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)與體細(xì)胞雜種植株的鑒定（P131-132）（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題）例：材料 月季（紅）玫瑰（白）培養(yǎng)月季式玫瑰分離原生質(zhì)體：純化、活力測(cè)定融合方法雜種選擇雜稗植株鑒定f膜的融合-細(xì)胞質(zhì)融合（發(fā)生膜融合后的數(shù)小時(shí)） -核融合（可能發(fā)生在細(xì)胞間期，也 可能發(fā)生在第一次同步分裂過程中） 。第六章人工種子及種質(zhì)貯藏一.人工種子（artificial seeds）：任何一種經(jīng)人工種皮包被或裸露的，具有形成完整植株能 力的繁殖體。根據(jù)包被的程度可將人工種子分為三大類：裸露的或休眠的繁殖體、人工種皮包被的繁殖體、 水凝膠包埋再包被的繁殖體。二.繁殖體的種類及其培養(yǎng)技術(shù)：體細(xì)胞胚、微型變態(tài)器官、微芽。三.人工種子由以下三部分組成：繁殖體，人工胚乳，人工種皮。4 .包埋介質(zhì)的要求：1、要能對(duì)繁殖體起保護(hù)作用，要對(duì)繁殖體沒有毒害。2、要求具有一定的緩沖強(qiáng)度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運(yùn)輸和種植操作中的安全。3、能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質(zhì)以供繁殖體發(fā)芽的需要。4、應(yīng)含有適當(dāng)?shù)臍⒕鷦? .理想的人工種皮：1具有一定的封閉性以保證人工胚乳的各種成分不易流失；2具有良好的透氣性，以保證繁殖體維持生理活性的需要；3有一定的