皮膚保護與二核甘酸含量檢測

1、Skin-protecting dinucleotide examinedKarin Cucumel,ISP Global Skin Research Center,FranceRaid Domloge,ISP Global Skin Research Center,France文獻來源：Published January 2008 personal care翻譯：呂曉滕摘要 壓力作為我們生活中的一大要素正在變得越來越明顯，大量的數(shù)據(jù)表明壓力對人類皮膚的健康和老化有著直接的影響。壓力可能來自于環(huán)境污染，天氣狀況，吸煙，放射物，重金屬和紫外線等等。 在導(dǎo)致壓力的眾多因素中，紫外線是導(dǎo)致皮膚光老化

2、的主要誘因，這是由于紫外線能夠?qū)ζつw中的膠原，彈性蛋白，黑素細(xì)胞和皮膚的柵欄組織，并引起皮膚褶皺，松弛，不均勻的皮膚斑點，黑斑和皮膚干燥。因此，開發(fā)一種能夠?qū)蛊つw老化和和壓力的活性物質(zhì)便成為化妝品行業(yè)研究中的一個熱點。 位于法國安蒂波利斯地區(qū)的ISP全球皮膚研究中心曾經(jīng)開發(fā)了一種化妝品活性物質(zhì)，該物質(zhì)是通過生物技術(shù)的方法從一種生活在hypermineral湖中的鹵蟲體內(nèi)獲得的，當(dāng)環(huán)境變壞時，鹵蟲進入休眠狀態(tài)，在休眠狀態(tài)下鹵蟲能夠壓縮并加速形成一種至關(guān)重要的分子，GP4G，這是一種主要用于DNA保護的具有很高潛在勢能的物質(zhì)，同時也是一種儲能物質(zhì)。 當(dāng)環(huán)境條件適合時，鹵蟲就會從休眠中醒來并萌發(fā)，

3、然后進行一種不同于上述途徑的代謝過程。最終，GP4G轉(zhuǎn)變成為ATP。GP4G為鹵蟲的生命活動提供能量并保證鹵蟲的安全與進化，本研究的主要目的就是證明GP4G應(yīng)用于皮膚后能夠通過為肌膚提供能量的方式來保護DNA，對抗中波紫外線和皮膚老化以保證大部分的皮膚細(xì)胞出于一個良好的狀態(tài)。材料與方法 人類成纖維細(xì)胞由細(xì)胞培養(yǎng)獲得，皮膚外植體由整容外科獲得，然后，采用了一個確定皮膚組織的培養(yǎng)方案，HaCaT細(xì)胞株由美國菌種保藏中心獲得，人類成纖維細(xì)胞用鹵蟲提取物處理24小時，然后暴露在中波紫外光下，24小時后做一個MTT溴比色測試。 培養(yǎng)的皮膚樣品用標(biāo)準(zhǔn)的直接免疫熒光反應(yīng)的方法來檢測，用兔子的多克隆抗體抗-H

4、sp-70進行熱休克蛋白的研究，老鼠的抗-CD1a細(xì)胞進行朗格漢斯細(xì)胞染色檢測。 用12%的NuPAGE凝膠按照前面提到的方法進行免疫印跡實驗，兔子的抗膠原多克隆抗體抗體與小鼠的單克隆抗體通過TEBU購買。 彗星實驗（單細(xì)胞凝膠電泳）是一種能夠檢測單細(xì)胞中單鏈DNA或雙鏈DNA斷裂的短距敏感的微電泳技術(shù)，簡單地說，經(jīng)過處理以后，細(xì)胞最終進入了瓊脂糖凝膠并溶解在一種高鹽的去垢劑緩沖液中，在單細(xì)胞凝膠電泳之后，將DNA在堿性溶液中變性，然后用碘化丙啶處理。受損細(xì)胞內(nèi)的DNA會向正極移動，移動的速度與細(xì)胞碎片的數(shù)量呈正比，這樣就會在凝膠上面形成一道“彗星”。損害評估通過一個能夠幫助探測DAN損傷百分

