悅肝膠囊對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞抗衰老作用的研究(一)

1、悅肝膠囊對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞抗衰老作用的研究(一)    作者：樸麗花， 金政， 李相伍， 蔡英蘭 【關(guān)鍵詞】 悅肝膠囊；,衰老；,大鼠肝細(xì)胞摘要：目的探討悅肝膠囊的抗衰老作用。方法以D半乳糖誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞衰老模型，觀察悅肝膠囊對(duì)肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)以及對(duì)SOD、MDA活性的影響。結(jié)果悅肝膠囊可明顯降低MDA含量，提高SOD活性；組織化學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察表明，模型組SDH活性下降，ACP活性增高，線粒體明顯腫脹、變性、嵴斷裂。悅肝膠囊可減輕上述肝損傷程度。結(jié)論 悅肝膠囊對(duì)D半乳糖損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。 關(guān)鍵詞：悅肝膠囊； 衰老； 大鼠肝細(xì)胞

2、Abstract：ObjectiveTo observe the antiaging effects of Yuegan capsule. Methods Hepatocytes injury models were induced by Dgalactose in rats in vitro, and treated with Yuegan capsule. Structure, cytochemistry of rat hepatocytes and effect of SOD, MDA activities were observed. Results Yuegan Capsule de

3、creased the content of MDA and increased SOD activity. According to the observation of histochemistry and ultrastructure, it showed that SDH activity decreased, ACP activity increased, the mitochondrion swelled and became deformed, crest broke. Yuegan capsule alleviated denatured degree above. Concl

4、usion The Yuegan Capsule has protective effects on Dgalactoseinduced injury of primary cultured rat hepatocytes.Key words：Yuegan Capsule； Aging； Rat hepatocytes 悅肝膠囊主要由葛根、丹參、西洋參、麥冬等4味中藥水提物按適當(dāng)比例配制而成的復(fù)方中成藥。此藥對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞四氯化碳損傷具有良好的保護(hù)作用。為探討悅肝膠囊是否具有抗衰老作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了悅肝膠囊對(duì)D半乳糖所致衰老大鼠肝細(xì)胞氧自由基相關(guān)指標(biāo)的影響，以及肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、組織化學(xué)的改變

5、，為尋找有效的抗衰老藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 動(dòng)物 Wistar系大鼠乳鼠，鼠齡15 d，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。 1.2 藥物與試劑悅肝膠囊由延邊大學(xué)長(zhǎng)白山天然藥物研究中心提供。制備方法：葛根30 g，丹參30 g，麥冬20 g，西洋參20 g，加蒸餾水煮1 h后過濾，濾出液備用，把原藥再煮1 h后過濾，把第1次濾出液和第2次濾出液混合，濃縮成100 ml即得。D半乳糖為上海試劑二廠產(chǎn)品。（批號(hào)為980218）人參皂苷為吉林省白山市靖宇縣黃封參藥業(yè)公司產(chǎn)品，用RPMI1640培養(yǎng)液配成300 g/ml濃度用于實(shí)驗(yàn) ，新生小牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品，RPM

6、I1640培養(yǎng)基為日本株式會(huì)社產(chǎn)品，胰蛋白酶為美國(guó)DIFCO公司產(chǎn)品，膠原酶為美國(guó)SIGMA化學(xué)公司產(chǎn)品。SOD、MDA試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3 儀器 超凈工作臺(tái)為北京昌平長(zhǎng)城凈化設(shè)備廠產(chǎn)品，日本PC23232E型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，日本OLYMPUS倒置顯微鏡， 日本JEM1200EX型透射電鏡,日本OLYMPUS萬(wàn)能顯微鏡,芬蘭MK3酶標(biāo)儀,德國(guó)ZK15超低溫高速離心機(jī),北京天地百年科技有限公司TD2000真彩色病理細(xì)胞顯微分析系統(tǒng)。1.4 方法取日齡15 d的Wistar系大鼠乳鼠，無(wú)菌條件下取肝臟，磷酸緩沖液中去漿膜，切成小塊，放入0.5 g/

