超聲聯(lián)合微泡增效骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢治療缺血性腦卒中

1、錢健，范國(guó)峰，徐鵬，李啟明，沙杜鵑，王軍，張均(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院急診科，江蘇省南京市 210008)引用本文：錢健，范國(guó)峰，徐鵬，李啟明，沙杜鵑，王軍，張均. 超聲聯(lián)合微泡增效骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢治療缺血性腦卒中J.中國(guó)組織工程研究，2017，21(25):4007-4012.DOI:7.25.012ORCID: 0000-0002-2635-6019(范國(guó)峰)文章快速閱讀：超聲聯(lián)合微泡增效骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢治療缺血性腦卒中研究流程圖造模：建立雄性SD大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型術(shù)后3 d分組干預(yù)超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)：經(jīng)顱骨超聲(頻率1 MHz，功率 2 W/cm2) 輻

2、照120 s，靜脈注射3×106骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)：超聲輻照前靜注微泡對(duì)比劑 0.1 mL/kg，靜脈注射3×106骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)：靜脈注射3×106骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞PBS組(n=15)：靜脈注射2 mL PBS錢健，男，1983 年生，江蘇省南京市人，漢族，2015年南京醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)，主治醫(yī)師，主要從事缺血性腦卒中與神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)研究。通訊作者：范國(guó)峰，碩士，主治醫(yī)師，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院急診科，江蘇省南京市 210008中圖分類號(hào):R3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):2095-4344(201

3、7)25-04007-06稿件接受：2017-03-10Qian Jian, Attending physician, Department of Emergency, Nanjing Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, ChinaCorresponding author: Fan Guo-feng, Master, Attending physician, Department of Emergency, Nanjing Drum Tower H

4、ospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China結(jié)論：(1)超聲聯(lián)合微泡可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的腦內(nèi)靶向歸巢；(2)能夠減少腦水腫和腦梗死體積，改善神經(jīng)功能評(píng)分；(3)增效骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中的效果。造模后1，7，14，21，28 d：(1)熒光顯微鏡觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢；(2)改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)損害嚴(yán)重程度；(3)干濕重法測(cè)定腦組織含水率；(4)TTC染色法計(jì)算腦梗死體積。文題釋義：超聲微泡：是一種超聲對(duì)比劑，結(jié)構(gòu)包括核心及外殼2個(gè)部分，

5、核心由二氧化碳、氧氣、空氣或大分子惰性氣體等構(gòu)成，外殼可由磷脂類化合物、白蛋白、糖類、非離子表面活性劑或可生物降解的高分子多聚物等不同材料組成。在疾病診斷上，它用于提高超聲圖像質(zhì)量；在治療上，它作為一種載體，與超聲波相互作用產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)所攜帶藥物及基因等向靶向組織的傳遞釋放，或利用聲學(xué)空化效應(yīng)增效干細(xì)胞或藥物靶向進(jìn)入組織。干細(xì)胞歸巢：是指自體或外源性干細(xì)胞在多種因素如免疫炎癥反應(yīng)過程中的多種趨化因子、生長(zhǎng)因子及黏附分子的作用下，定向趨向性遷移穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞至靶向組織并定植存活的過程。摘要背景：國(guó)內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲微泡能夠促進(jìn)移植干細(xì)胞歸巢到缺血區(qū)，增強(qiáng)血管新生和小動(dòng)脈生成，改

6、善缺血心肌局部血流量，恢復(fù)心肌收縮功能。目的：探討超聲聯(lián)合微泡對(duì)靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的影響及治療缺血性腦卒中的有效性。方法：插線法建立大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠模型，建模72h后，隨機(jī)分為4組：PBS組(n=15)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)，超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)，超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)。PBS組經(jīng)尾靜脈注射2mL PBS；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(約3×106)用2mL PBS稀釋后經(jīng)尾靜脈緩慢注射；超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組經(jīng)顱骨超聲(頻率1MHz，功率2W/cm2)輻照120s，給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

7、組在超聲輻照前靜注微泡對(duì)比mL/kg，再給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。結(jié)果與結(jié)論：移植后48h，超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組細(xì)胞的腦內(nèi)歸巢率高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組和超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，差異均有顯著性意義(P<0.05)；造模后28d，超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組的神經(jīng)損害程度較其余組輕，差異均有顯著性意義(P<0.05)；移植后7d，超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組的腦組織含水率較其余組低，差異均有顯著性意義(P<0.05)；移植后7d，超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組腦梗死體積較其余組小，差異有顯著性意義(P<0.05)；結(jié)果表明，超聲聯(lián)合微泡可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的腦