5、比的軟件來進行。 在人類角質(zhì)細(xì)胞接收UVB100mj/cm2照射之前或之后的24h內(nèi)加入鹵蟲提取物，加入鹵蟲提取物24h之后采用原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL測試技術(shù)）進行檢測。 人類的HaCaT細(xì)胞通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA）技術(shù)進行檢測，HaCaT細(xì)胞在接受UVB照射24h后加入3%的鹵蟲提取物。并通過IL-1，IL-8和TMF-的水平來評估總細(xì)胞因子。細(xì)胞因子的水平用pg/mg蛋白表示。結(jié)果為了證明細(xì)胞的新陳代謝被激活，預(yù)先測定了纖維母細(xì)胞中的ATP含量。利用安瑪西亞公司的cAMP競爭性免疫測試系統(tǒng)，我們測得ATP的含量比本底水平上升了40%。 GP4G是ATP的前體物質(zhì)，并且也被證

6、明具有能夠提供能量的特征。在鹵蟲生長的環(huán)境中，當(dāng)周圍的環(huán)境適合時，鹵蟲從休眠狀態(tài)蘇醒，鹵蟲體內(nèi)的GP4G的含量迅速下降，而ATP的含量卻上升明顯。GP4G機制被認(rèn)為是一種能夠使鹵蟲在嚴(yán)酷環(huán)境中生存下來的原因。當(dāng)面臨嚴(yán)酷的環(huán)境時，鹵蟲體內(nèi)開始加速形成一種重要的分子-GP4G，其中含有典型的高能磷酸鍵。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在環(huán)境惡劣的條件下，GP4G是由一種能夠為ATP的形成提供能量的能量供體，儲存于ATP中的能量在環(huán)境適宜時釋放出來。因此，GP4G在別的生理條件或在人體細(xì)胞中，能夠激活c-AMP依賴的代謝途徑。表皮和真皮的再生 免疫染色和免疫印跡試驗發(fā)現(xiàn)，在HaCaT細(xì)胞中絲聚蛋白和角蛋白的含量都

7、有明顯的增加。這項研究顯示鹵蟲提取物能夠刺激絲聚蛋白的合成，并因此促進表皮的分化。同樣的，我們也證明了，在一些經(jīng)過纖維原處理的細(xì)胞中，真皮蛋白如纖連蛋白和膠原蛋白也有大幅的增長。GP4G能夠通過誘導(dǎo)絲聚蛋白和膠原蛋白的合成來提高皮膚的柵欄功能，不僅如此，GP4G通過誘導(dǎo)膠原蛋白和纖維原蛋白的合成，還發(fā)揮著細(xì)胞外基質(zhì)的作用。因此，GP4G同時為表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞提供保護。DNA的保護 為了證明GP4G對DNA的保護，在實驗中我們把角質(zhì)細(xì)胞放在UVB下照射，然后應(yīng)用TUNEL技術(shù)來探測并量化細(xì)胞凋亡。利用TUNEL技術(shù)原位檢測DNA碎片顯示，在照射前或照射后加入鹵蟲提取物的細(xì)胞中，由UVB引發(fā)的細(xì)

8、胞凋亡降低了35%，另外，在紫外照射之前或之后加入鹵蟲提取物，可以使DNA的保護率上升至45%，這個實驗結(jié)果很有意思，并且我們可以拿該實驗的結(jié)果與GP4G在鹵蟲體內(nèi)的生物學(xué)作用相比較，事實上，鹵蟲加速體內(nèi)GP4G的合成，主要是因為GP4G能夠抵御各種嚴(yán)酷的環(huán)境，并保護其DNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性。抵御UVB的傷害 前面的實驗顯示，鹵蟲提取物能夠保護DNA免受UVB的傷害，基于這樣一個結(jié)果，我們研究了GP4G對暴露在UVB照射之下的細(xì)胞的作用。實驗的研究對象是人類皮膚中的纖維母細(xì)胞。首先，細(xì)胞經(jīng)過鹵蟲提取物的預(yù)處理，并證明其生命力提高了20%，在實驗的第二個階段，對培養(yǎng)的纖維母細(xì)胞進行彗星試驗檢

