畢業(yè)論文模板1內(nèi)容

1、畢業(yè)論文題 目學 院生命科學與工程學院專業(yè)班級食工學生姓名指導教師成 績2009 年6月 20 日摘 要雞蛋是比較理想的全價蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與人體蛋白質(zhì)組成結(jié)構(gòu)相似，生物學價值高，但由于一些行業(yè)的特殊需求，蛋黃的需求量較大，在生產(chǎn)過程中，蛋清沒有得到很好地利用，既造成了蛋清資源的極大浪費，又造成了環(huán)境的污染。酶法水解蛋清蛋白質(zhì)制備活性肽能有效地利用我國豐富的蛋清資源，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟和社會效益。本論文以雞蛋清為原料，研究了酶法水解雞蛋白蛋白的工藝條件。通過篩酶實驗，以水解度、抗氧化性為指標，篩選出酶解蛋清蛋白的最佳酶是復合蛋白酶（動物酶龐博公司），通過單因素實驗和正交實驗得出復合蛋白酶（動物酶）

2、酶解蛋清的最佳條件是：pH=8.5、溫度=50、s=3%、E/S=4/100、T=5h。關鍵詞：雞蛋白蛋白；蛋白酶；水解；多肽；水解度；抗氧化性AbstractEggs is the full price of a good protein.Its structure and composition is similar to human proteins and the biological value is high. but because of eating habits and some of the special needs of some industries, the dem

3、and for large egg yolk, the egg white has been discarded as wastein the production process , causing a great waste of the egg white resources and caused environmental pollution. Preparation of enzymatic hydrolysis of egg white protein peptides are effective in the using of egg white rich resources i

4、n China which will have a huge economic and social benefitsIn this paper, egg for raw materials to study the enzymatic hydrolysis of egg albumin conditions. Enzyme experiments through sieve to yield peptide hydrolysis, the antioxidant enzyme selected as an index of the best egg white protease enzyme

5、 is a compound (animal enzymes), by single factor experiments and orthogonal test compound derived protease (animal enzyme ) the best conditions for hydrolysis of egg white are：pH = 8.5, temperature = 50 , s = 3%, E / S = 4 / 100, T = 5hKey words: egg albumin; protease; hydrolysis; peptide; degree o

6、f hydrolysis; antioxidant目 錄摘 要IAbstractII第一章 緒 論11.1 雞蛋清蛋白概況11.1.1 雞蛋11.1.2 蛋白質(zhì)種類與含量11.1.3 蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值31.2 蛋清的研究現(xiàn)狀3傳統(tǒng)的理化加工法與蛋清產(chǎn)品53微生物發(fā)酵與蛋清產(chǎn)品4蛋清的冷殺菌技術41.2.4 蛋清酶水解物41.3 本課題的研究目的及意義41.4 本課題的主要研究內(nèi)容5第二章 實驗材料與方法62.1 主要實驗材料62.1.1 實驗材料與試劑62.1.2 實驗儀器與設備62.1.3 主要試劑的配制72.2 檢測方法92.2.1 蛋白酶活力測定法福林法1192.2.2 蛋白質(zhì)含量測定法福

7、林-酚法12102.2.3 水解度測定法茚三酮比色法13112.2.4 抗氧化性的測定方法鄰苯三酚自氧化法14122.3 實驗方法122.3.1 工藝流程12蛋清蛋白水解酶的篩選122.3.3 單因素實驗142.3.4 確定蛋清蛋白酶解的最佳工藝條件15第三章 實驗結(jié)果與討論163.1 七種酶活力測定實驗163.1.1 標準曲線的繪制163.1.2 酶活力測定結(jié)果163.2 蛋清蛋白水解酶的篩選173.2.2 以原蛋清液為原料的蛋白水解酶的篩選173.2.3 以堿處理蛋清液為原料的蛋白水解酶的篩選193.3 復合蛋白酶（龐博公司）水解蛋清蛋白工藝條件的研究23正交實驗確定復合蛋白酶（龐博公司）

8、水解蛋清蛋白的最佳工藝條件30第四章 結(jié) 論33參考文獻34致 謝35第一章緒論雞蛋清蛋白概況1.1.1雞蛋雞蛋的構(gòu)成中，蛋殼(包括殼膜)約占9.5%，蛋白約占63%、蛋黃約占27.5%。雞蛋的主要成分為水(75%)、蛋白質(zhì)(12%)、脂質(zhì)(12%)以及碳水化合物和礦物質(zhì)。雞蛋三個組成部分的主要化學組成見表1-11。雞蛋是人類豐富而平衡的膳食營養(yǎng)來源，它富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、鐵、磷、維生B1，B2，B6，B12，D，E，K和微量礦物質(zhì)1。雞蛋對人體有重要的營養(yǎng)和防治疾病作用。雞蛋中的蛋白質(zhì)對肝臟組織損傷有修復作用，可促進肝細胞的再生，食用雞蛋保護肝臟的功能；雞蛋中的-3脂肪酸被認為能預防心率失常