8、內(nèi)靶向歸巢，能夠減少腦水腫和腦梗死體積，改善神經(jīng)功能評(píng)分，增效骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中的效果。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；移植；超聲微泡；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；缺血性腦卒中；歸巢主題詞：腦缺血；骨髓；間質(zhì)干細(xì)胞移植；微氣泡；超聲處理；組織工程基金資助：南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目基金(YKK16100)；江蘇省衛(wèi)生廳青年科研課題(Q201306)Ultrasound-mediated microbubble promotes bone marrow mesenchymal stem cell homing in the treatment of ischemic strokeQian Jian, Fan

9、 Guo-feng, Xu Peng, Li Qi-ming, Sha Du-juan, Wang Jun, Zhang Jun (Department of Emergency, Nanjing Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China)AbstractBACKGROUND: In animal experiments, ultrasound-mediated microbubbles can promote the homing of t

10、ransplanted stem cells to the ischemic area, enhance angiogenesis and small arterial formation, improve local blood flow in the ischemic myocardium and restore myocardial contractility.OBJECTIVE: To investigate the effect of ultrasound-mediated microbubbles on intravenously transplanted bone marrow

11、mesenchymal stem cell (BMSC) homing and the therapeutic efficiency on ischemic stroke. METHODS: A middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was induced by plug wire preparation. At 72 hours after MCAO, model rats were randomized into four groups: PBS group (n=15), BMSCs group (n=18), ultrasound+

12、BMSCs group (n=18), ultrasound+microbubble+BMSCs group (n=18). Corresponding treatment was done in each group: 2 mL of PBS was injected via tail vein in the PBS group; about 3×106 BMSCs diluted by 2 mL of PBS were injected via tail vein slowly in the BMSCs group; after skull ultrasound radiatio

13、n (1 MHz, 2 W/cm2) for 120 seconds, BMSCs were injected via tail vein slowly in the ultrasound+BMSCs group; the same process as the ultrasound+BMSCs group was done following intravenous injection of 0.1 mL/kg microbubbles in the ultrasound+microbubble+BMSCs group. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Forty-e

14、ight hours after BMSCs transplantation, the BMSCs homing rate in the brain was significantly higher in the ultrasound+microbubble+BMSCs group than the other two groups (P < 0.05). (2) Twenty-eight days after MCAO, nerve damage was significantly milder in the ultrasound+microbubble+BMSCs group tha

15、n the other two groups (P < 0.05). (3) Seven days after transplantation, the water content in the brain tissue was significantly lower in the ultrasound+microbubble+BMSCs group than the other two groups (P < 0.05). (4) Seven days after transplantation, the cerebral infarction volume was signif

16、icantly reduced in the ultrasound+microbubble+BMSCs group compared with the other two groups (P < 0.05). To conclude, ultrasound-mediated microbubbles can enhance the homing effect of intravenously transplanted BMSCs, reduce cerebral edema and cerebral infarction volume, improve the neurological

17、function, and increase the therapeutic effect of BMSCs transplantation on ischemic stroke. Subject headings: Brain Ischemia; Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Microbubbles; Sonication; Tissue EngineeringFunding: the Medical Development Foundation of NanjingCity, No. YKK16100; the Y

18、outh Scientific Research Project of Jiangsu Provincial Health Department, No. Q201306Cite this article: Qian J, Fan GF, Xu P, Li QM, Sha DJ, Wang J, Zhang J.Ultrasound-mediated microbubble promotes bone marrow mesenchymal stem cell homing in the treatment of ischemic stroke. Zhongguo Zuzhi Gongcheng

19、 Yanjiu. 2017;21(25):4007-4012.0引言 Introduction腦卒中是60歲以上老年人的第二大死因1。缺血性腦卒中是最常見的卒中類型，占全部腦卒中的87%。部分患者預(yù)后良好，但有超過50%的患者遺留功能障礙2。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是具有自我更新和多向分化能力的亞全能干細(xì)胞，具有歸巢至缺血腦組織的能力。多個(gè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)缺血性腦卒中有神經(jīng)保護(hù)作用3-5，但因?yàn)榇嬖谘X屏障，移植細(xì)胞遷移至梗死區(qū)能夠存活并分化的數(shù)量很少，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示只有移植細(xì)胞數(shù)的1.6%-3.2%6-7，提高移植細(xì)胞向缺血區(qū)的靶向歸巢能力以增加移植效率是亟待解決的根本問題。課題組

