SHARP-2特異的RNA干擾腺病毒載體構(gòu)建

1、.浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文S ile n e in g o f S H A R P 一2 g e n e u sin g a d e n o v ir a l v e e to r 一b a s e d s h o r t h a r P in R N A in te r f e r in gA B S T R A C TB a e k g r o u n d :R at etili an eer o f sP lit一an d h airy一relate d P ro tein 一2 (S H A RP 一2 ，also referred to as the S tra 1

2、3or D E C I) 15 a b asie h elix一10 0 卜 helix tran seriP tion al reP resso r wh ich P lay s im P ortant ro les int he t ra n se r iP tio n a l re g u la tio n o f c e llu la r P ro lif era tio n ，d if fe re n t ia tio n ，a n d o n e o g e n e sis . O u rPrelim in ary stud ies h as shown that T G F 一p

3、 can P rom ote S H A RP 一2 exP ression ，an d S H A RP 一2tra n se riP tio n f a e to r e o u ld P ro m o te th e se e re tio n o f IL 一2 .b e s id e s in S t ra 1 3 k n o e k o u t m ie e I N F 一了 a n d IL 一2 e x P re s s io n h a s d e e re a s e d ，t hu s w e s P e e u l a te if S H A R P 一2 g e n

4、e w ill P la y a n im P o r ta nt ro le in o rg a n t ra n sP la nt a tio n .In o rd e r to in v e stig a te S H A R P 一2 g e n e f un tio n ，w ed re w a s sis ta n c e f ro m R N A in t e rf er in g to in d u e e S H A R P 一2 g e n e sile n c in g . R N A in ie 成 r e n e e (RN A i) 15 in d u ced b

5、y d o u b le一Strand ed R N A (d sR N A ) an d resu lts in g en e silen cin g thr o u g h se q u e n e e 一s p e e if ie e le a v e d b y D ie er in io 2 1 一2 3 b P 51洲 A d u P le x e s w h lc h a re se P a ra te d b y a m u lti一P ro te in e o m P le x c a lle d 班 S C ，th e a nt is e n s e stra n d w

6、h ie h rem a in s b o u n d to th e R I S C(RN A 一in d u eed silen ein g co mP lex ) comP lex wi ll lo cate h o m o lo go us m R N A seq uen ees wi th inth e cyto P la sm an d in d u e e e le av a g e o f m 洲 A ，thereb y P rev e nt in g its tran slatio n into P ro te in .F o r R N A i to b e e 士企 e

7、tiv e a n d e lie it g e n e sile n e in g re s P o n s e ，t h e d o u b le s tr a n d R N A m o le e u le sm u st b e d e liv ered into the targ et cell.U sin g v ecto rs to ex P ress she rth airpin R N A s (shR N A s)th a t a re P r o e e s se d b y D ie e r in i o siR N A m o le e u le s e a n a

8、lso in d u e e ta r g e t g e n e sile n c in g . A n a d e n o v ira l v e e to r一b a s e d a P P ro a e h h a s n o w b e e n d e v e lo P e d f o r R N A i，w h ie h e a n a c h ie v elo n g 一te r m su P P re s sio n o f g e n e e x P re ssio n in m a n u n a lia n e e lls . W e h a v e w o n th e

9、 N S F C f u n d ，a n d th is r e se a rc h a s a b a sis f o r th e S H A 即 一2 g e n e in o r g a n t ra n sP la nt a tio n re se a r e h toe o n stn j c t th e S H A 好 一2 g e n e 一s P e c if ie R N A in i e rf e re n e e a d e n o v ir u s v e c to r sy ste m s ·O b jee tive:T o eo n strU et

10、reeo m b in ant ad en o v irus (R ad 一h S H A 即 ) ex P ressin g sh orth airpin R N A(S H A 即 一2 一sllR N A) .M e th o d S :：浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文1 .A c o u P le o f S H A R P 一2 一Sh R N A te m P la te D N A se q u e n e e s w e re d e s ig n e d a n d sy n th e siz e d .T h e a nn e a le d sllR N A t

11、e m P la te s w e re in se r te d in t o P D C 3 1 6 一E G F P 一U 6 S h u tt le P la sm id tocon strIJct the rec om b in at p lasm id s(p D C 3 16一S H AR p 一sh RN A ).2 .T h e P D C 3 1 6 一S H A R P 一sh R N A S h u t tle P la sm id s a n d th e B a c k b o n e P la Z m idP B H G lo x d e lE 1 3 e re