9、，增強免疫力，增進人類大腦功能和視覺靈敏所必需的一種營養(yǎng)物；膽堿在促進大腦發(fā)育,維持正能和預防癌癥方面有重要作用，卵磷脂的吸收可增加血漿和大腦的膽堿含量；維生素B2起到維持人體正常糖代謝、脂肪代謝的作用分解和氧化人體內(nèi)的致癌物質(zhì)，降低腦卒中、急性心肌梗死和猝死等心腦血管病發(fā)生率2；雞蛋中的微量元素，如硒、鋅等也都具有防癌作用。目前研究者已從蛋黃中已經(jīng)提取了卵磷脂、甘油三酯、腦甘脂、膽固醇和卵黃素等生物活性提高了雞蛋的利用價值，但蛋清的受重視程度還遠遠不夠，甚至被作為廢料棄掉費了寶貴的蛋白質(zhì)資源，又污染了環(huán)境，因此有必要對蛋清進行開發(fā)研究。表1-1雞蛋的化學組成部分蛋白質(zhì)脂類碳水化合礦物質(zhì)蛋殼-

10、蛋清蛋黃1.1 蛋白質(zhì)種類與含量蛋清中的蛋白質(zhì)含量約為9.7%10.6%，其蛋白質(zhì)總含量占了雞蛋蛋白總量的90%以上。蛋清中含有20多種蛋白質(zhì)，且絕大多數(shù)為糖蛋白，少數(shù)為磷糖蛋白。蛋清中一些主要蛋白質(zhì)的含量及理化特性等見表1-2。卵清蛋白是蛋清中主要的蛋白質(zhì)之一，占蛋清蛋白質(zhì)的54%，由于它含碳水化合物，歸類為磷糖蛋白，是蛋清中唯一含游離巰基的蛋白質(zhì)，每個卵清蛋白分子含有4個巰基，并有一個雙硫基團，是蛋清凝固和膠凝性質(zhì)的主要因子。表1-2雞蛋清中一些主要蛋白質(zhì)的含量和理化特性3蛋白質(zhì)名稱相對含量（%） PIa 相對分子質(zhì)量 T（）生物學特性卵清蛋白 54 4.5 45,000 84.0 含磷糖

11、蛋白卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白 12 6.1 76,000 61.0 結(jié)合金屬離子類卵粘蛋白 11 4.1 28,000 79.0 抑制胰蛋白酶卵粘蛋白 3.5 4.55.0 5.58.3×106 - Sialoprotein,粘性溶菌酶 3.4 10.7 14,300 75.0 溶解某些種類細菌球蛋白G2 4.0 5.5 3.04.5×104 92.5 -球蛋白G3 4.0 4.8 - - -卵抑制物 1.5 5.1 49,000 - 抑制絲氨酸蛋白酶卵糖蛋白 1.0 3.9 24,400 - -卵黃素蛋白 0.8 4.0 32,000 - 結(jié)合核黃素卵巨球蛋白 0.5 4.5 7.6

12、9.0×105 - 具有強烈抗原性抗生物素蛋白 0.05 10 68,300 85.0 結(jié)合生物素（維生素H）a等電點；T水或緩沖液中的變性溫度卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白占整個蛋清蛋白質(zhì)的13%，為糖蛋白，不含磷或巰基。卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白二價或者三價金屬離子緊密地結(jié)合，質(zhì)子磁共振研究表明卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白上的酪氨組氨酸和精氨酸殘基參與了金屬、陰離子的結(jié)合。在pH 6以上時，每摩爾蛋白分別與兩個Fe3+、Al3+、Cu2+、Zn2+形成穩(wěn)定的復合物。卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白與金屬離子復合物后對熱變性和水解具有耐受性4，卵轉(zhuǎn)鐵球蛋白在鐵傳遞方面有重要作用，抗菌活性。蛋清中溶菌酶（E.C.17）的含量在211.3）酶結(jié)構(gòu)不受影

13、響，在pH 47范圍內(nèi)100處理1 min仍有近100%的活力，在堿性環(huán)境條件下穩(wěn)定性稍差。溶菌酶常被作為研究模型來了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、動力學和分子折疊性質(zhì)。類卵粘蛋白有9個雙硫鍵，三個寡糖單位組成的碳水化合物組分通過天冬酰胺殘基與蛋白質(zhì)連接，因此熱穩(wěn)定性好。類卵粘蛋白抑制牛胰蛋白酶，它的二級結(jié)構(gòu)組成是26%的-螺旋，46%的-折疊和10%的-轉(zhuǎn)角，呈現(xiàn)高度有序性。卵抑制物與類卵粘蛋白相似，它抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和微生物來源的一些蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶抑制劑對硫醇蛋白酶（如無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶）、半胱氨酸蛋白酶（包括組織蛋白酶B、C、H和L，木瓜凝乳蛋白酶，番木瓜蛋白酶）都具有抑制作用

14、。半胱氨酸蛋白酶抑制劑與它抑制的蛋白酶形成穩(wěn)固的復合體，離解常數(shù)在10-810-12mol/L之間。半胱氨酸蛋白酶抑制劑非常穩(wěn)定，可以在pH 12和65加熱的條件下進行提取。圓二色性分析顯示二級結(jié)構(gòu)中有20%的-螺旋結(jié)構(gòu)，其他是-折疊和-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)?？股锼氐鞍资且环N糖蛋白，由4個相同的多肽亞基組成，能與生物素形成穩(wěn)定的不被腸道吸收的復合體?？股锼氐鞍椎拿總€亞基結(jié)合一個生物素，離解常數(shù)為10-15mol/L，抗生物素蛋白與生物素結(jié)合的極高的特異性、親和性是高靈敏性免疫測定和組織化學定位技術的基礎。卵巨球蛋白為糖蛋白，具有強抗原性，是蛋清蛋白質(zhì)中在免疫學上唯一具有廣譜交叉反應的成分。卵粘蛋白為一