20、實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡能夠增強(qiáng)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的效果，改善梗死后心功能8，且對(duì)移植細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期無不良影響9。為此，實(shí)驗(yàn)擬探討超聲微泡對(duì)靜脈注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血腦組織歸巢的影響，以及治療缺血性腦卒中的有效性，尋找一種更有效的增效骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的方法。1 材料和方法 Materials and methods設(shè)計(jì)隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2014年6至10月在南京鼓樓醫(yī)院科研部實(shí)驗(yàn)室完成。1.3 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)慢病毒GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的雄性SD大鼠2只，5周齡，體質(zhì)量100-150g；SPF級(jí)雄性SD大鼠69只，2.5個(gè)月齡，體質(zhì)量2

21、40-270g，由南京鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 主要試劑及儀器 胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司)；L-DMEM 培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司)；淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque(天津?yàn)笊锕?；抗大鼠FITC-CD44(美國(guó)MyBioSource公司)；抗大鼠FITC-CD34(美國(guó)Beckman Coulter公司)；抗大鼠FITC-CD29、FITC-CD45(美國(guó)BioLegend公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)；TTC試劑盒(南京建成生物工程研究所)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；倒置相差顯微鏡

22、(重慶光學(xué)儀器廠)；熒光正立顯微鏡(日本Nikon公司)；超聲波治療儀(北京中西遠(yuǎn)大化玻儀器有限公司)；微泡對(duì)比劑(六氟化硫微泡)(瑞士Bracco Suisse SA)。1.4 實(shí)驗(yàn)方法 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)：取GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的2只SD大鼠斷頸處死，以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡全身消毒10min，超凈臺(tái)上分離取出脛骨和股骨，剪去骨骺端，露出骨髓腔，PBS沖出骨髓，將骨髓懸液加入到相同體積、密度為kg/L的淋巴細(xì)胞分離液上層，400×g離心20 min，收集界面層，用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的L-DMEM重懸，于設(shè)定溫度37、體積分?jǐn)?shù)為

23、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48h后換液，棄未貼壁細(xì)胞，以后1周換液2次，待細(xì)胞達(dá)80%-90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后按12傳代，進(jìn)行體外擴(kuò)增。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞學(xué)鑒定：取培養(yǎng)至第3代生長(zhǎng)良好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化、離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010 L-1。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面分子標(biāo)記CD34、CD45、CD29、CD44表達(dá)進(jìn)行鑒定。 大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型制備 線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，具體方法詳見參考文獻(xiàn)10-11。大腦中動(dòng)脈栓塞后2h，再灌注前采用Longa 5等級(jí)法對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分12。得分為2分或3分為

24、造模成功。缺血2h再次麻醉造模成功的大鼠，抽出栓塞線段至頸外動(dòng)脈處，遇到阻力即停止。扎緊絲線，剪斷血管外多余的絲線，實(shí)現(xiàn)再灌注。術(shù)中及術(shù)畢2h內(nèi)用60W的白熾燈垂直距離50cm照射大鼠，使其肛溫保持(37.0±0.5)。 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù) 69只造模成功大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(PBS組，n=15)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)，超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)，超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(n=18)。于造模后72 h建立大鼠尾靜脈通路，進(jìn)行如下干預(yù)：PBS組直接經(jīng)尾靜脈注射2 mL PBS，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(約3×106)用2 mL PBS稀釋后經(jīng)

25、尾靜脈緩慢注射13；超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠顱頂脫毛，超聲耦合劑將超聲探頭與顱骨緊密結(jié)合，超聲(1 MHz，2 W/cm2，作用時(shí)間120 s)作用后，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(約3×106mL/kg，同樣超聲干預(yù)后將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(約3×106)用2 mL PBS稀釋后經(jīng)尾靜脈緩慢注射。熒光顯微鏡觀察各組GFP標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植48 h后，處死除PBS組以外的其他3組大鼠(n=3)，取出全腦組織后冷凍，于冠狀面漏斗柄層面制成厚度約7 m的冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察右側(cè)基底節(jié)腦卒中區(qū)域及其周圍區(qū)域的GFP綠色熒光標(biāo)記情況。每只大鼠取3張切片，每