12、w e r e e o t ra n s f ec te d in to 2 9 3 c e lls ，to e o n str u e t t h e re e o n b in e dad en o v irus(R ad 一h s H A RP ).T h e D N A e x t ra e te d f ro m th e re c o m b in e d a d e n o v ir u sa n d w a s v e rif ie d b y P C R 二.T h e S H A R P 一2 g e n e s ile n e in g w ith v e e to r

13、o f re c o m b in a nta d e n o v i幾 s w a s d e te r m in e d b yR T 一P C R in N R K e e lls .R e s u lts :1 .T h e s u c c e s s f u l c lo n in g o f S H A R P ·2 一sh a 困 A te m P la te D N A se q u e n e e s if ltoP D C 3 1 6 一E G F P 一U 6 S h u t tle P la sm id w a s c o n f ir m e d b y t

14、h e se q u e n e in g te c h n iq u e . 2 .T h e P D C 3 1 6 一S H A R P 一sh R N A S h u ttle P la sm id a n d th e B a e k b o n e P la z m idP B H G lo x d e lE 1 3 c r e w e re c o tr an s f e c te d in t o 2 9 3 e e lls ，a n d t h e re c o n m in a nt a d e n o v ir u s w a s c o n st rU e te d s

15、 u e e s s f u lly w i t h h ig h tite r.3 .T h e a n a ly sis ()f P C R in d ie a te d th a t t he re e o m b in a nta d e n o v ir u s R a d 一h S H A R P e o n ta in in gS H A R P 一2 一sh R N A te m P la te se q u e n c e ·4 .T h e su c e e ss o f sile n e in g t h e S H A 即 一2 g e n e w ith v

16、 e c to r o f re c o m b in e d 毗 e n o v ir u s w a sd e te r m in e d b y R T 一P C R in N R K e e lls .C o n e lu s io n :T h e r e c o m b i一ia n t a d e n o v ir u s w h ie h e x P re ssin g sh o r t h a ir p in R N A ta rg e tin g S H A R P 一2g e n e h a d b e e n e o n str u c te d s u e e e s

17、 s f u lly ，w h ic h m a y b e u s e d f o r f u r th e r in v e stig a tio n o f t h e允 n tlo n o f S H A 即 一2 g e n e sile n c in g w ith a d e n o v ira l v e e to r in P o lif era tio n a n d d if fe re n t ia tio n o f T e e lls .K e y w o r d s :R N A in ie rf ere n e esm a ll h a ir p in R N

18、AS H A 即 一2 g e n eA d e n o v ir u s浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文、 五前口RN A 干 擾 (RNA i ) 是 近 十 年 出 現(xiàn) 的 一 種 能 高 效 抑 制 靶 基 因m R NA 表 達(dá) 的 方 法 川 ，RNAi 即 雙 鏈 R NA (dou b le :;tr a n d e d ， d SR N A ) 依 賴 的基 因 轉(zhuǎn) 錄 后 沉 默 (p O S t T r a n SCr ip t io na l gen e S ilen C in g ， PT Gs )， 是 生 物 界 普 遍 存 在 的 一 種 古老 而 進(jìn)

19、 化 上 高 度 保 守 的 遺 傳 學(xué) 行 為 ”。其 自然 功 能 是 抑 制 細(xì) 胞 中 轉(zhuǎn) 座 子 的 遷 移 、抵 御 病 毒 等 外 來 核 酸 的 侵 入 以及 調(diào) 控 基 因表 達(dá)等 ，從 而 維 持 基 因 組 的 完 整 性 和 穩(wěn) 定 性 。R N Ai 主 要 是 通 過 ds RNA 被 核 酸 酶 切 割 成 2 1一23b p 的 s iRNA ，進(jìn) 而 導(dǎo) 致 RNA 誘 導(dǎo) 的 沉 默 復(fù) 合 體 (RNA indu ced S ile n C in g com p lex ，R ISe)形 成 ，后 者在 S IRN A 反義 鏈 的介 導(dǎo) 下 識(shí) 別 并靶

20、 向切割 同源 性m RN A 而 發(fā) 生PTG S 【3。作為一種 全 新 的基 因沉 默 技 術(shù) ，R NAi 具 有 高 特 異 性 、高 效 性 、傳 遞 性 以及 時(shí) 間 劑 量 依 賴 性 等 特 點(diǎn) ， 可 同 時(shí) 抑 制 多 個(gè) 不 同基 因 ， 而 且 抑 制 效 果 互 不 干 擾 ，其 優(yōu) 勢(shì) 是 反 義 寡 核 昔 酸 、核 酶 ，為 人 類 基 因 組 功 能 研 究 、基 因 治 療 及 藥 物 開 發(fā) 等 提 供 了 強(qiáng) 有 力 的 技 術(shù) 支 持 。因 此 RNAi 被 科 學(xué) 雜 志 評(píng) 為 2002年 度 十 大 科 技 之 首 川 ， 自然 雜 志 亦 將