15、種硫化糖蛋白，它是引起蛋清粘性的成分。卵糖蛋白是一種酸性糖蛋白，卵黃素蛋白能緊密結(jié)合核黃素，對它們的功能與生物學性質(zhì)還了解不多。1.1.3 蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值蛋白質(zhì)是動物(人)生存所必須的日糧組分，其在營養(yǎng)中的最基本功能是為機體供充足的必需氨基酸(Essneati!amni。acids，EAA)，而蛋白質(zhì)的品質(zhì)(營養(yǎng)價值)依賴蛋白質(zhì)分子中所含的氨基酸種類和含量以及消化、吸收后特殊氨基酸的生理利用。研究究發(fā)現(xiàn)，雞蛋清蛋白含有動物(人)所需的各種EAA，且含硫氨基酸所占比例較，是所有動植物蛋白質(zhì)中氨基酸最平衡、營養(yǎng)價值最高的一種蛋白源，并常用作評1.01711，21，均為所有動植物蛋白之最，其中雞蛋清

16、蛋白的BV(93.7%)遠高于牛乳(54.5%)、魚(76%)、牛肉(74.3%)和豬肉(74%)。1.2 蛋清的研究現(xiàn)狀如何采用一些合理的方法對雞蛋進行加工后再利用是目前蛋品研究者和生產(chǎn)者普遍關心的問題。Stdaelmnna(1999)指出，在合理價格條件下深加工并消費蛋是目前蛋消耗量逐年增加的一個重要原因。隨著加工技術和生產(chǎn)工藝的改進與創(chuàng)新，加工蛋品在總蛋消費中所占比例逐年增加，加工深度與技術含量也不斷提高。到目前為止，主要有3種蛋清深加工方法，即傳統(tǒng)的理化加工法、微生物發(fā)酵法以及蛋白酶體外酶解法。傳統(tǒng)的理化加工法與蛋清產(chǎn)品5采用一些較傳統(tǒng)的物理、化學方法或兩者相結(jié)合加工雞蛋清，可制得大量

17、的蛋清產(chǎn)品。主要包括:加熱干燥生產(chǎn)蛋白片或蛋清粉，用于食品和化工生產(chǎn);通風或鞭打生產(chǎn)含空氣的輕質(zhì)蛋清產(chǎn)品，如蛋白與糖的混合物(meringues);采用一些方法(如乙醇沉淀)生產(chǎn)含低卵類粘蛋白但仍保持蛋清功能特性(如鞭打性(whippbaliiyt)、起泡性等)的蛋清產(chǎn)品，用作卵類粘蛋白過敏人群的食品；與其它一些物質(zhì)反應生產(chǎn)食用膠，用于醫(yī)藥與食品生產(chǎn)；直接從蛋清中提取一些生物活性蛋白如卵白蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等并用于營養(yǎng)、生物化學、分子生物學、醫(yī)藥和食等研究。微生物發(fā)酵與蛋清產(chǎn)品選用一些適宜的微生物對雞蛋清進行發(fā)酵，不僅可生產(chǎn)蛋清飲料，還可生產(chǎn)具有免疫調(diào)節(jié)作用的活化卵白蛋白。蒲萬霞等人研究

18、發(fā)現(xiàn)，小鼠口服經(jīng)酵母發(fā)酵雞蛋清制得的活化卵白蛋可促進其生長，提高小鼠抗感染能力和小鼠巨噬細胞的吞噬功能，顯著緩解(冷、熱)應激所致的小鼠淋巴器官(胸腺和脾臟)萎縮回，提高嗜中性粒細胞的吞噬和殺菌活性，增強紅細胞免疫功能，以及促進脾淋巴細胞增殖。蛋清的冷殺菌技術在收購、運輸、儲藏雞蛋和分離蛋清的操作過程中，容易使液體蛋清污染沙門氏菌、大腸桿菌等有害細菌，引起食源性疾病的發(fā)生。因此必須在連續(xù)監(jiān)控下生產(chǎn)液體蛋清，并在上市前殺菌。目前最常用的殺菌方法是巴氏殺菌，即加熱一定時間使細菌失活。但是即使輕微的熱處理也會引起蛋清起泡、乳化、膠凝功能性質(zhì)的損失和改變，進而降低產(chǎn)品的質(zhì)量。冷殺菌技術是一種新技術,既

19、能殺滅食品中微生物，又能最大限度保持食品色澤、香味、營養(yǎng)成分及功能性質(zhì)。冷殺菌技術包括超高壓殺菌、高壓脈沖電場殺菌、脈沖強光殺菌、臭氧殺菌、膜分離殺菌、紫外線殺菌等。 蛋清酶水解物蛋清蛋白經(jīng)過蛋白酶水解后，分子量降低，原來蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)得到改善，蛋白質(zhì)的致敏性降低，更易于消化，并且水解物還具有抗高血壓、抗膽固醇等生物活性，這些優(yōu)點使得蛋清水解物研究得到人們的重視。金嫘5、宿哲然6、孟祥晨7研究了蛋清酶解的工藝條件，張英君研究了酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)8，劉靜波等研究了高F值寡肽酶解產(chǎn)物的制備方法9。Lee等用木瓜蛋白酶水解蛋清，得到的蛋清水解物的起泡能力和蛋糕體積指數(shù)都得到提高10。1.3 本課題

