第六章-目的重組子的篩選與鑒定PPT課件

1、2021/6/71 第六章第六章 陽性重組子的篩選和鑒定（檢）陽性重組子的篩選和鑒定（檢） 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子與與非轉(zhuǎn)化非轉(zhuǎn)化子、子、重組子重組子與非重組子、與非重組子、目的重組子目的重組子與非目的重與非目的重組子。組子。 轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子 重組子重組子 目的重組子目的重組子2021/6/72陽性重組子的篩選和鑒定（檢）陽性重組子的篩選和鑒定（檢） 一、根據(jù)遺傳表型篩選一、根據(jù)遺傳表型篩選 二、應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選二、應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選 三、核

2、酸探針篩選三、核酸探針篩選 四、四、PCR篩選篩選 五、菌落原位雜交技術(shù)五、菌落原位雜交技術(shù) 2021/6/73 不同檢測方法可以歸類于以下三個(gè)層次：不同檢測方法可以歸類于以下三個(gè)層次：載體遺傳標(biāo)記檢測載體遺傳標(biāo)記檢測克隆克隆DNA序列檢測序列檢測1. 外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測外源基因表達(dá)產(chǎn)物檢測2021/6/74一、根據(jù)遺傳表型篩選一、根據(jù)遺傳表型篩選 1 1抗生素平板篩選抗生素平板篩選2 2 互補(bǔ)篩選互補(bǔ)篩選3 3插入表達(dá)篩選插入表達(dá)篩選 4 4噬菌斑篩選噬菌斑篩選 2021/6/751抗生素平板篩選抗生素平板篩選 大多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因，常見的有大多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因

3、，常見的有抗氨芐青霉素基因抗氨芐青霉素基因(Ampr)、抗四環(huán)素基因、抗四環(huán)素基因(Tetr)、抗、抗卡那霉素基因卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源等。如果外源DNA片段插入載片段插入載體的位點(diǎn)在抗藥性基因之外，不導(dǎo)致抗藥性基因的體的位點(diǎn)在抗藥性基因之外，不導(dǎo)致抗藥性基因的插入失活，仍能編碼抗藥性基因，這種含有重組子插入失活，仍能編碼抗藥性基因，這種含有重組子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平板上生長的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平板上生長成菌落。成菌落。2021/6/76 但是除陽性重組子以外自身環(huán)化的載體、未但是除陽性重組子以外自身環(huán)化的載體、未酶解完全的載體以及非目的基因插入載體

4、形成酶解完全的載體以及非目的基因插入載體形成的重組子均能轉(zhuǎn)化細(xì)胞而能生長，故本法僅是的重組子均能轉(zhuǎn)化細(xì)胞而能生長，故本法僅是陽性重組子的初步篩選。陽性重組子的初步篩選。2021/6/77 同樣還可應(yīng)用插入失活雙抗生素對(duì)照篩選法，在含同樣還可應(yīng)用插入失活雙抗生素對(duì)照篩選法，在含有兩個(gè)抗藥性基因的載體中，通過插入失活其中一有兩個(gè)抗藥性基因的載體中，通過插入失活其中一個(gè)基因，可用兩個(gè)分別含有同藥物的平板對(duì)照篩選個(gè)基因，可用兩個(gè)分別含有同藥物的平板對(duì)照篩選陽性重組子。如陽性重組子。如pBR322質(zhì)粒含有質(zhì)粒含有Tetr、Ampr雙抗雙抗藥性，插入失活藥性，插入失活Tetr后，后，Tet r 、Ampr

5、為含載體的陰為含載體的陰性菌落，性菌落，Tet - 、Ampr表型的菌落為陽性，表型的菌落為陽性，Tet - 、Amp - 的表型不能生長，對(duì)未轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，該的表型不能生長，對(duì)未轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，該方法篩選出陽性重組子的幾率較高方法篩選出陽性重組子的幾率較高(Tetr：四環(huán)素抗：四環(huán)素抗性；性；Ampr：氨芐毒霉素抗性，：氨芐毒霉素抗性，Tet - ：對(duì)四環(huán)素敏感；：對(duì)四環(huán)素敏感；Amp - ：對(duì)氨芐青霉素敏感：對(duì)氨芐青霉素敏感)2021/6/78Ampicillin resistant? yes yesTetracycline resistant? No yesB X BBBXAmpror

6、iAmprTcroripBR322AmprTcroriScreening by insertional inactivation of a resistance gene2021/6/79Replica plating: transfer of the colonies from one plate to another using absorbent pad or Velvet (絨布).transfer of colonies+ampicillin+ ampicillin+ tetracyclinethese colonies have bacteria with recombinant