21、 其 列 為 200 2 年 度 最 重 要 科 技 發(fā) 現(xiàn) 之 一 【5，。 目前 RN Ai 己從 “認(rèn) 知 階 段 ” 發(fā) 展 到 “應(yīng) 用 階 段 ”RN Ai 技 術(shù) 常 用 的技 術(shù) 策 略 包 括 直 接 利 用 體 外 合 成 的 小 干 擾 RN A (51RNA ) ，借 助 脂 質(zhì) 體 介 導(dǎo) 或 者 電轉(zhuǎn) 等 方 法 轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 ， 將 si RNA 輸 送 入 胞 漿 內(nèi) ， 進(jìn) 入 RN Ai 途 徑 【6，”。不 同 的研 究 者 報(bào) 道 利 用 脂 質(zhì) 體 介 導(dǎo) 的 方 法 ，在 不 同細(xì) 胞 系 siRNA 對(duì) 靶 基 因 的 沉 默 效 率 從 40%

22、 到990/0 不 等 【8，對(duì) 一 些 不 宜 轉(zhuǎn) 染 的 細(xì) 胞 ， si RNA 的 基 因沉 默 效 率 往 往 不 夠 理 想 。RN Ai 技 術(shù) 的 另一 條 途 徑 是 模 擬 體 內(nèi)mi RNA 機(jī) 制 ， 利 用 D NA 載 體 在 胞 內(nèi) 表 達(dá) sh RN A ， 在 細(xì) 胞 自身 D ier 酶 的 作 用 下 ， 生 成 si RNA ，進(jìn) 入 RN Ai 途 徑 。 哺 乳 動(dòng) 物 細(xì) 胞 內(nèi)載 體 表 達(dá) S IRN A 技 術(shù) 具 有 成 本 低 、 操 作 簡(jiǎn) 單 、可 杜 絕 核 酸 酶 的 污 染 、特 異 性 強(qiáng) 、作 用 迅 速 且 細(xì) 胞 內(nèi)較

23、長(zhǎng) 期 穩(wěn) 定 表 達(dá) 等 優(yōu) 點(diǎn) ，為 RN A i 技 術(shù) 在 生 物 醫(yī) 學(xué) 領(lǐng) 域 的 進(jìn) 一 步 推 廣 應(yīng) 用 提 供 了 可 靠 的 技 術(shù) 保 障 。帶 有 PO I 工工啟 動(dòng) 子 和 ShRN A 編 碼 序 列 的 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 哺 乳 動(dòng) 物 細(xì) 胞 后 ， 能 夠 轉(zhuǎn) 錄 出 含 有 19 b p 的 shRNA ， 從 而 誘 導(dǎo) R N Ai ，有 效 抑 制 目 的 基 因 。 其 優(yōu) 點(diǎn) 在 于 : 排 除 了 RNA 酶 的 干 擾 ， 延 長(zhǎng) 了 5 1RN A 的 半 衰 期 ; 載 體 可 以 復(fù) 制 擴(kuò) 增 ， 能 夠 顯 著 降 低 si RN

24、A 的 成 本 ; 最 重 要 的 是 ， 利 用 該 方 法 可 以進(jìn) 行 穩(wěn) 定 表 達(dá) 細(xì) 胞 株 的篩 選 ， 并 且 隨 著 載 體 的 復(fù) 制 擴(kuò) 增 。鑒 于 Sh RN A 如 此 的 有 點(diǎn) ，我 們 采 用 細(xì) 胞 內(nèi) 表 達(dá) Sh R NA 的 方 法 以 利 于 基 因 沉 默 的 持 續(xù) 表 達(dá) 。目前 哺 乳 動(dòng)物細(xì)胞 內(nèi)RN Ai 采 用 的載 體 系 統(tǒng) 分為兩大類 :非 病 毒 類 載 體 和 病毒類載體 。非 病 毒 類 載 體 主 要 為 含 有 真 核 表 達(dá) 元 件 的 穿梭 質(zhì) 粒 ，構(gòu) 建 能 夠 穩(wěn) 定 高 效 表 達(dá) 特 異 性浙 江 大 學(xué)