20、的研究目的及意義目前我國的禽蛋加工狀況是蛋品加工水平低、技術陳舊，有些產(chǎn)品不進行加工而直接上市銷售，在一定程度上降低了產(chǎn)品的銷售等級，產(chǎn)品的附加值低。雞蛋清經(jīng)適宜的蛋白酶酶解后，不僅可在一定程度上改善其功能特性(如溶解性、鞭打性、穩(wěn)定性等)，還可降低過敏原性蛋白的抗原性,進一步提高雞蛋清的食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值.過去數(shù)十年的大量研究表明，雞蛋中的蛋白質(zhì)和多肽在滿足基本的營養(yǎng)需求以外還發(fā)揮著多種不同的生物學功能?，F(xiàn)已認為雞蛋的蛋白質(zhì)具有一些生物學活性，包括新穎的抗菌活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗癌活性以及抗高血壓活性。這些都體現(xiàn)出雞蛋的蛋白質(zhì)在人類健康以及疾病的預防和治療中的重要作用。繼續(xù)研究雞蛋中蛋白質(zhì)及

21、其衍生的、新的以及已經(jīng)判明的生物學功能，有助于開發(fā)出新的方法從而進一步提高雞蛋的利用價值，使其成為有益人類和動物健康的、具有廣泛生物活性物的來源，并探索其在治療及預防慢性傳染病中的重要作用。將蛋清進行酶解獲得具有生物活性的寡肽,具有十分重要的價值。本實驗以雞蛋蛋清為原料，研究了酶解雞蛋清的適宜條件以制備蛋清抗氧化活性肽。1.4 本課題的主要研究內(nèi)容本文的主要研究內(nèi)容有：1.測定各種酶的活力。用國際標準酶活力測定法測定了中性蛋白酶、堿性蛋白酶等七種酶的活力。2. 篩選適合水解蛋清蛋白的蛋白酶。通過探討影響蛋清蛋白水解物多肽得率、水解度、抗氧化性的因素，篩選出酶解蛋清蛋白的適宜蛋白酶。3.確定蛋清

22、蛋白水解物的制備工藝條件。設計單因素實驗和正交實驗，研究水解物多肽得率、水解度、抗氧化性，確定酶解雞蛋清的最佳工藝條件。第二章實驗材料與方法2.1 主要實驗材料實驗材料與試劑新鮮雞蛋 購自齊齊哈爾市大潤發(fā)超市堿性蛋白酶（novozymes）丹麥諾唯信公司中性蛋白酶（novozymes）丹麥諾唯信公司風味蛋白酶（novozymes）丹麥諾唯信公司復合蛋白酶（novozymes）丹麥諾唯信公司復合蛋白酶（動物酶）南寧龐博生物技術有限公司復合蛋白酶（FH-N-GA）南寧龐博生物技術有限公司堿性蛋白酶（十萬單位）南寧龐博生物技術有限公司分析純?nèi)纫宜崽旖蚴袆P通化學試劑有限公司分析純酒石酸鉀納天津市化學

23、試劑一廠分析純無水硫酸銅天津市凱通化學試劑有限公司分析純無水碳酸鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司分析純氫氧化納天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心分析純無水乙醇天津市凱通化學試劑有限公司茚三酮國藥集團化學試劑有限公司分析純濃鹽酸黑龍江省雙城市鑫田化學試劑制造有限公司三羥甲基氨基甲烷北京化學試劑公司磷酸氫二鈉西安化學試劑廠磷酸二氫鈉北京雙環(huán)化學試劑廠EDTA哈爾濱市金麗化工試劑有限公司實驗儀器與設備UV757CRT紫外可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司722可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司電熱恒溫水浴鍋上海躍進醫(yī)療器械廠指針式電熱恒溫水浴鍋上海躍進醫(yī)療器械廠電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司

24、TDL-5-A型低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠DF-集熱式磁力加熱攪拌器江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠電熱恒溫水浴鍋上海躍進醫(yī)療器械廠水浴恒溫震蕩器上海躍進醫(yī)療器械廠超聲脫氣儀上?？茖С晝x器有限公司分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司TU-1901雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司TDL-5-A型低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠LG10型高速臺式離心機北京醫(yī)用離心機廠電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠海爾冰箱 中國青島海爾有限公司2.1.3主要試劑的配制1.磷酸緩沖溶液(pH7.5)稱取磷酸氫二鈉(Na2H

25、PO412H2O) ，磷酸二氫鈉(NaH2PO42H2O) 混合，加水溶解并定容至500ml。2.稱取三氯乙酸，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。3.稱取無水碳酸鈉粉末，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。4.稱取固體氫氧化鈉2g，用蒸餾水溶解并定容至100ml。5.酪素溶液 稱取酪素，精確至，用少量0.1 mol/L10mlNaOH溶液潤濕后（若酸性蛋白酶則用濃乳酸2-3滴），在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，加入適量的pH7.2緩沖液定容至100ml，此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。6.L-酪氨酸標準溶液100g/ml105干燥至恒重的L-酪氨酸,精確至，用1mol/L鹽酸60

