16SrDNA試驗(yàn)原理

1、實(shí)驗(yàn)原理隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，細(xì)菌的分類鑒定從傳統(tǒng)的表型、生理生化分類進(jìn)入到各種基因型分類水平，如(G+C)mol%DNA雜交、rDNA指紋圖、質(zhì)粒圖譜和16S?rDNA序列分析等。？細(xì)菌中包括有三種核糖體RNA分別為5S?rRNA16S?rRNA23S?rRNArRNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成。16S?rRNA對(duì)應(yīng)于基因組DNA上的一段基因序列稱為16S?rDNA5S?rRNA雖易分析，但核甘酸太少，僅幾十bp,沒(méi)有足夠的遺傳信息用于分類研究；23S?rRNA含有的核甘酸數(shù)幾乎是16S?rRNA的兩倍，分子量太大，分析較困難。而16S?rRNA相對(duì)分子量在2kb左右，較為適合PCRT增，

2、又具有保守性和存在的普遍性等特點(diǎn)，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，序列分析的重現(xiàn)性極高，因此，現(xiàn)在一般普遍采用16S?rRNA乍為序列分析對(duì)象對(duì)微生物進(jìn)行測(cè)序分析。16SrRNA的編碼基因是16SrDNA但是要直接將16SrRNA提取出來(lái)很困難，因?yàn)橐妆粡V泛存在的RNase降解，因而利用16S?rDNA鑒定細(xì)菌，其技術(shù)路線如下：細(xì)胞培養(yǎng)DNA提上*基因組DNAPCR擴(kuò)增連接克隆陽(yáng)性克隆測(cè)序DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模16SrDNA片段回收PC唯驗(yàn)原近即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大

3、技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA二、主要器具及試劑PCR電泳系統(tǒng)、DNA提取體系、TaqPolymerase、DNAMarker)溶菌酶、dNTP和E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-TVector、瓊脂糖、SDS裂解緩沖液、50XTAE電泳緩沖液貯存液、1XTE(pH8.0)三、操作方法1.細(xì)菌基因組總DNAI的提取接種純化的菌株于LB液體培養(yǎng)基中，180r/min,37C培養(yǎng)過(guò)夜， 按以下的方法提取細(xì)菌基因組總DNA(1)菌體收集：取1.5mL新鮮的菌液于EP管中，12000r/min離心30s,棄凈?IX1%h#上清，收集菌體。(2)輔助裂解：加100ug/mL溶菌酶

4、50PL,37C處理30min。(3)裂解：向每管加入200mL預(yù)冷的SDS裂解緩沖液，用吸管頭迅速?gòu)?qiáng)烈抽吸7c以懸浮和裂解細(xì)菌細(xì)胞。,-jI/(4)向每管加入66uL5mol/LNaCl，充分混勻后，12000r/min離心10min,除去蛋白質(zhì)復(fù)合物及細(xì)胞壁等殘?jiān)?5)將上清轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入等體積的Tris-飽和酚，充分混勻，12000r/min離心3min,進(jìn)一步沉淀蛋白質(zhì)。(6)取離心后的水層，加等體積的氯仿/異戊醇(體積比24:1),充分混勻后，12000r/min離心3min,去除苯酚。小心取上清，用預(yù)冷2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA13000r/min離心15min,棄上清

5、。(8)用400PL75%勺乙醇洗滌沉淀2次(9)室溫干燥后，用40訂1XTE溶解DNA(10) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA(11)提取的基因組總DNA-40C冰箱保存?zhèn)溆?.PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA(1) 16SrDNA的PCR引物：采用細(xì)菌的通用引物27F和1492R(2) PCR反應(yīng)體系為(20小)：滅菌蒸儲(chǔ)水8.9小，10Xbuffer2PL,10mmol/LdNTP0.4L,27F和1492R引物各4L,DNA模板0.5PL,*!IX1CX*L ii.J*Taqpolymerase0.2訂。j-(3) PCR反應(yīng)條件：93C預(yù)變性5min、94C變性18s、56C退

6、火15s、72C延伸78s,循環(huán)i30次，72C延伸7min。,-jI/(4) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。3.PCR擴(kuò)增目的片斷的純化通過(guò)PCFT增出大量的目的片段，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈下的條帶的膠塊裝入1.5mL的EP管中，用B型小量DNA片段快速膠回收；切下含有目試劑盒回收DNA操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，方法如下：加入700八L溶膠液，55C水浴溶膠，其間偶爾搖動(dòng)，直至膠塊全部溶解(2)將溶膠液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000r/min離心30s,重復(fù)一次，提高回收率向吸附柱中加入500八L漂洗液，12000r/min離心30s,倒掉廢液，重復(fù)漂洗一次。12000r/min

7、離心2min以完全去除漂洗液。將吸附柱移至一個(gè)干凈的1.5mLEP管中，向吸附柱膜中央加入40AL的洗脫緩沖液，12000r/min離心2min收集DNA(5)回收DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。4.16SrDNA目的片斷的克隆PCR屯化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接體系(10訂)：膠回收產(chǎn)物2AL,pMD18-T載體1八L,Soulution15八L,無(wú)菌去離子水2L,16C連接4h。轉(zhuǎn)化E.coliJM109(1)取50ALE.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞于冰中融化。(2)將5AL連接產(chǎn)物加入到已融化的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕吸打混勻，冰浴30min。(3)42C保溫90s。?IX1i(4)冰

8、浴23min。(5)加入450小LB液體培養(yǎng)基，輕輕混勻，200r/min,37C培養(yǎng)40min。(6)取適量上述培養(yǎng)液均勻涂布在Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上，37C培養(yǎng)過(guò)夜。,-jI/5.轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定(1)重組菌株的菌落PCR通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，用滅菌的槍頭將白色菌落接種至4mLLB液體培養(yǎng)基中，200r/min,37C培養(yǎng)4h。取菌液作為PCF模板。PCF反應(yīng)體系(20AL):滅菌蒸儲(chǔ)水7.4AL,10XPCRbuffer(含15mmol/LMgCl2)2AL,10mmol/LdNTP0.4L,2.5mol/L的上游和下游引物各4PL,菌液2AL,5U/ALTaqpolymerase0.2PL。PCF反應(yīng)條件：93C預(yù)變性5min、94C變性18s、56C退火15s、72C延伸78s,循環(huán)30次，72C延伸7min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。(2)重組質(zhì)粒的核昔酸序列的測(cè)定對(duì)經(jīng)過(guò)鑒定含有目的片斷的單克隆菌液加入甘油-40C保存，同時(shí)將同一單克隆菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)得的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用BLAST搜索軟件在NCBI()的GenBank數(shù)據(jù)