Real-time PCR實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)

1、胡曉研究生實(shí)驗(yàn)技術(shù)2015-12-7qRT-PCR技術(shù)原理一一、實(shí)驗(yàn)原理：、實(shí)驗(yàn)原理：在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 反應(yīng)進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。 熒光信號(hào) + 標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析？qRT-PCR技術(shù)原理a)Ct值(Cycle Threshold;每個(gè)反應(yīng)管中熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù))與樣本初始拷貝數(shù)存在正比線性關(guān)系。b)以不同稀釋倍數(shù)的已知模板制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。c)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)未知樣本的Ct值，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到未知樣本的初始拷貝數(shù)。（定量分析）qRT-PCR技術(shù)熒光標(biāo)記方法的分類1.非特異性的非特異性的DNA結(jié)合染料法：結(jié)合染

2、料法：熒光染料能非特異結(jié)合DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中，而游離的熒光染料不發(fā)出熒光。 常用染料：Pico Green （靈敏度高,=25pg/mL） SYBR I 缺點(diǎn)：易受到非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的影響。 措施：設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。 qRT-PCR技術(shù)熒光標(biāo)記方法的分類qRT-PCR技術(shù)熒光標(biāo)記方法的分類2.特異性熒光定量特異性熒光定量PCR:以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)水解探針?lè)ǚ肿有艠?biāo)Scorpion引物/探針復(fù)合探針qRT-PCR技術(shù)影響因素樣品RNA 的完整性RNA 樣品中的基因組 DNA污染特異性良好的引物PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化反轉(zhuǎn)錄所得 cDNA 的量必須精確地等于相

3、應(yīng)的mRNA的量可靠的內(nèi)標(biāo)基因： TEF-2qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作陽(yáng)性陽(yáng)性模板模板qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作1.制作標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性對(duì)照：測(cè)定陽(yáng)性模板的濃度，10倍稀釋為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。2.反應(yīng)體系如下:(標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系)序號(hào)序號(hào) 反應(yīng)物反應(yīng)物 劑量劑量 1SYBR Green 1 染料 10l 2陽(yáng)性模板上游引物F 0.5l 3陽(yáng)性模板下游引物R 0.5l 4dNTP 0.5l 5Taq酶 1l6陽(yáng)性模板DNA 5l 7 ddH2O 32.5l 總總體積體積 50l3. 輕彈管底將溶

4、液混合，短暫離心。(內(nèi)參照基因內(nèi)參照基因反應(yīng)反應(yīng)體系體系) 序號(hào)序號(hào) 反應(yīng)物反應(yīng)物 劑量劑量 1 SYBR Green 1 染料 10l 2內(nèi)參照上游引物F 0.5l 3內(nèi)參照下游引物R 0.5l 4dNTP 0.5l 5Taq酶 1l 6待測(cè)樣品cDNA 5l 7ddH2O 32.5l 總總體積體積 50lqRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作1、 制備用于繪制制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的的DNA模板模板： 針對(duì)每一每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 10 PCR緩沖液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul 3 上游

5、引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8ddH2O 9 至25ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 35個(gè)PCR循環(huán)（941分鐘；551分鐘；721分鐘）;72C延伸5分鐘。 PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為11010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作待測(cè)樣品的

6、待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR:所有cDNA樣品分別配臵實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。 體系配臵如下：序號(hào) 反應(yīng)物 劑量1SYBR Green 1 染料 10 ul2上游引物 1ul 3下游引物 1ul 4dNTP 1ul 5Taq聚合酶 2ul 6待測(cè)樣品cDNA 5ul 7ddH2O 30ul 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作上機(jī)前樣本的制備上機(jī)前樣本的制備檢測(cè)程序的設(shè)置檢測(cè)程序的設(shè)置檢測(cè)孔及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置檢測(cè)孔及相關(guān)參數(shù)的設(shè)置熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)置熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)置運(yùn)行檢測(cè)程序運(yùn)行檢測(cè)程序結(jié)果的顯示與輸出結(jié)果的顯示與輸出結(jié)果

7、分析結(jié)果分析熔解曲線熔解曲線擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）假陽(yáng)性：熒光染料能和任何假陽(yáng)性：熒光染料能和任何 ds DNA 結(jié)合，因此它也能與結(jié)合，因此它也能與非特異的非特異的雙鏈雙鏈如如引物二聚體引物二聚體或或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物等結(jié)合。等結(jié)合。要避免這些非特異熒光信號(hào)對(duì)定量精確性的影響，可以利用熱循環(huán)儀內(nèi)設(shè)定的熔解反應(yīng)程序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲熔解曲線分析。線分析。熔解曲線峰為熔解曲線峰為單一峰形，未單一峰形，未見(jiàn)其他峰值，見(jiàn)其他峰值，并且峰的形狀并且峰的形狀也比較銳利

8、。也比較銳利。擴(kuò)增產(chǎn)物特異擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。性好。qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）有研究建議在每一個(gè)循環(huán)中 PCR 延伸后增加一步，即將溫度提高后再檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光。該檢測(cè)溫度大于引物二聚體的退火溫度 Tm，而小于特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的 Tm值。在此溫度下，引物二聚體都變性成單鏈，因此只檢測(cè)到與特異性 PCR 產(chǎn)物結(jié)合的 SYBR Green I 所發(fā)出的熒光，消除了引物二聚體的干擾，降低了非特異性熒光，有助于目標(biāo)基因的準(zhǔn)確定量。qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）標(biāo)準(zhǔn)品的選擇： 理論上可以以目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品，但是存在降解、污染等因素影響定量結(jié)果。論壇網(wǎng)友給出了幾種解決方法：另設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于熒光PCR；將擴(kuò)增序列插入T載體后作為標(biāo)準(zhǔn)品；設(shè)計(jì)一對(duì)外圍引物擴(kuò)增PCR,將產(chǎn)物連入T載體(+)qRT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作（優(yōu)化）1、同管擴(kuò)增：減少操作誤差，引物間影響大、同管擴(kuò)增：減少操作誤差，引物間影響大2、異管擴(kuò)增：擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)可信，具有操作誤差、異管擴(kuò)增：擴(kuò)增結(jié)果真實(shí)可信，具有操作誤差1.總RNA提?。?.模板cDNA制作；3.半定量PT-PCR：1.引物設(shè)計(jì)及選擇：引物設(shè)計(jì)及選擇：a)上下游引物設(shè)計(jì)在跨內(nèi)含子的一個(gè)外顯子的5端和下一個(gè)外顯子的3端。b)設(shè)計(jì)在兩個(gè)離得遠(yuǎn)的外顯子上。2.引物的長(zhǎng)度：引物的長(zhǎng)度：嚴(yán)格