26、ml溶解后定容至100ml，即為1mg/ml酪氨酸標準溶液。b.吸取1mg/ml的酪氨酸標準溶液10.00ml，用0.1mol/L鹽酸定容至100ml，即得到100g/ml L-酪氨酸標準溶液。7.福林試劑的制備于2000ml磨口回流裝置中加入鎢酸鈉（Na2WO42H2O）100g、鉬酸鈉(Na2MoO42H2O)25g、 水700ml、85%磷酸50ml、濃鹽酸100ml，小火沸騰回流10h，取下回流冷卻器，在通風櫥中加入硫酸鋰(Li2SO4)50g、水50ml和數(shù)滴濃溴水(99%),在微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有綠色需再加溴水，再煮沸出去過量的溴），冷卻，加水定容至1000ml

27、?；靹?，過濾。制得的試劑應呈金黃色，貯存于棕色瓶內(nèi)。使用溶液:一份福林試劑與一份水混合，搖勻。8.福林-酚甲液a稱取無水碳酸鈉粉末，溶于50ml0.1 mol/LNaOH溶液配制成B液。此溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。b稱取硫酸銅，用蒸餾水定容至100ml，即得到1%的硫酸銅溶液。c稱取酒石酸鉀納，用蒸餾水定容至100ml，即得到2%的酒石酸鉀納溶液。等體積混合1%的硫酸銅溶液和2%的酒石酸鉀納溶液，移取1ml于B液中，即得到福林-酚甲液。9.茚三酮顯色劑稱取茚三酮，果糖、Na2HPO4·10H2O10g及KH2PO46g，用蒸餾水定容至100ml。10.乙醇溶液量取40ml無水乙醇，加入60ml

28、蒸餾水混合，即得到40%乙醇溶液。cl，倒入裝有半瓶水的500ml試劑瓶中，加蒸餾水稀釋定容至500ml，充分搖勻。12. Tris-Hcl緩沖液（PH=8.2）量取50ml0.1mol/l三甲基氨甲烷溶液，加入22.9ml0.1mol/l鹽酸，用蒸餾水定容至100ml。13.三甲基氨甲烷溶液稱取三甲基氨甲烷溶液，用蒸餾水定容至50ml。14.鄰苯三酚溶液稱取焦性沒食子，用10mmol/lHCL定容至100ml。15.亞油酸儲備液量取15ul亞油酸溶于50ml0.2mol/l磷酸鹽緩沖液中，10000r/min均質(zhì)10min，使溶液呈乳白色，0保存，24小時內(nèi)使用。16.FeCl2-EDTA溶

29、液稱取lFecl2，EDTA用蒸餾水定容至1000ml。17.乙醇(含0.3mol/LHCL) 溶液量取75ml無水乙醇，cl25ml，即得到75%乙醇溶液(含0.3mol/LHCL)。18. FeCl2溶液稱取lFecl2用蒸餾水定容至500ml。19.硫氰酸鉀溶液稱取40g硫氰酸鉀, 用蒸餾水定容至100ml，即得到40%硫氰酸鉀溶液。檢測方法2.2.1蛋白酶活力測定法福林法11（1）原理蛋白酶在一定的溫度與pH條件下，水解酪素底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在堿性條件下，將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍與鎢藍，用分光光度計測定，計算酶活力。（2）測定步驟標準曲線

30、的繪制按表2-1配制不同濃度的酪氨酸溶液表2-1 a.L-酪氨酸標準溶液管號酪氨酸標準溶液的濃度/g/ml取100g/ml酪氨酸標準溶液的體積/ml取水的體積/ml0010102820463064408250100b.分別取上述溶液各1.00ml（須做平行樣，23個），各加0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00ml，福林試劑使用液1.00ml，置于40±0.2水浴中顯色20min，取出，用分光光度計于波長660nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管為空白，分別測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，酪氨酸的濃度C為橫坐標，繪制標準曲線（此線應通過零點）。測定各種酶活力取15×100m

31、m試管3支，編號1、2、3，每管內(nèi)加入樣品稀釋液1ml，置于40水浴中預熱2min，再加入經(jīng)同樣預熱的酪蛋白1ml，精確保溫10 min后加入2.0 mL的4%三氯乙酸溶液終止反應，在40水浴鍋中靜置20 min后過濾。取1.0 mL濾過液，依次加入5.0 mL的0.4 mol/L Na2CO3溶液，1.0 mL已稀釋的福林試劑，混合后于40水浴中靜置20 min。在660 nm波長下以空白管做參比測定吸光度?？瞻坠茉诩尤肜业鞍兹芤汉偷扒迦芤汉?，先加入三氯乙酸溶液再加入酶溶液。實驗重復3次，數(shù)據(jù)取平均值。酶活的計算如下：在40下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1ug酪氨酸，定義為1個酶活力單位。 樣品蛋白

32、酶活力單位（干基）=樣品蛋白酶活力單位= 式中，A 由樣品測得的OD值，查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)（或OD值×K）；4 4ml反應液取出1ml測定（即4倍）；N 酶液稀釋的倍數(shù)；10 反應10min；W 樣品水分含量；K吸光常數(shù)；2.2.2 蛋白質(zhì)含量測定法福林-酚法12用福林-酚法測定試樣中的蛋白質(zhì)濃度。1.標準曲線的繪制按表2-2配制不同濃度的酪蛋白標準溶液表2-2酪蛋白酸標準溶液管號酪氨酸標準溶液的濃度g/ml取200g/ml酪氨酸標準溶液的體積ml取水的體積ml001.0400.20.8800.40.61200.60.41600.80.22001.00上表酪蛋白標準溶液與