9、測，并且證明無論是用低劑量的UVB（30mJ）處理，還是高劑量的UVB（60mJ和100mJ）處理，經(jīng)過鹵蟲提取物處理的細(xì)胞中的DNA所受到的傷害都要比未處理的低（見圖表1）。 這個實驗最終被暴露在高劑量UVB下體外皮膚研究證實，事實上，經(jīng)過（鹵蟲提取物）處理的皮膚較好的保持了他們的結(jié)構(gòu)，并且受到UVB的損傷也比較輕（如：很少出現(xiàn)被陽光灼傷的細(xì)胞）。另外，CD1a免疫染色的朗格漢斯細(xì)胞顯示，經(jīng)過（鹵蟲提取物）處理的皮膚細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出數(shù)量的下降，也沒有分布在朗格漢斯細(xì)胞中，然而，對照組的皮膚卻出現(xiàn)朗格漢斯細(xì)胞大幅下降的現(xiàn)象，并且還出現(xiàn)了細(xì)胞往真皮遷移的現(xiàn)象，這是UV輻射引起免疫抑制的標(biāo)志。 以

10、上的所有實驗都證明GP4G具有能夠幫助細(xì)胞抵御UV輻射的巨大作用。提高抵御壓力的能力本研究的母的GP4G在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外都具有抵御各種壓力（如耐熱性）的能力。將人類的纖維母細(xì)胞在添加了二核甘酸磷酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)的細(xì)胞47培養(yǎng)1h。再將活細(xì)胞MTT染色。而在另外一個實驗中，人類皮膚細(xì)胞的外植體分為用鹵蟲提取物處理的實驗組和用奶油處理的對照組，然后將實驗組和對照組都轉(zhuǎn)移到37這樣一個應(yīng)力溫度下復(fù)蘇24h。研究表明，經(jīng)過（鹵蟲提取物）處理的細(xì)胞熱休克的回復(fù)率比未經(jīng)處理的要高。在蘇木精-伊紅染色中，經(jīng)過（鹵蟲提取物）處理的細(xì)胞跟對照組的細(xì)胞相比對酷熱的環(huán)境具有更強的抵抗力。 與對照組的皮膚

11、細(xì)胞相比，在酷熱的環(huán)境中，經(jīng)過處理的皮膚細(xì)胞表現(xiàn)出更強的維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的能力，并且受到的熱傷害更輕。其他研究如果說GP4G對鹵蟲本身的細(xì)胞有作用還是可以解釋的話，那GP4G對人類皮膚細(xì)胞有益，這又該怎么解釋呢？現(xiàn)在已經(jīng)證明GP4G能夠刺激角質(zhì)蛋白和絲蛋白的產(chǎn)生，那這又有一個問題，在GP4G發(fā)揮保護作用的時候，他還能刺激其他蛋白的產(chǎn)生嗎？ 我們將關(guān)注的焦點放在熱激蛋白上面，這是一種能夠保護細(xì)胞免受各種嚴(yán)酷環(huán)境傷害的分子伴侶。簡單地說，熱激蛋白（HSPs）與壓力和非壓力條件下的多種生理功能有關(guān)，能夠增強在這種機制中起重要作用的各種蛋白的作用。HSPs包括了HSP70的兩種類型。在生理條件下，HS

12、P70對蛋白的折疊與組裝，以及細(xì)胞的發(fā)育和分化起著重要作用，而在壓力條件下，HSP70結(jié)合在作為“分子伴侶”結(jié)合在未折疊和去折疊的蛋白分子上。 本研究的主要目的是通過免疫染色的方法評估在人類的皮膚樣本和皮膚細(xì)胞中HSP70的表達情況。并且還檢測了人類皮膚細(xì)胞中HSP70的信使RNA含量。（結(jié)果證明）無論是在角質(zhì)細(xì)胞還是在纖維母細(xì)胞中，GP4G都能夠顯著地誘導(dǎo)HSP70的合成。在人類皮膚中進行的相似研究證明，與對照組相比，在培養(yǎng)基配方中加入鹵蟲提取物可以顯著誘導(dǎo)并增加HSP70蛋白的表達。在另外的相關(guān)試驗中，我們發(fā)現(xiàn)HSP70的mRNA含量出現(xiàn)了迅速的增加。事實上，HSP70的含量在用二核苷酸磷