26、張切片200倍熒光顯微鏡下拍攝3張照片，采用Image Pro Plus 6.0數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)軟件處理后計(jì)算各組缺血區(qū)綠色熒光積分吸光度，統(tǒng)計(jì)分析各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后的歸巢情況。 評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)損害嚴(yán)重程度 每組取6只大鼠，分別于造模后1，7，14，21，28d進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified Neurological Severity Scores，mNSS)6，觀察各組大鼠神經(jīng)功能損害程度的動(dòng)態(tài)變化。 干濕重法測(cè)定腦組織含水率 移植后1，3，7d各組取3只大鼠，處死后迅速斷頭，完整取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，置于培養(yǎng)皿中，濾紙吸干表面水分，電子天平精確稱量濕重，然后置于

27、95烘箱內(nèi)烘干24h至恒重，電子天平精確稱量干重。干濕重法計(jì)算腦組織含水率。腦組織含水率=(濕重-干重)/濕重×100% 14。 TTC染色法計(jì)算腦梗死體積占全腦體積比 以2,3,5-氯化三苯基四氮唑藍(lán)(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)對(duì)各組腦組織染色15，根據(jù)染色結(jié)果測(cè)定腦梗死體積。于移植后7d各組取3只大鼠，處死后迅速斷頭，完整取腦，-70快速冷凍。自前向后將大鼠腦連續(xù)切成5片，第一刀在腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處，第二刀在視交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。放入1%的TTC磷酸緩沖液中，37避光染色30min，PBS沖

28、洗后置于40g/L多聚甲醛溶液中固定保存。正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色。愛普生掃描儀1200dpi分辨率掃描標(biāo)本。圖像經(jīng)過Image Pro Plus 6.0數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)軟件處理，計(jì)算梗死體積占全腦體積比。1.5 主要觀察指標(biāo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢率；神經(jīng)損害嚴(yán)重程度；腦組織含水率；梗死體積占全腦體積比。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料2組比較采用成組t檢驗(yàn)；3組及以上比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)；組間兩兩比較采用Student Ne

29、wman Keuls(SNK)檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析共實(shí)施造模SD大鼠76只。術(shù)中因完全切斷頸總動(dòng)脈失敗2例，術(shù)后72h以內(nèi)因嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損死亡3只，繼發(fā)顱內(nèi)出血死亡2只，術(shù)后72h共有69只大鼠存活，存活率為90.8%。存活72h以上的大鼠進(jìn)入分組實(shí)驗(yàn)，中途無脫落。2.2 超聲微泡干預(yù)增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢率 熒光顯微鏡觀察各組大鼠腦缺血區(qū)域冰凍切片顯示(圖1)，缺血區(qū)腦組織內(nèi)出現(xiàn)散在綠色熒光顆粒為GFP標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組積分吸光度(224363.87±19723.9

30、7)明顯高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(199016.21±16918.42)、超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(205330.94±13957.45)，差異有顯著性意義(P < 0.05)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組和超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較差異無顯著性意義。提示超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組歸巢細(xì)胞明顯增多。2.3 超聲微泡干預(yù)減輕大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠神經(jīng)損害嚴(yán)重程度 在造模后14 d，各組mNSS分值開始出現(xiàn)差異。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組在造模后14，21，28 d的神經(jīng)損害程度均輕于PBS組，但僅28 d差異有顯著性意義(P<0.01)；超聲+微泡+骨

31、髓間充質(zhì)干細(xì)胞組造模后14，21，28d的神經(jīng)損害程度均輕于PBS組，差異均有顯著性意義(P<0.01)；超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組造模后28d的神經(jīng)損害程度較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組更輕，差異均有顯著性意義(P<0.05)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較差異均無顯著性意義，見表1。2.4 超聲微泡干預(yù)降低大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠腦組織含水率 各組大鼠腦組織含水率在造模后升高。在造模后6d即干細(xì)胞移植后3d為著，并可見移植后7d含水率降低。在移植后1，3d，各組含水率差異無顯著性意義(P>0.05)；在移植后7d，各組含水率均較PBS組