33、3 mL福林-酚甲液混合均勻，在25水浴鍋中靜置10 min。再加入0.3 mL 1 mol/L福林-酚乙液迅速混合，在25水浴鍋中靜置30 min后,以介質(zhì)溶液調(diào)零，在750 nm下，以不含酪蛋白的0管為空白，分別測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，酪蛋白的濃度C為橫坐標，繪制標準曲線（此線應通過零點）。2.樣品處理取水解液6ml，沸水浴滅酶10min后，加入4%三氯乙酸2ml沉淀30min，然后4000r/min離心10min，取上清液1ml稀釋50倍測蛋白質(zhì)含量。 3.樣品蛋白質(zhì)的測定福林-酚法131 mL樣品稀釋液與3 mL福林-酚甲液混合均勻，在25水浴鍋中靜置10 min。再加入0.3

34、 mL 1 mol/L福林-酚乙液迅速混合，在25水浴鍋中靜置30 min后, 在750 nm下，以介質(zhì)溶液調(diào)零，以不含酪蛋白的0管為空白，測定吸光度，根據(jù)作圖或回歸方程，與蛋白質(zhì)標準液作對照，求出樣品的蛋白質(zhì)的含量。本法在060mg/L蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好線性關系。利用標準曲線回歸方程計算樣液中多肽含量。水解度測定法茚三酮比色法13(1)標準曲線的繪制取干燥過的甘氨酸溶解后定容至100ml，取出2.00ml定容至100ml得20g/ml的溶液。取此液再分別稀釋成含量為2-20g/ml的溶液用于標準曲線繪制。取2.00ml測定用稀釋液于試管中加入1.00ml顯色劑，混勻后沸水浴中加熱15min，

35、同時作空白試驗;然后冷水冷卻，加入5.00ml40%乙醇溶液混勻，放置15min后用1cm比色杯，以空白管調(diào)零于570nm處測定A值。以吸光度A為縱坐標，甘氨酸濃度C為橫坐標，繪制標準曲線（此線應通過零點）。表2-3 甘氨酸標準溶液管號 甘氨酸標準溶液的含量/g 取顯色劑的體積/ml0 0 11 4 12 8 13 12 14 16 15 20 16 24 1樣液中一NH2基的測定：取樣液2.0ml定容至100ml，取ml稀釋液于試管中并加入1.0ml蒸餾水、1.00ml顯色劑，混勻后置沸水浴中加熱15min.同時作空白試驗。以后操作同標準曲線。利用標準曲線計算樣液中一NH2的含量(mol/m

36、l)。（甘氨酸的分子量為/mol）2.2.4 抗氧化性的測定方法鄰苯三酚自氧化法14多肽中具有抗氧化活性的物質(zhì)。鄰苯三酚自氧化法是測定SOD（超氧化物歧化酶）活性的常用的方法.采用3ml體系對各組分進行鄰苯三酚自氧化的測定。取0.1ml樣品溶液，加入0.1mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）2.8ml，25保溫10min，然后加入3mmol/L鄰苯三酚（10mmol/L HCl）0.1mL混勻，開始記時，每隔30s讀取A320,5min后結(jié)束。對照管以加蒸餾水0.1ml代替0.1ml樣品溶液。作吸光度隨時間變化的加回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V，計算樣品對超氧陰離子自由基的

37、抑制率見下式：式中 V對照-表示對照組鄰苯三酚自氧化速率V樣品-表示樣品組鄰苯三酚自氧化速率實驗方法 工藝流程新鮮雞蛋攪打調(diào)配熱處理加酶酶解恒溫磁力攪拌2h取樣6ml沸水?。ɑ蛘{(diào)pH）滅酶10min操作要點：1攪打：從新鮮雞蛋中分離出蛋清，用10000r/min高剪切10min。2 調(diào)配：吸取25ml蛋清液，加入50ml蒸餾水，配制成4%的蛋清液。3 熱處理：用2mol/lNaOH溶液調(diào)pH=10.00,85水浴靜置30min。4 滅酶：測蛋白質(zhì)含量時，沸水浴滅酶后加入三氯乙酸沉淀30min；測水解度和抗氧化性用2 mol/L HCl調(diào)pH=2.0滅酶，不需加三氯乙酸沉淀。2.3.2蛋清蛋白水

38、解酶的篩選1. 以原蛋清液為原料的蛋白水解酶的篩選從新鮮雞蛋中分離出蛋清,以100000r/min高剪切10min，量取攪拌均勻的蛋清液25ml，加入50ml蒸餾水，配制成4%的蛋清水解溶液。分別加入風味蛋白酶（novozymes）、堿性蛋白酶（novozymes）、復合蛋白酶（novozymes）、復合蛋白酶（動物酶南寧龐博公司）、復合蛋白酶（南寧龐博公司）、堿性蛋白酶（南寧龐博公司）各，適宜條件下（見表2-4）恒溫磁力攪拌2h，在水解過程中連續(xù)滴加2 mol/L的NaOH維持pH恒定，記錄耗堿量，再分別在水解10min，20min，40min，60min，120min時取水解液6ml滅酶。

39、（1）測蛋白質(zhì)含量時沸水浴滅酶后加入三氯乙酸沉淀30min（2）測水解度和抗氧化性用2 mol/L Hcl調(diào)pH=2.0滅酶，不需加三氯乙酸沉淀。然后4000r/min離心10min。取上清液1ml稀釋50倍檢測。2. 以堿處理蛋清液為原料的蛋白水解酶的篩選1）從新鮮雞蛋中分離出蛋清，以100000r/min高剪切10min，吸取蛋清配制成4%的蛋清液，用2mol/lNaOH溶液調(diào)pH=10.00,85水浴靜置30min，分別加入風味蛋白酶（novozymes）、堿性蛋白酶（novozymes）、復合蛋白酶（novozymes）、復合蛋白酶（動物酶南寧龐博公司）、復合蛋白酶（南寧龐博公司）、堿