25、醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文s iRN A 的 載 體 成 為 將 RN A i用 于 哺 乳 動(dòng) 物 細(xì) 胞 基 因 功 能 研 究 的 必 經(jīng) 途 徑 。 33，34其 對(duì) 靶 基 因 的 抑 制 時(shí) 間 雖 然 長(zhǎng) 于 化 學(xué) 合 成 的 S IR NA ，但 由 于 其 效 果 較 為 短 暫 ，載 體 轉(zhuǎn) 染 的 效 率 低 ，體內(nèi)應(yīng) 用 不 穩(wěn) 定 等 缺 點(diǎn) 而 較 少 使 用 。 【9病 毒 類 載 體 是 目前 應(yīng)用 最廣泛 的基 因載 體 ，作 為 基 因治療 的病 毒 克服 了質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 效 率 低 的 缺 點(diǎn) ，并 可 體 內(nèi)應(yīng) 用 ，可 實(shí) 現(xiàn) 長(zhǎng) 時(shí) 間

26、的 靶 基 因沉 默 ，具 有 臨 床 應(yīng) 用 前 景 等 優(yōu) 勢(shì) ?；?因 治 療 的 病 毒 必 須 事 先 子 以基 因 改 造 ，將 病 毒 的主 要 致 病 基 因 去 除 ，然 后 將 治 療 基 因和 有 關(guān)基 因 的表 達(dá) 元件包裝到載 體 中去 。 目前 常用病毒載體 主要 有 以下幾類 :腺 病 毒 、 腺 相 關(guān) 病 毒 、 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 及 慢 病 毒 ， 并 各 具 有 不 同 的優(yōu) 點(diǎn) 。 腺 相 關(guān) 病 毒 (A A V) 己成 功 的 用 于 : iRN A 的 運(yùn) 送 【。，;Er ic D e vr o e 【“開 發(fā) 研 制 了 RNA i 的 逆

27、轉(zhuǎn) 錄 病 毒 載 體 ， 并 在 H e la 細(xì) 胞 中 實(shí) 現(xiàn) 了 對(duì) P7 5 基 因 的 長(zhǎng) 期 穩(wěn) 定 敲 除 ; M a ta H 【，證 實(shí) 慢 病 毒 載 體 可 以 在 哺 乳 動(dòng) 物 細(xì) 胞 高 效 表 達(dá) S IRNA ，并 且 不 受 細(xì) 胞 分 裂 狀 態(tài) 的 影 響 ;U p r iC h ar d“3用 腺 病 毒 S IRNA 載 體 ，設(shè) 計(jì) 針 對(duì) 乙肝 病 毒 RNA 的 S IRNA ，在 體 外 成 功 清 除 HB VR NA 并 抑 制 乙肝 病 毒 的 復(fù) 制 達(dá) 數(shù) 天 。其 中 腺 病 毒 具 有 以下 優(yōu) 點(diǎn) : 1. 宿 主 范 圍 廣

28、 ， 對(duì) 人 致 病 性 低 ; 2 . 在 增 殖 和 非 增 殖 細(xì) 胞 中 感 染 和 表 達(dá) 基 因 ; 3 . 能 有 效 進(jìn) 行 增 殖 ，易 于 純 化 ，滴 度 高 ; 4 . 不 插 入 到 染 色 體 中 ， 整 合 突 變 致 癌 或 遺 傳 毒 性 小 ; 5 . 能 同 時(shí) 表 達(dá) 多 個(gè) 基 因 。【“正 是 由 于 具 有 以上 一 些 優(yōu) 點(diǎn) ， 腺 病 毒 被 極 其 廣 泛 地 應(yīng) 用 于 體 外 基 因 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 、體 內(nèi)接 種 疫 苗 、和 基 因 治 療 等 各 個(gè) 領(lǐng) 域 。而 腺 病 毒 載 體 成 為 近 年 來 基 因 治 療 中 應(yīng) 用 較 為

29、 廣 泛 的 病 毒 載 體 ，并 占 了 臨 床 基 因 治 療 的25 % 【5，。 但 腺 病 毒 載 體 本 身 也 有 一 些 不 足 之 處 :腺 病 毒 載 體 是 一 種 非 整 合 載 體 ， 其 目的 基 因 的 表 達(dá) 較 為 短 暫 ，對(duì) 于 非 分 裂 相 細(xì) 胞 ，其 介 導(dǎo) 的 基 因轉(zhuǎn) 移 可 持 續(xù) 表 達(dá) 幾 個(gè) 月 ，但 對(duì) 于 增 殖 旺 盛 的 細(xì) 胞 ，要 達(dá) 到 長(zhǎng) 期 的 基 因 表 達(dá) ，則 需 重 復(fù) 給 予 【6;此 外 腺 病 毒 是 高 度 免 疫 源 性 的 ， 這 影 響 基 因 表 達(dá) 和 治 療 效 果 【17，; 并 且 腺