32、低，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較，超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組含水率顯著降低，其差異有顯著性意義(P<0.05)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較差異均無顯著性意義，見表2。2.5 超聲微泡干預(yù)縮小大腦中動(dòng)脈栓塞模型大鼠腦梗死體積細(xì)胞移植后7d(造模后10d)梗死累及范圍主要為額頂葉的背外側(cè)皮質(zhì)、尾殼核、下丘腦部分，嚴(yán)重時(shí)累及到海馬區(qū)(圖2)。測(cè)量后發(fā)現(xiàn)超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組腦梗死體積為(15.40±0.88)%，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(17.00±0.63)%，超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(17.31±0.95)%

33、，PBS組(19.51±1.10)%比較，梗死體積明顯縮小，差異有顯著性意義(均P<0.05)，見表3。D CB A圖1 熒光顯微鏡下各組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢情況(×200)Figure 1 Homing of bone marrow mesenchymal stem cells in each group under fluorescence microscope (×200)圖注：圖中A為PBS組腦組織缺血區(qū)域冰凍切片自然光攝片；B為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組腦組織缺血區(qū)域熒光表達(dá)；C為超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組腦組織缺血區(qū)域熒光表達(dá)；D為超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干

34、細(xì)胞組腦組織缺血區(qū)域熒光表達(dá)。圖2 移植后7 d大鼠腦組織TTC染色(冠狀位海馬平面)Figure 2 Brain tissue TTC staining at 7 days after transplantation圖注：圖中A為正常對(duì)照；B為PBS組；C為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組；D為超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組；E為超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組。由圖可見，超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組梗死體積明顯縮小。 E D C B A表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠mNSS評(píng)分 (±s，n=6)Table 1 Modified neurological severity scores of rats at di

35、fferent time points組別1 d7 d14 d21 d28 dPBS組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組FP< < 表2 各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水率比較 (±s，n=3，%)Table 2 Water content of the brain tissue at different time points 表注：與同時(shí)間點(diǎn)其他組比較，aP < 0.01；與同時(shí)間點(diǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組、超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組比較，bP < 0.05。組別1 d3 d7 dPBS組79.94±a骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組超聲+骨髓

36、間充質(zhì)干細(xì)胞組超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組bFP表3 移植后7 d各組腦梗死體積占全腦體積百分比 (±s，n=3，%)Table 3 Cerebral infarction percentage at 7 days after cell transplantation組別梗死體積占全腦體積百分比S-N-K檢驗(yàn)*PBS組A骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組B超聲+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組B超聲+微泡+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組C表注：* S-N-K檢驗(yàn)兩兩比較時(shí)，兩組字母不同表示組間有差異。3 討論 Discussion采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞模型，模擬體內(nèi)缺血。日本學(xué)者Koizumi等16于1986

37、年首次采用不開顱經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈栓入尼龍線致大腦中動(dòng)脈栓塞獲得成功，后經(jīng)Longa的適當(dāng)改進(jìn)12，該動(dòng)物模型被公認(rèn)為實(shí)驗(yàn)性局灶性腦缺血標(biāo)準(zhǔn)模型。該模型不會(huì)像諸如頸內(nèi)動(dòng)脈注射栓塞劑栓塞一類的方法，會(huì)造成永久腦栓塞，優(yōu)點(diǎn)是可形成腦缺血損傷后再灌注，更符合人類腦梗死或溶栓藥物治療后血管再通的機(jī)制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中具有自我更新和多向分化潛能的一系列基質(zhì)干細(xì)胞的混合群體，在體內(nèi)其主要作用是構(gòu)成骨髓造血干細(xì)胞的微環(huán)境。實(shí)驗(yàn)研究表明，大腦中動(dòng)脈缺血損傷后24h尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，大鼠行為功能恢復(fù)明顯增強(qiáng)7；即使1個(gè)月后靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療，仍可觀察到相似的治療益處17，并可持續(xù)1年以上18