40、性蛋白酶（南寧龐博公司）各，適宜條件下恒溫磁力攪拌2h，在水解過程中連續(xù)滴加2 mol/L的NaOH維持pH恒定，記錄耗堿量，在水解60min時取水解液6ml滅酶。（1）測蛋白質(zhì)含量時沸水浴滅酶后加入三氯乙酸沉淀30min（2）測水解度和抗氧化性用2 mol/L Hcl調(diào)pH=2.0滅酶，不需加三氯乙酸沉淀。然后4000r/min離心10min。取上清液1ml稀釋50倍檢測。2）從新鮮雞蛋中分離出蛋清，以100000r/min高剪切10min，吸取蛋清配制成4%的蛋清液，用2mol/lNaOH溶液調(diào)pH=10.00,85水浴靜置30min，分別加入堿性蛋白酶（novozymes）復合蛋白酶（動

41、物酶南寧龐博公司）各，適宜條件下恒溫磁力攪拌2h，在水解過程中連續(xù)滴加2 mol/L的NaOH維持pH恒定，記錄耗堿量，再分別在水解10min，20min，40min，60min，120min時取水解液6ml滅酶。（1）測蛋白質(zhì)含量時沸水浴滅酶后加入三氯乙酸沉淀30min（2）測水解度和抗氧化性用2 mol/L Hcl調(diào)pH=2.0滅酶，不需加三氯乙酸沉淀。然后4000r/min離心10min。取上清液1ml稀釋50倍檢測。 蛋白質(zhì)含量測定法同，水解度測定法同2.2.2，抗氧化性的測定方法同2.2.3。表2-4 各種蛋白酶的性質(zhì)、水解條件商品酶名稱 酶性質(zhì)最適條件風味蛋白酶（novozymes

42、）外切酶 PH=6.0 T=45堿性蛋白酶（novozymes）內(nèi)切酶 PH=8.5 T=55中性蛋白酶（novozymes）內(nèi)切酶 PH=7.0 T=50復合蛋白酶（novozymes）內(nèi)切酶 PH=7.0 T=50復合蛋白酶（動物酶）PH=7.0 T=50復合蛋白酶（FH-N-GA）PH=7.0 T=50堿性蛋白酶（十萬單位）內(nèi)切酶 PH=8.5 T=55 單因素實驗1.單因素實驗設計如下： （1）pH值準確稱取天然蛋清，加入50ml蒸餾水，用2mol/lNaOH溶液85，加入酶，50水浴恒溫磁力攪拌酶解5h（酶解條件T=50、S= 4%、E/S= 1/100、t=2h不變，pH值分別為6

43、.0、7.0、8.0、8.5）。在水解過程中連續(xù)滴加2 mol/L的NaOH維持pH恒定，記錄耗堿量，水解5h時取水解液6ml滅酶。其后操作同操作步驟。（2）溫度 T準確稱取85水浴加熱30min 。冷卻至室溫，調(diào)pH分別為7.0，加入酶，分別置于4050、55、60、65水浴恒溫磁力攪拌酶解5h（酶解條件T=50、S= 4%、E/S= 1/100、t=2h不變，溫度T分別為40、45、50、55、60）。在水解過程中連續(xù)滴加2 mol/L的NaOH維持pH恒定，記錄耗堿量，水解5h時取水解液6ml滅酶。其后操作同操作步驟。（3）底物濃度S準確稱取85水浴加熱30min 。冷卻至室溫，調(diào)pH

44、7.0，加入酶，50水浴恒溫磁力攪拌酶解5h（酶解條件PH=7.0、T= 50、E/S= 1/100、t=2h不變，底物濃度S分別為4%、6%），在水解過程中連續(xù)滴加2 mol/L的NaOH維持pH恒定，記錄耗堿量，水解5h時取水解液6ml滅酶。其后操作同操作步驟。（4）E/S準確稱取85水浴加熱30min 。冷卻至室溫，調(diào)pH為7.0，分別加入0.09g、酶，50水浴恒溫磁力攪拌酶解5h（酶解條件pH=7.0、T= 50、 S= 4%、t=2h不變，E/S分別為1/25、1/50、1/100、1/150、1/200）在水解過程中連續(xù)滴加2 mol/L的NaOH維持pH恒定，記錄耗堿量，水解5

45、h時取水解液6ml滅酶。其后操作同操作步驟。（5）酶解時間準確稱取85水浴加熱30min 。冷卻至室溫，調(diào)pH為7.0，加入酶，50水浴分別恒溫磁力攪拌酶解20min、40min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h（酶解條件PH=7.0、T= 50、 S= 4%、t=2h不變，時間t分別為20min、40min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h）。在水解過程中連續(xù)滴加2 mol/L的NaOH維持pH恒定，記錄耗堿量，水解5h時取水解液6ml滅酶。其后操作同操作步驟。2.3.4確定蛋清蛋白酶解的最佳工藝條件在蛋清蛋白水解初步研究的基礎上，采用正交實驗確定最佳蛋清蛋白酶解