30、病 毒 載 體 缺 乏 明 確 的 組 織 趨 向 性 ， 且 其 對(duì) 肝 臟 的 顯 著 毒 性 ， 有 礙 于 腺 病 毒 載 體 在 體 內(nèi)試 驗(yàn) 的運(yùn) 用 【，。大 鼠 的 S H A RP 一2 (enh ancer of sp lit一an d h airy 一related p rotein 一2 ) 含 4 11個(gè) 氨 基 酸 ， 是 轉(zhuǎn) 錄 因 子 b H L H 家 族 ，在 人 和 小 鼠 中 分 別 稱 為 s trl3 和 D E cl “8，。 S H A 即 一2 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 細(xì) 胞 增 殖 ，分 化 ，腫 瘤 形 成 的 起 了重 要 的 作 用 【20

31、。 S H A RP 一2 基 因 普 遍 表 達(dá) ，但 其 表 達(dá) 的 調(diào) 節(jié) 有 細(xì) 胞 組 織 特 異 性 。例 如 : 在 嗜 鉻 細(xì) 胞 瘤 P C 12 細(xì) 胞 中 S H A RP 一2 的 m R N A 水 平 在 神 經(jīng) 生 長(zhǎng) 因 子 的 作 用 上 可 以上 調(diào) 【，; 在 P 19 小 鼠 胚 胎 癌 細(xì) 胞 中 ，在 神 經(jīng) 細(xì) 胞 的 分 化 過 程 中 Stra 13 的 m R N A 水 平 在 可 以 由維 甲酸 的 作 用 而 增 高 【川 ;此 外 D ECI 的 mR NA 在 軟 骨 細(xì) 胞 中 由浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文于 cA

32、M P 的 作 用 下 可 有 高 表 達(dá) 【22。而 在 S un H 23 等 人 在 對(duì) S tra 13一/- 小 鼠 的 研 究 中 發(fā) 現(xiàn) St ra l3 對(duì) T 淋 巴細(xì) 胞 的 活 化 包 括 克 隆 增 殖 、 細(xì) 胞 因 子 的 產(chǎn) 生 和 活 化 細(xì) 胞 的 清 除 都 起 到 了 負(fù) 向調(diào) 節(jié) 的 作 用 ，其 中S七ra1 3一/ 一的 n ai v e CD 4 +T 淋 巴 細(xì) 胞 在 抗 CD 3 及 抗 CD 28 的 刺 激 下 增 殖 減 弱 ，且 工L一2 的產(chǎn) 生 減 少 70% ，IN F一Y 及 工L 一4 均 減 少 ，表 達(dá) St ra1 3

33、 的 重 組 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 對(duì) T 細(xì) 胞 的 感 染 后 則 完 全 逆 轉(zhuǎn) 前 述 異 常 。 鑒 于 S H A 即 一2 基 因 的 敲 除 可 能 對(duì) 器 官 移 植 關(guān) 鍵 因 子 IL 一2 及 IN F 一Y 產(chǎn) 生 強(qiáng) 烈 的抑 制 ，以及 SHA R P 一2對(duì) T 淋 巴細(xì) 胞 的 活 化 包 括 克 隆 增 殖 、細(xì) 胞 因 子 的產(chǎn) 生 和 活 化 細(xì) 胞 的重 要 作 用 ， 我 們 擬 采 用 RNA 干 擾 技 術(shù) ，探 究 SHAR P一2 的 作 用 。本 研 究 以 腺 病 毒 為 載 體 ， 利 用 RNA 干 擾 技 術(shù) ，將 針 對(duì) S HA

34、RP一2 基 因 的 小 發(fā) 夾 干 擾RN A 片 段 導(dǎo) 入 腺 病 毒 ， 通 過 基 因 重 組 技 術(shù) 成 功 在 HE K2 93 細(xì) 胞 中 構(gòu) 建 了 能 穩(wěn) 定 表 達(dá)R a d 一h S H A R p 的 重 組 體 腺 病 毒 。 并 在 體 外 實(shí) 驗(yàn) 成 功 下 調(diào) 了 N RK 細(xì) 胞 的 S隊(duì) RP 一2 基 因 的 表達(dá) ， 為 S H A RP 一2 基 因 功 能 體 內(nèi)體 外 研 究 提 供 了 一 條 新 途 徑 。浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文實(shí) 驗(yàn) 材 料 和 方 法.實(shí) 驗(yàn) 細(xì) 胞 系 :人 胚 腎 293 細(xì) 胞H E K 2 9