7、plasmid2021/6/7102 2 互補(bǔ)篩選互補(bǔ)篩選 利用利用 -半乳糖苷酶基因構(gòu)建的載體如半乳糖苷酶基因構(gòu)建的載體如pUC系列的質(zhì)粒系列的質(zhì)粒常采用常采用 互補(bǔ)篩選?；パa(bǔ)篩選。 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 ( -galactosidase)是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用的的 -半乳糖酶基因來自大腸桿菌的半乳糖酶基因來自大腸桿菌的Lac操縱子，它們操縱子，它們使載體中帶有大腸桿菌使載體中帶有大腸桿菌Lac操縱子的調(diào)節(jié)序列和編碼操縱子的調(diào)節(jié)序列和編碼 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N末端末端146個(gè)氨基酶的序列。用異丙基個(gè)氨基酶的序列。用異丙基

8、- -D- 硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導(dǎo)這個(gè)氨基末端片段可誘導(dǎo)這個(gè)氨基末端片段的合成，合成的片段能與宿主編碼的的合成，合成的片段能與宿主編碼的 -半乳糖苷酶缺半乳糖苷酶缺陷型進(jìn)行基因內(nèi)互補(bǔ)，恢復(fù)該酶的活性，這一過程陷型進(jìn)行基因內(nèi)互補(bǔ)，恢復(fù)該酶的活性，這一過程稱稱 -互補(bǔ)?；パa(bǔ)。2021/6/711 因此當(dāng)載體帶有因此當(dāng)載體帶有LacZ調(diào)節(jié)序列和編碼調(diào)節(jié)序列和編碼 半乳糖苷酸半乳糖苷酸N末端末端146個(gè)氨基酸的序列，而宿主中該部分序列個(gè)氨基酸的序列，而宿主中該部分序列缺陷、其他部分完整時(shí)，雖然宿主編碼的或質(zhì)粒編缺陷、其他部分完整時(shí)，雖然宿主編碼的或質(zhì)粒編碼的片段本身都沒有活性，但它

9、們互相協(xié)助則可在碼的片段本身都沒有活性，但它們互相協(xié)助則可在大腸桿菌內(nèi)形成一個(gè)具有酶活性的蛋白質(zhì)。故在誘大腸桿菌內(nèi)形成一個(gè)具有酶活性的蛋白質(zhì)。故在誘導(dǎo)物導(dǎo)物IPTG存在下，細(xì)菌在含生色底物存在下，細(xì)菌在含生色底物5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚- -D-半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)培養(yǎng)基的平板上可形成培養(yǎng)基的平板上可形成藍(lán)色菌落。當(dāng)在質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)中插入外源藍(lán)色菌落。當(dāng)在質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)中插入外源DNA時(shí)，時(shí)，可使可使 -半乳糖苷酶的氨基末端失活，從而不能進(jìn)行半乳糖苷酶的氨基末端失活，從而不能進(jìn)行 互補(bǔ)，因此帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌產(chǎn)生白色菌落?；パa(bǔ)，因此帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌產(chǎn)生白色菌落。2021/6

10、/712 藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選2021/6/7133插入表達(dá)篩選插入表達(dá)篩選 有些載體設(shè)計(jì)時(shí)，在篩選標(biāo)志基因前面連接一段負(fù)有些載體設(shè)計(jì)時(shí)，在篩選標(biāo)志基因前面連接一段負(fù)調(diào)控序列，當(dāng)插入失活該負(fù)調(diào)控序列時(shí)，其下游的調(diào)控序列，當(dāng)插入失活該負(fù)調(diào)控序列時(shí)，其下游的篩選標(biāo)志基因才能表達(dá)，如篩選標(biāo)志基因才能表達(dá)，如pTR262質(zhì)粒其質(zhì)粒其Tetr基因基因上游存在上游存在CI基因的負(fù)調(diào)控序列，基因的負(fù)調(diào)控序列，CI基因可以抑制基因可以抑制Tetr基因的表達(dá)，當(dāng)外源基因的表達(dá)，當(dāng)外源DNA片段插入片段插入CI基因的基因的Hind或或Bgl I位點(diǎn)時(shí)，位點(diǎn)時(shí)，Tetr基因阻礙解除而表達(dá)，基因阻礙解除而表達(dá)，陽性重組子

11、為陽性重組子為Tetr表型，而質(zhì)粒本身為表型，而質(zhì)粒本身為Tet - 表型，表型，故轉(zhuǎn)化細(xì)菌在故轉(zhuǎn)化細(xì)菌在Tetr平板中，只有含外源平板中，只有含外源DNA插入片插入片段的陽性重阻子的轉(zhuǎn)化菌才能生長成菌落。段的陽性重阻子的轉(zhuǎn)化菌才能生長成菌落。2021/6/7144噬菌斑篩選噬菌斑篩選 對(duì)于以對(duì)于以噬菌體載體系統(tǒng)，外源噬菌體載體系統(tǒng)，外源DNA插入插入噬菌噬菌體載體后，重組體載體后，重組DNA分子大小必須在野生型分子大小必須在野生型DNA長度的長度的78105范圍內(nèi)，才能在體外范圍內(nèi)，才能在體外包裝成具有感染活力的噬菌體顆粒，感染細(xì)菌后，包裝成具有感染活力的噬菌體顆粒，感染細(xì)菌后，形成清晰的噬