7、L膠原酶和0.6 g/L胰蛋白酶等量混合液內(nèi)冷消化，經(jīng)離心制成細(xì)胞懸液，接種于含有200 g/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)，原代單層培養(yǎng)34 d，取生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)瓶40瓶分為4組。正常對(duì)照組每隔3 d更換培養(yǎng)基；模型對(duì)照組加入8 g/L D半乳糖 ；藥物對(duì)照組加入8 g/L D半乳糖+300g/ml人參皂苷；實(shí)驗(yàn)組加入8 g/L D半乳糖+500 g/ml 悅肝膠囊。作用24 h后，模型對(duì)照組換接種培養(yǎng)基；藥物對(duì)照組換加有300 g/ml人參皂苷的培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)組換加有 500 g/ml悅肝膠囊的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 1.5 細(xì)胞化學(xué)觀察取生長(zhǎng)蓋玻片，顯示SDH、ACPase。SDH顯示采用

8、亞鐵氰化甲法；ACPase顯示采用Gomori法；染色后用日本OLYMPUS萬(wàn)能顯微鏡觀察拍片并利用病理顯微分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析（每組隨機(jī)選4張蓋玻片，每張蓋玻片再隨機(jī)選3個(gè)視野，在400×下，測(cè)定每個(gè)視野顆粒面積百分比）。1.6 電鏡標(biāo)本觀察 取生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)瓶，按電鏡標(biāo)本制作常規(guī)方法制作標(biāo)本，JEM1200EX型透射電鏡觀察并拍片。1.7 生化測(cè)定SOD活性按黃嘌呤氧化酶法；MDA含量按硫代巴比妥酸法1。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以 ±s表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。2 結(jié)果2.1 超微結(jié)構(gòu) 正常組肝細(xì)胞核圓，核仁明顯，核膜清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常成群分布

9、于核周及線粒體周圍，呈平行排列。線粒體結(jié)構(gòu)正常。模型組線粒體腫脹變性、嵴消失，溶酶體增多。悅肝膠囊組仍有少數(shù)線粒體腫脹、變性改變，但程度較模型組明顯減輕。2.2 組織化學(xué)2.2.1 琥珀酸脫氫酶（SDH）染色結(jié)果SDH活性在光鏡下顯示為紫藍(lán)色顆粒。正常組SDH活性強(qiáng)，顆粒多，染色深。模型組SDH活性減弱，紫藍(lán)色顆粒減少，染色淺。藥物對(duì)照組及藥物組SDH活性均較模型組增強(qiáng)，顆粒多，染色深。2.2.2 酸性磷酸酶（ACP）染色結(jié)果ACP活性呈棕黑色沉淀。正常組ACP活性弱，酶顆粒染色較淺，均勻一致。模型組ACP活性增強(qiáng)，顆粒多，染色深。藥物對(duì)照組與藥物組ACP活性均減弱，顆粒染色較淺。結(jié)果見表1。

10、表1 各組肝細(xì)胞細(xì)胞化學(xué)染色酶顆粒定量分析結(jié)果（略）與正常組比較，#P0.01；與模型組比較，* P0.01；n=122.3 生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表2。表2 各組肝細(xì)胞SOD、MDA的影響（略）與正常組比較，*P0.01；與模型組比較，#P0.01；n=123 討論 衰老“代謝失調(diào)學(xué)說”是目前被公認(rèn)的一種衰老學(xué)說，據(jù)此有人研究出D半乳糖亞急性衰老模型。D半乳糖亞急性衰老模型的形成機(jī)理是在一定時(shí)間內(nèi)給動(dòng)物連續(xù)注射D半乳糖，使細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，其在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，這種物質(zhì)不能進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，從而影響細(xì)胞正常滲透壓，使細(xì)胞腫脹，膜結(jié)構(gòu)和生理功能紊亂，最終導(dǎo)致衰老的發(fā)生。