35、3浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 傳 染 病 研 究 所 惠 贈(zèng)正 常 大 鼠 腎 細(xì) 胞N R K c e ll中 國(guó)科 學(xué) 院 細(xì) 胞 庫(kù)上 海1.1 目的細(xì) 胞 的 培 養(yǎng) :l) 活 細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) : 用 無 血 清 培 養(yǎng) 基 把 細(xì) 胞 懸 液 稀 釋 到 2 00 一 2 0 0 0 個(gè) / 毫 升 (一 般 稀 釋 倍 數(shù) 為 10 0 倍 )，在 0 . 1 毫 升 的 細(xì) 胞 懸 液 中加 入 0 . 1 毫 升 的 0 .4 % 的 臺(tái) 盼 蘭 溶 液 。輕 輕 混 勻 ，數(shù) 分 鐘 后 ， 用 血 球 計(jì) 數(shù) 板 計(jì) 數(shù) 細(xì) 胞 。 活 細(xì) 胞 排 斥 臺(tái) 盼 蘭 ， 因

36、 而 染 成 藍(lán) 色 的 細(xì) 胞 是 死 細(xì) 胞 。2)細(xì) 胞 株 的凍 存 : 取 培 養(yǎng) 2 一 3 天 生 長(zhǎng) 旺 盛 的 細(xì) 胞 ，用 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 液 將 細(xì) 胞 配 成 2 X I擴(kuò)一 Z X IO ，/ m l ; 在 lm l 細(xì) 胞 凍 存 管 中 加 入 0 . 5ml 細(xì) 胞 懸 液 ， 0.4m l 小 牛 血 清 和 0 . lml 二 甲基 亞 礬 ( 或 甘 油 ) ， 混 勻 后 密 封 。 置 4 O . 5 小 時(shí) ， 一 2 0 2 小 時(shí) ，然 后 直 接 放入 液 氮 中 或 置 液 氮 蒸 汽 上 過 夜 后 浸 入 液 氮 中 。3)細(xì) 胞 復(fù)

37、蘇 : 從 液 氮 罐 中 取 出細(xì) 胞 凍 存 管 ，迅 速 放 入 盛 有 50 水 的 水 浴 中 ，并 不 時(shí) 搖 動(dòng) ，盡 快 解 凍 。用 70 % 酒 精 擦 拭 消 毒 后 ，移 至 凈 化 臺(tái) 上 ，吸 出細(xì) 胞 懸 液 至 培 養(yǎng) 瓶 中 ， 把 lml 凍 存 細(xì) 胞 加 入 到 大 約 5ml 完 全 生 長(zhǎng) 培 養(yǎng) 基 ， 輕 輕 混 勻 。 以大 約 5的 g 離 心 2 到 3 分 鐘 。 棄 去 上 清 。在 完 全 生 長(zhǎng) 培 養(yǎng) 基 輕 輕 再 次 懸 浮 細(xì) 胞 ，并 且 進(jìn) 行 活 細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) 。 細(xì) 胞 鋪 板 ， 細(xì) 胞 接 種 應(yīng) 該 至 少

38、為 3 x 105活 細(xì) 胞 / m1 。4)細(xì) 胞 傳 代 : 棄 去 舊 培 養(yǎng) 液 ，加 入 s mL 滅 菌 D 一H A N KS 溶 液 ，輕 輕 晃 動(dòng) ，洗 滌 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 面 ，然 后 棄 去 D 一HA N K S 溶 液 ; 加 入 2 ml 胰 酶 消 化 液 ， 消 化 1一 Z m 如 將 細(xì) 胞 消 化 下 來 ; 加 入 含 10% 胎 牛 血 清 和 100 U /m1 雙 抗 的 16 4 0 培 養(yǎng) 基 5 m l ， 用 吹 打 管 吹 打 數(shù) 次 ， 將 瓶 壁 上 的 細(xì) 胞 沖 洗 下 來 ; 混 勻 細(xì) 胞 后 分 至 兩 個(gè) 新 的 培 養(yǎng)