46、工藝條件。第三章實驗結(jié)果與討論3.1 七種酶活力測定實驗3.1.1 標準曲線的繪制1R201020406080100120酪氨酸濃度(ug/ml)OD值圖3-1 福林法標測酶活力標準曲線酶活力測定結(jié)果酶活力測定結(jié)果表3-1：表3-1七種酶活力商品酶名稱酶活風味蛋白酶（novozymes）7178IU/g堿性蛋白酶（novozymes）102511IU/g中性蛋白酶（novozymes）4511IU/g復合蛋白酶（novozymes）79511IU/g復合蛋白酶（動物酶）146511IU/g復合蛋白酶（FH-N-GA）19289IU/g堿性蛋白酶（十萬單位）51289IU/g3.2 蛋清蛋白水解

47、酶的篩選參考有關文獻3，在各種酶的適宜條件下，以多肽得率、水解度、抗氧化性為指標進行篩酶。 標準曲線的繪制1. 福林-酚法標準曲線見圖3-2圖3-2福林-酚法標測多肽標準曲線2. 茚三酮比色法標準曲線見圖3-3圖3-3 茚三酮比色法標準曲線3.以原蛋清液為原料的蛋白水解酶的篩選不同蛋白酶在其適宜條件下，對蛋清蛋白多肽得率、水解度、抗氧化性的影響，如圖3-4、3-5、3-6所示。由圖3-4可以看出，蛋清蛋白多肽得率隨著酶解時間的增加而增大，其中堿性蛋白酶（十萬單位）和復合蛋白酶（novozymes）的多肽得率最大。由圖3-5可以看出，蛋清蛋白水解度隨著酶解時間的增加而逐漸增大，最后趨于平衡，其中

48、堿性蛋白酶（十萬單位）和復合蛋白酶（novozymes）的水解度最大。由圖3-6可以看出，蛋清蛋白抗氧化性隨著酶解時間的增加而趨于平衡，其中復合蛋白酶（novozymes）的抗氧化性最大。以堿處理蛋清液為原料的蛋白水解酶的篩選 酶解時間為1h時, 不同蛋白酶在其適宜條件下對蛋清蛋白多肽得率、水解度、抗氧化性的影響,如下圖3-7、3-8、3-9、3-10所示。由圖3-7可以看出，不同蛋白酶在其適宜條件下酶解蛋清1h，其中堿性蛋白酶（十萬單位）的多肽得率最大。圖3-8 不同蛋白酶對蛋清蛋白水解度的影響0 246810121h時間DH%復合蛋白酶（novozymes)復合蛋白酶（龐博公司）復合蛋白酶

49、（動物酶龐博公司）風味蛋白酶（novozymes)堿性蛋白酶（novozymes)堿性蛋白酶（龐博公司）由圖3-8可以看出，不同蛋白酶在其適宜條件下酶解蛋清1h，其中堿性蛋白酶（novozymes）與復合蛋白酶（動物酶）的水解度最大。由圖3-9可以看出，不同蛋白酶在其適宜條件下酶解蛋清1h，其中堿性蛋白酶（novozymes）與復合蛋白酶（動物酶）的抗氧化性最大。由圖3-10可以看出，不同蛋白酶在其適宜條件下酶解蛋清1h，其中堿性蛋白酶（novozymes）與復合蛋白酶（動物酶）的抗氧化性最大。3. 堿性蛋白酶（novozymes）與復合蛋白酶（動物酶）在其適宜條件下，不同時間下，對蛋清蛋白多

50、肽得率、水解度、抗氧化性的影響,如下圖3-11、3-12、3-13所示。)圖3-11 不同蛋白酶對蛋清蛋白多肽的率的影響05 101520253035050100150200時間/min多肽得率/%復合蛋白酶（動物酶龐博公司堿性蛋白酶（novozymes)由圖3-11可以看出，不同蛋白酶在其適宜條件下酶解蛋清，蛋清蛋白多肽得率隨著酶解時間的增加而逐漸增大，復合蛋白酶（novozymes）作用后蛋清蛋白的多肽得率更大。由圖3-12可以看出，不同蛋白酶在其適宜條件下酶解蛋清蛋白，復合蛋白酶（novozymes）作用后蛋清蛋白的水解度更大。由圖3-13可以看出，不同蛋白酶在其適宜條件下酶解蛋清蛋白，

51、復合蛋白酶（動物酶）作用后蛋清蛋白的抗氧化性更大。故選擇國產(chǎn)復合蛋白酶（龐博公司）作為蛋清蛋白酶解的酶制劑。由于卵抑制物和類卵粘蛋白的抑制作用，蛋白酶直接作用于蛋清蛋白，酶解效果降低等。用pH=10，85處理30min后，蛋清蛋白抑制物失活變性，蛋白酶酶解效果大大提高。3.3 復合蛋白酶（龐博公司）水解蛋清蛋白工藝條件的研究3.3.1 pH值對蛋清蛋白水解效果的影響。pH值對蛋清蛋白多肽得率的影響,如下圖3-14所示由圖3-14可以看出，隨著pH值的增大，蛋清蛋白的多肽得率增大，當pH=8.5時，多肽得率最大。pH值對蛋清蛋白水解度的影響,如下圖3-13所示由圖3-15可以看出，隨著pH值的增大，蛋清蛋白的水解度增大，當pH=8.5時，水解度最大。pH值對蛋清蛋白抗氧化性的影響,如下圖3-16所示