13、酸處理后3h即上升70%，達到最大值。 另外，不同的研究都顯示鹵蟲提取物在沒有外界壓力的作用時可以誘導(dǎo)HSP70的產(chǎn)生。此類研究包括用MTT比色法測定細(xì)胞活性，也沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力的損失。同樣的，關(guān)于IL-1和IL-8的研究也沒有發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)合成，這預(yù)示著不存在外部壓力。因此，我們注意到有趣的一點是，鹵蟲提取物通過一種非凡的機制來起到一種主要的保護作用：它在沒有壓力的時候誘導(dǎo)人類皮膚和人類細(xì)胞中的HSP70的表達。細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用 為了進一步觀察鹵蟲提取物（在沒有外界壓力的條件下）誘導(dǎo)HSP70產(chǎn)生的方式，我們通過研究IL-8，IL-1以及TNF等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)合成來研究鹵蟲提取物

14、的抗炎作用。另外一些研究表明，HSP70能夠在高溫，化學(xué)物質(zhì)，放射性物質(zhì)等抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生的條件下合成。為了了解鹵蟲提取物在該途徑中的作用，我們將人類HaCaT角質(zhì)細(xì)胞先用GP4G處理24h，然后用UVB照射，再進行ELISA（酶聯(lián)免疫反應(yīng)）。有趣的是，在鹵蟲提取物誘導(dǎo)的細(xì)胞中，不同時間點的IL-1水平都出現(xiàn)了明顯的下降，而IL-8的情形也與此類似。同樣的，在用鹵蟲提取物處理過的細(xì)胞中，TNF的含量也出現(xiàn)了明顯的下降。所有這些的明顯下降都是由學(xué)生T測試得到的。這些研究表明鹵蟲提取物，或者更精確的說，鹵蟲提取物在沒有外界壓力的條件下誘導(dǎo)人體細(xì)胞產(chǎn)生的HSP70，通過一種新的，降低細(xì)胞因子反應(yīng)的方

15、式來治療人類皮膚一些炎癥。鹵蟲提取物對類維生素A治療皮膚的影響根據(jù)前面對鹵蟲提取物在各種壓力條件下降低人體細(xì)胞和皮膚中的細(xì)胞因子含量過程中的作用，我們的興趣轉(zhuǎn)向了GP4G在用全反式維甲酸（ATRA）處理的皮膚細(xì)胞中的作用。我們知道，維甲酸在各種皮膚病中都有著廣泛的應(yīng)用，本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的維甲酸能夠降低HSP70的含量。這種現(xiàn)象是在應(yīng)用的第一周發(fā)現(xiàn)的，并且隨著時間的推移越來越明顯。鹵蟲提取物能夠顯著增加經(jīng)過ATRA處理過的細(xì)胞或皮膚樣品中HSP70的含量。另外，前面的數(shù)個研究成果都顯示ATRA的局部應(yīng)用可以增加細(xì)胞中的炎癥因子。并研究了鹵蟲提取物對ATRA和GP4G處理過的細(xì)胞中IL-1的含量的

16、影響。結(jié)果證明ATRA對人類細(xì)胞和皮膚都具有促炎癥作用，而鹵蟲提取物則可以降低這兩者中的炎癥因子。這個研究證明了GP4G在提高皮膚舒適度上與維甲酸是相互關(guān)聯(lián)的。結(jié)論人們越來越認(rèn)識到皮膚時間在太陽光下曝曬會帶來風(fēng)險，隨著這種認(rèn)識的普及與增長，人們重新對保護皮膚免受UV的傷害變的重視起來。如今，人們已經(jīng)知道UV可以損傷細(xì)胞中的DNA，可引起光老化并具有致癌作用。在陽光下暴曬和其他因素和其他因素可加速皮膚的老化進程-這些因素包括吸煙，空氣污染，惡劣的氣候環(huán)境以及現(xiàn)代生活中的各種壓力。 鹵蟲提取物通過其所含有的GP4G和HSP，能夠在很大程度上保護皮膚。事實上，鹵蟲提取物具有多種保護功能，其中的一些是由HSP70誘導(dǎo)介導(dǎo)的，能夠緩解細(xì)胞的壓力。除了HSP的細(xì)胞保護功能之外，鹵蟲提取物中的GP4G還具有“細(xì)胞營養(yǎng)激活者”的作用。GP4G，能夠通過GTP，綁定在G蛋白上，并激活細(xì)胞的新陳代謝。GP4G還富含磷，鳥嘌呤等組成一些重要分子（如，DNA,RNA,磷脂質(zhì)）的重要元素，磷還是很多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微