39、 瓶 中 ， 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 。浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文2 . 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 及 設(shè) 備 :2 . 1 試 劑PC R 用 試 劑 p r im e r上 海 英 駿 公 司M g C L Z上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司d N T P S上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司T a q P o l y m e r a s e上 海 生工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司d s D N A 0 1 1 9 0上 海 吉 凱 基 因技 術(shù) 有 限 公 司 合 成B a mHIP r o m e g ae a t . N o . R 6 0 2 1H i

40、n d 111P r o m e g aT 4 D N A L i g a s eP r o m e g ac a 七. N o . 2 3 7 5 8 6T 4 D N A 1 i g a s e b u f f e rP r o m e g ae a t . N o . 2 3 7 5 8 6B S AP r o m e g a丙 烯 酞 胺上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司雙 丙烯 酞 胺上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司T r iS一硼 酸上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司E D T A上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司A P上 海 生

41、工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司T E M E D上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司L B M e d iu m(p ow er )上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司L B B r o t h A g a r上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司C a C 1 2上 海 越 俊 生 化 有 限 公 司雙 抗上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司0 . 2 5 % T r y P i n 一E D T AG I B E C O 2 5 2 0A m P i e e l i n s o d i u ms a l tB I O B A S I C I N C

42、A g a r o s e上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司D N A l a d d e r M a r k e r上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司D N A l o a d i n g B u f f e r上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司D ME M 培 養(yǎng) 基G I B E C O胎 牛 血 清杭 州 四季 青 公 司測(cè) 序I n v i t r o g e nUN 工Q一10 柱 式 質(zhì) 粒 小 量 抽 提 試 劑 盒上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司UN 工Q一10 柱 式 PCR 產(chǎn) 物 純 化 試 劑 盒上 海 生 工 生 物

43、 工 程 技 術(shù) 公 司Q i a g e n P l a z m i d m i d i k i tQ i a g e n ，G e r m a n yT r 1 2 0 1M R C . I n CM M LV 第 一 鏈 CD NA 合 成 試 劑 盒上 海 生 工 生 物 工 程 技 術(shù) 公 司L I P o f e e t a m i n e2 0 0 0I n v i t r o g e n ， U . 5 . A .浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文2，2 儀 器穩(wěn) 壓 電 泳 儀B i o R a d凝 膠 成 像 儀B i o R a d超 純 水 儀H i一t e

44、e h 公 司K F lo w 型細(xì) 菌 搖 床T h e r m o細(xì) 菌 培 養(yǎng) 箱上 海 一 恒 科 學(xué) 儀 器 有 限公 司P C R 儀B i o R a dM y C y e l e r TM T h e r m a l e y e l e r核 酸 / 蛋 白質(zhì) 定 量 儀B E C K M A N C O U LT ER 公 司 D U S O O 型制 冰 機(jī)G R A N T F M 7 OC OZ培 養(yǎng) 箱T h er m o E le e tr on 公 司M o d e l :3 1 1 1電 熱 恒 溫 鼓 風(fēng) 千 燥 箱上 海 精 宏 實(shí) 驗(yàn) 有 限 公 司DH

45、G 一9 12 3 型高 速 冷 凍 離 心 機(jī)S o r v a l l L E G E N D R T L i n g L i L D Z S 一2落 地 式 高 速 冷 凍 離 心 機(jī)H I T A C H I h i m a s C R 2 2 F常 溫 離 心 機(jī)E P P e n d o r f C e n t r i f u g e 5 4 1 5 D旋 渦 混 勻 器S e i e n t i f i e i n d u s t r i e s一 次 性 平 皿B I O B A S I C I N C5 0 m l聚 丙 烯 管F a l e o n2 5 em 2培 養(yǎng) 瓶

46、F a l e o n6 孔 板F a l e o n濾 器M I L L E X G V移 液 器德 國(guó) E p p e n d o r f 公 司水 浴 箱上 海 精 宏 實(shí) 驗(yàn) 有 限 公 司DK一8D 型T h e r m o E l e e t r o n C o r P o r a t i o n F o r m a C l a s s生 物 安 全 柜11 ，A Z熒 光 顯 微 鏡O l y m P u s I X 7 1E X F O X 一C i t eF o r m a S e i e n t i f i e一80 低 溫 冰 箱一2 0 C 低 溫 冰 箱西 門 子E