38、；而且，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期干預(yù)治療的神經(jīng)保護(hù)作用更強(qiáng)19。因此，將自身骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，然后移植到患者體內(nèi)，是治療缺血性腦卒中的潛在可行的理想手段。然而，腦梗死患者骨髓干細(xì)胞數(shù)量減少、功能低下，同時(shí)存在血腦屏障，移植細(xì)胞遷移至梗死區(qū)能夠存活并分化的數(shù)量仍很少，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示只有移植細(xì)胞數(shù)的1.6%-3.2%2-3。因此，如何將更多骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到需要的區(qū)域，即歸巢至缺血梗死區(qū)，提高其移植治療的效率是尚未解決的重要科學(xué)問題。目前研究解決方案集中在以下幾方面：選擇合適的移植途徑20-21：腦實(shí)質(zhì)內(nèi)或梗死液化腔內(nèi)立體定向注射、外周靜脈注射、經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈注射、腦池或腦室內(nèi)移植是已

39、知的幾種移植方法。其中經(jīng)外周靜脈和頸內(nèi)動(dòng)脈注射干細(xì)胞的研究相對(duì)較多，但其移植效率仍然很低；將單次干細(xì)胞移植改成反復(fù)多次移植；應(yīng)用一些細(xì)胞因子和趨化因子提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢能力：如用基因轉(zhuǎn)染方法對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、CXCR4等。然而，后2種方法的實(shí)施存在成本高、創(chuàng)傷大、安全性低等缺點(diǎn)，并仍在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索階段。近期國(guó)內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲微泡能夠促進(jìn)移植干細(xì)胞歸巢到缺血區(qū)，增強(qiáng)血管新生和小動(dòng)脈生成，改善缺血骨骼肌和心肌局部血流量，恢復(fù)心肌收縮功能和骨骼肌運(yùn)動(dòng)功能8，22-23。此外，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，超聲波作用下血腦屏障通透性一過性增加24，有利于化療藥物、治療

40、性抗體進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)靜脈注射移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠改善腦梗死后28d神經(jīng)功能損害程度，而超聲聯(lián)合微泡作用后移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠在干預(yù)后14d進(jìn)一步改善神經(jīng)損害程度，且超聲微泡干預(yù)可降低腦組織含水率和腦梗死體積。因此，超聲聯(lián)合微泡作用下移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠更有效的減輕腦梗死后腦水腫和梗死體積，促進(jìn)梗死后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，可能與其能夠增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)歸巢數(shù)量有關(guān)。超聲微泡促進(jìn)移植干細(xì)胞腦內(nèi)歸巢增多的機(jī)制目前仍不明確，有研究表明：超聲微泡能夠使血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，血腦屏障通透性增高25，并可能引起某些細(xì)胞因子或趨化因子表達(dá)增加，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮

41、生長(zhǎng)因子4、內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素26、突觸素、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1、一氧化氮27-28，這些因素均有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腦內(nèi)缺血梗死區(qū)歸巢，促進(jìn)局部血管生成以及形成新的神經(jīng)突觸細(xì)胞。 綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)靜脈移植有助于大鼠缺血性腦組織的修復(fù)，減少梗死腦組織含水率，縮小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能；而超聲微泡可增加移植干細(xì)胞在大鼠缺血再灌注損傷腦組織內(nèi)的歸巢率，提高干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的效果。作者貢獻(xiàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為錢健、范國(guó)峰，實(shí)驗(yàn)實(shí)施為錢健、范國(guó)峰、李啟明，實(shí)驗(yàn)評(píng)估為沙杜鵑、王軍、張均，資料收集為范國(guó)峰。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章無相關(guān)利益沖突。倫理問題：實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)南京鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

42、倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為20140503。實(shí)驗(yàn)過程遵循了國(guó)際獸醫(yī)學(xué)編輯協(xié)會(huì)關(guān)于動(dòng)物倫理與福利的作者指南共識(shí)和本地及國(guó)家法規(guī)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在麻醉下進(jìn)行所有手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。文章撰寫與編輯修改后遵守了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告規(guī)范指南(ARRIVE指南)。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國(guó)內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：通訊作者對(duì)研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全

43、體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。開放獲取聲明：這是一篇開放獲取文章，文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。根據(jù)知識(shí)共享許可協(xié)議“署名-非商業(yè)性使用-相同方式共享”條款，在合理引用的情況下，允許他人以非商業(yè)性目的基于原文內(nèi)容編輯、調(diào)整和擴(kuò)展，同時(shí)允許任何用戶閱讀、下載、拷貝、傳遞、打印、檢索、超級(jí)鏈接該文獻(xiàn)，并為之建立索引，用作軟件的輸入數(shù)據(jù)或其它任何合法用途。4參考文獻(xiàn) References1 Lozano R, Naghavi M, Foreman K, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death

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