12、菌斑。沒有外源形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA片段插入的載片段插入的載體不能包裝成噬菌體顆粒，不能感染細(xì)胞并形成體不能包裝成噬菌體顆粒，不能感染細(xì)胞并形成噬菌斑，從而達(dá)到初步篩選的作用。噬菌斑，從而達(dá)到初步篩選的作用。 2021/6/715二、應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選二、應(yīng)用限制性內(nèi)切酶酶切分析篩選 對(duì)于初步篩選鑒定具有重組子的菌落，應(yīng)小量培對(duì)于初步篩選鑒定具有重組子的菌落，應(yīng)小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA，用，用相應(yīng)的內(nèi)切酶相應(yīng)的內(nèi)切酶(1種或種或2種種)切割重組子釋放出插入切割重組子釋放出插入片段，對(duì)于可能存在雙向插入的重組子還要內(nèi)切片

13、段，對(duì)于可能存在雙向插入的重組子還要內(nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后凝膠電泳檢測插入片酶消化鑒定插入方向，然后凝膠電泳檢測插入片段和載體的大小。段和載體的大小。 2021/6/716 所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源源DNADNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩

14、選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。2021/6/717三、核酸探針篩選三、核酸探針篩選 為了進(jìn)一步確定為了進(jìn)一步確定DNA插入片段的正確性，在內(nèi)切插入片段的正確性，在內(nèi)切酶消化重組子凝膠電泳分離后，通過酶消化重組子凝膠電泳分離后，通過Southern印印跡轉(zhuǎn)移將跡轉(zhuǎn)移將DNA移至硝酸纖維膜上，再用放射性核移至硝酸纖維膜上，再用放射性核素或非放射性標(biāo)記的相應(yīng)外源素或非放射性標(biāo)記的相應(yīng)外源DNA片段作為探針，片段作為探針，進(jìn)行分子雜交，鑒定重組子中的插入片段是否是所進(jìn)行分子雜交，鑒定重組子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。需的靶基因片段。 2021/6/7182021/6/

15、719四、四、PCR篩選篩選 PCR技術(shù)具有高度的靈敏度和特異性，能在極短技術(shù)具有高度的靈敏度和特異性，能在極短的時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增至數(shù)百萬倍，通過電泳，的時(shí)間內(nèi)將目的基因擴(kuò)增至數(shù)百萬倍，通過電泳，可直接觀察到產(chǎn)物的存在?？芍苯佑^察到產(chǎn)物的存在。2021/6/720 一些載體的外源一些載體的外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)，存在恒定的插入位點(diǎn)兩側(cè)，存在恒定的序列，通過與插入片段兩側(cè)的序列，通過與插入片段兩側(cè)的SP6及及T7啟動(dòng)子互啟動(dòng)子互補(bǔ)的引物，對(duì)小量抽提的質(zhì)粒補(bǔ)的引物，對(duì)小量抽提的質(zhì)粒DNA進(jìn)行進(jìn)行PCR分析，分析，不但可迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行不但可迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行D

16、NA序列分析。對(duì)于原核或真核系統(tǒng)表達(dá)型重組序列分析。對(duì)于原核或真核系統(tǒng)表達(dá)型重組子，其插入片段的序列正確性是非常關(guān)鍵的，故子，其插入片段的序列正確性是非常關(guān)鍵的，故有必要對(duì)重組子進(jìn)行序列測定。也可利用已知的有必要對(duì)重組子進(jìn)行序列測定。也可利用已知的外源外源DNA的核酸序列，設(shè)計(jì)特異的引物直接用的核酸序列，設(shè)計(jì)特異的引物直接用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并檢測產(chǎn)物。進(jìn)行擴(kuò)增，并檢測產(chǎn)物。 2021/6/721五、菌落原位雜交技術(shù)五、菌落原位雜交技術(shù) 迄今最為通用的篩選重組子技術(shù)仍為菌落或噬菌迄今最為通用的篩選重組子技術(shù)仍為菌落或噬菌斑原位雜交技術(shù)，它是先將轉(zhuǎn)化菌直接鋪在硝酸斑原位雜交技術(shù)，它是先將轉(zhuǎn)化菌直接鋪在硝酸纖維素薄膜或瓊脂平板上