47、P 管A X Y G E NP I P E T T 工P SA X Y G E NT R 一2 2 2 一Y高 溫 高 壓 滅 菌 鍋T O M Y S X 一5 0 0凝 膠 成 像 儀U n i v e r s a l h o o d l 卜 s n 7 6 s / 0 4 1 5 5._ _ . _ _ 一_ 舊. _. 一一 鯉 竺 絲 燮 鯉 墊 達(dá) 一 一 一 一 一 一 一3.實(shí) 驗(yàn) 流 程介口特冷粼哪5 ，一C 直C 竹霧蕙尹跟一一T T C C 么一5 ，帥PE 烹C F P 一U 6嬰一羔_ 上矛默黔525Tbp蘿 一聲 .一廠 _ 到舊 . ”， 含補(bǔ). 滬L、入 臼一盛

48、婦 “. 目娜月腸*卯，.公 、 ，兒1 吧幾 ，切 “鉑傀 詡 . 飛漪 ” 喻5 一C A C T T ; 。一T T C G 人一5 ，睦 腳翻目 側(cè)公 比 臺(tái) 湯砂 飛t e ，P l a t e1 9 0 31 0 d 鮮 .S i t e p e c i f i cr e c o . b i n 欲 1 0 ” 自A 冷 _呱 呱 ，哪 瑰 準(zhǔn) 爵 撇 瀚 緲 、 、 互哪 限 卿 啼 摧級(jí) 班朋孫吩助 映-剔 娜 嘩墓率率人d e n o v i r u s率尋.·H a r v e s t加R 且 e e l l i n f e e t i o n基A s s a y

49、f o rg e n e s 即 P r e s s 1 0 nl 2浙 江 大 學(xué) 醫(yī) 學(xué) 院 碩 士 論 文4 . 實(shí) 驗(yàn) 溶 液 的 配 置氨 節(jié) 青 霉 素 的 貯 存 液 配 置 : 10 Omg /m1稱 取 。.59 氨 節(jié) 青 霉 素 溶 于 5ml 去 離 子 水 中 ，用 濾 器 0 . 2 2 林m的 濾 器 過 濾 ，分 裝 于1.5m 的無 菌 EP 管 中 ，使 用 時(shí) l : 10 0 0 稀 釋 ， 終 濃 度 為 10 0 陀 / m1無 血 清 FB S 培 養(yǎng) 基 :D M EM5 00m l10 % F B S 培 養(yǎng) 基 :DM EM5 0 Om lI

50、O OU 青 霉 素10 % 滅 活 FBS10 0 陀 鏈 霉 素10 0 U 青 霉 素100 瑰 鏈 霉 素 CaC I:溶 液 :C aC 12 ·ZH ZO 1.4 7 9 加 無 菌 去 離 子 水 10omm oF L ，用 0 .2 2 林m 的 濾 器 過 濾 除 菌 。 5. 實(shí) 驗(yàn) 步 驟5. 101 190 D NA 設(shè) 計(jì) 和 合 成5. 1 1 s iR N A 設(shè) 計(jì) :M a r k e rT a r g e t S e q u e l lc eS ta r t P o s itio nG C P e r e e n tN O .JJ工、尸r、口日、甘

51、仆和伙月月/ 曰A G A G A C G T G A C C G G 八J T A A5 0 74 7 .4 %5 5 5 5 7A C C C G A A C A I，C T C A A A C T IA5 5 74 2 .1 %5 5 5 5 7 T T ( !T C C G A A C G T G T C A C G T5 2 .6 3 %P S C N C5. 12 DN A 合 成 片 段 (上 海 吉 凱 基 因 技 術(shù) 有 限 公 司 合 成 )O lig o n a m es ，-S e n s e s e qlo o PA n ti一s e n s e s e qS H A

52、 R P 一2 一s h 5 0 7 fG A T C CA G A G A C G T G A C C G G A T T A AT T 以 A G A G AT T 從 T C C G G T C A C G T C T C TT T T T T T G G 從 AS H A R P 一2 一S h 5 0 7 rA G C T T T T C C A A A A A AA G A G A C G T G A C C G G A T T A AT C T C T T G A AT T 從 T C C G G T C A C G T C T C TGS H A R P 一2 一S h 5 5

53、 7 fG A T C CA C C C G A A C A T C T 以 從 C T T AT T C A A G A G AT A A G T T T G A G A T G T T C G G G TTT T T T T G G A A A S H A R P 一2 一S h 5 5 7 rA G C T T T T C C A A A 從 AA C C C G A A C A T C T C A A A C T T AT C T C T T G A AT A A G T T T G A G A T G T T C G G G TGS H A R P 一2 一s h N C fG A T C CT T C T C C G A A C G T G T C A C G TT T c A A G A G AA C G T G A C A C G T r C G G A G A ATT T T 竹 G G A A A S H A R P 一2 一s h N C rA G C T 竹 T C C A