11、此模型是當(dāng)前抗衰老研究的較好模型，因此，本實(shí)驗(yàn)亦選用此方法制作了衰老大鼠肝細(xì)胞模型。線粒體是細(xì)胞的能量代謝中心。已有許多研究報(bào)道，衰老時(shí)線粒體發(fā)生腫脹、變性、數(shù)量減少等一系列退行性改變，因此，線粒體被認(rèn)為在細(xì)胞衰老過程中具有重要的作用2。琥珀酸脫氫酶（SDH）是在檸檬酸循環(huán)中，催化琥珀酸與延胡索酸之間反應(yīng)的一種酶。它存在于所有有氧呼吸細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜，是線粒體內(nèi)膜的標(biāo)志酶。SDH活性的變化與線粒體損傷同時(shí)出現(xiàn)，與線粒體的數(shù)目平行升降。因此，SDH可代表線粒體能量代謝，SDH的活性變化可作為線粒體損傷程度檢測(cè)的敏感指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中觀察到衰老模型組與正常組相比，肝細(xì)胞內(nèi)SDH活性明顯降低；而給藥

12、組與衰老模型組相比，肝細(xì)胞內(nèi)SDH活性明顯增強(qiáng)。這一結(jié)果表明衰老時(shí)較多線粒體的變性、壞死導(dǎo)致SDH活性降低，使細(xì)胞能量供應(yīng)不足，從而影響肝的功能;悅肝膠囊可以減少線粒體的變性壞死，提高SDH活性，促進(jìn)細(xì)胞能量代謝，增強(qiáng)細(xì)胞有氧呼吸，延緩肝細(xì)胞的衰老進(jìn)程。酸性磷酸酶（ACP）主要存在于溶酶體內(nèi)，是溶酶體的標(biāo)志酶，研究表明肝細(xì)胞衰老、死亡時(shí)溶酶體膜脆性及通透性增強(qiáng)，致使溶酶體內(nèi)ACP等水解酶滲入胞質(zhì)，從而加速細(xì)胞的變性、壞死過程3，4。本實(shí)驗(yàn)中觀察到衰老模型組與正常組相比，肝細(xì)胞內(nèi)ACP活性明顯升高；而給藥組與衰老模型組相比，肝細(xì)胞內(nèi)ACP活性明顯降低。說明悅肝膠囊可能降低了溶酶體膜的脆性及通透性

13、，阻止溶酶體內(nèi)ACP等酸性水解酶的釋放，使肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境趨于穩(wěn)定，減少了肝細(xì)胞的損傷。超氧化物歧化酶（SOD）作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，它能使超氧化物陰離子自由基變?yōu)檫^氧化氫和氧離子，從而減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使機(jī)體細(xì)胞和組織免受損傷。當(dāng)機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡時(shí)就會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，最終形成過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物之一是丙二醛（MDA）,因此通過測(cè)定MDA可以間接反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生和老化程度5。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：衰老模型組與正常組、悅肝膠囊組相比較SOD活性、MDA含量均有顯著差異，P0.05。說明D半乳糖所致的肝損傷中有大量自由基產(chǎn)生，悅肝膠囊能使衰老小鼠肝細(xì)胞SOD活性增強(qiáng)、MDA含量降低，這可能與悅肝膠囊的抗氧化作用有關(guān)。總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，悅肝膠囊對(duì)D半乳糖損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。，其機(jī)理可能是悅肝膠囊阻止脂質(zhì)過氧化，以保護(hù)肝細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)不被破壞，阻止了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的損傷，其確切的作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1 陳嘯梅.組織化學(xué)M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：224 .2 李質(zhì)馨，朱辛為，徐 冶，等.胎腦提取液對(duì)衰老小鼠肝細(xì)胞