淋巴細胞表面抗原檢測-20141113碩士班

1、淋巴細胞表面抗原檢測淋巴細胞表面抗原檢測 - -免疫熒光法免疫熒光法2014-11-13 2014-11-13 碩士班碩士班2 基本概念基本概念 所有參與免疫應(yīng)答以及與免疫應(yīng)答相關(guān)的細胞均被稱為所有參與免疫應(yīng)答以及與免疫應(yīng)答相關(guān)的細胞均被稱為免疫細胞免疫細胞。 包括包括淋巴細胞、單核淋巴細胞、單核- -巨噬細胞、巨噬細胞、DCDC、各種粒細胞、紅細胞、肥、各種粒細胞、紅細胞、肥大細胞、干細胞。大細胞、干細胞。3免疫細胞分離方法：免疫細胞分離方法：根據(jù)不同免疫細胞表面標志:FACS、MACS根據(jù)細胞理化性質(zhì)： 1）根據(jù)細胞比重差異：自然沉降法、密度梯度離心法、改變細 胞密度法 2）根據(jù)細胞黏附特

2、性：B細胞黏附于尼龍棉 3）根據(jù)細胞對滲透壓變化的敏感度：紅細胞對低滲敏感u 淋巴細胞是指在適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用的白細胞，由淋巴器官產(chǎn)生，機體免疫應(yīng)答功能的重要細胞成分。主要指B淋巴細胞和T淋巴細胞，二者表面抗原受體具有高度多樣性，經(jīng)抗原激發(fā)可分化為抗原特異性效應(yīng)細胞，分別介導(dǎo)體液免疫和細胞免疫。u 淋巴器官根據(jù)其發(fā)生和功能的差異可分為：l 中樞淋巴器官（又名初級淋巴器官）：包括胸腺、腔上囊或其相當器官。它們無須抗原刺激即可不斷增殖淋巴細胞，成熟后將其轉(zhuǎn)送至周圍淋巴器官。l 周圍淋巴器官（又名次級淋巴器官）：包括脾、淋巴結(jié)等。 成熟淋巴細胞需依賴抗原刺激而分化增殖，繼而發(fā)揮其免疫功能。 在此

3、我們將要討論CD4+ 和CD8+ T淋巴細胞檢測的方法和意義。2022-2-18淋巴細胞5T淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)中的主要調(diào)節(jié)及效應(yīng)細胞，在正常機體內(nèi)各淋巴細胞亞群相互作用，可通過對抗原識別、處理、遞呈引起多種細胞因子同多種細胞之間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，構(gòu)成維持免疫功能的生理平衡，維持著機體正常免疫功能。當不同淋巴細胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，可導(dǎo)致機體免疫功能紊亂并發(fā)生一系列病理變化。因此，淋巴細胞亞群的免疫分型能夠提供有關(guān)患者免疫狀態(tài)的重要信息。T淋巴細胞2022-2-18早期將T細胞中的CD4+T細胞分為Thl和Th2兩個亞群。l Thl細胞通過分泌IL-2、IL-12、IFN-和TNF- 等細

4、胞因子，介導(dǎo)與細胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，參與細胞免疫及遲發(fā)型超敏反應(yīng)。在抗感染、抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。l Th2細胞則通過分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等細胞因子，其主要功能為刺激B細胞增殖并產(chǎn)生抗體，促進機體的體液免疫應(yīng)答。2022-2-18l 調(diào)節(jié)T細胞(Treg細胞)也是近年來認識的一種重要的免疫調(diào)節(jié)細胞， CD4+ T細胞在TGF-單獨的誘導(dǎo)下則而分化成Treg細胞，分泌TGF-并表達Foxp3，參與免疫的調(diào)節(jié)。l Thl7是一種能產(chǎn)生IL-17卻不產(chǎn)生IFN-和IL-4的CD4+T細胞，目前的研究證實了TGF-和IL-6在Thl7細胞分化啟動過程中

5、的重要作用。同時，轉(zhuǎn)錄因子STAT3和RORt，在Thl7的分化過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。2022-2-18Th1/Th2 亞群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用，Th1/Th2 平衡的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后有著密切的關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)許多感染性疾病、自身免疫性疾病、過敏性疾病以及移植排斥反應(yīng)等都與Th1/Th2 平衡有關(guān)。建立穩(wěn)定有效的細胞內(nèi)因子檢測方法對于準確說明Th1/Th2細胞的作用非常重要。目前檢測的主要方法： 酶聯(lián)免疫法、ELISPOT法、熒光定量法及原位雜交等方法。2022-2-18分化抗原分化抗原 cIuster of differentiation,

6、CD不同譜系細胞在分化、成熟、活化過程中,出現(xiàn)或消失的細胞表面標志。細胞表面標志通常用單克隆抗體來識別。每個抗體都有指定的CD編號,能被特定抗體識別的特定抗原通常具有相同的編號,例如,被“CD1抗體”識別的抗原稱為“CD1抗原”。CD4細胞，作為淋巴細胞的一種，是人體中調(diào)控免疫系統(tǒng)最重要的樞紐細胞，其數(shù)量能夠最直接的反應(yīng)人體免疫功能的狀態(tài)。CD4細胞檢測廣泛應(yīng)用于對人體免疫功能狀況的評估，有助于腫瘤、糖尿病、冠心病、艾滋病等疾病的早期發(fā)現(xiàn)及臨床診療2022-2-18人體內(nèi)的淋巴細胞在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)基本是一樣的，但其功能各異，對 T 細胞、B 細胞和醞細胞及其有關(guān)的亞群的相應(yīng)表面標志檢測，藉

7、以判斷機體的免疫水平。一、T 淋巴細胞表面標志的檢測lT 細胞表面標志l 抗體致敏細胞花環(huán)法l免疫細胞化學(xué)法l免疫熒光法lT 細胞亞群檢測2022-2-18lT 細胞表面標志T 細胞是參與機體細胞免疫反應(yīng)和在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起主導(dǎo)調(diào)節(jié)作用的一組免疫細胞。所有的 T 細胞均有共同的標志性抗原，不同功能的 T細胞亞群又具有各自的標志性抗原。最常用單克隆抗睞鑒定和檢測計數(shù) T 細胞及亞群的表面標志l抗體致敏細胞花環(huán)法用相應(yīng)的抗 CD3 單克隆抗體吸附于醛化的紅細胞(致敏)，當其與受檢 的細胞混勻后，結(jié)合有蘭細胞的單抗與待測細胞上的 CD3 抗原結(jié)合形成橋 聯(lián)，由于加入的紅細胞多于受檢細胞，陽性的受程細

8、胞能與致敏的紅細胞 結(jié)合而形成玫瑰花樣的花環(huán)，凡受檢細胞周圍黏附 3 個和 3 個以上紅細胞 牽為花環(huán)形成細胞，計算花環(huán)形成細胞與計數(shù)淋巴細胞之比。2022-2-18l 免疫細胞化學(xué)法通常以酶作為抗體標記物，采用細胞酶免疫組化技術(shù)完成，并常采用生物素一鏈霉親合素放大系統(tǒng)提高靈敏度。該類方法可用普通顯微鏡觀察， 凡著色的細胞即為相應(yīng) CD 抗原陽性的細胞，計算陽性細胞占總計數(shù)細胞的 百分率進行定量分析。l免疫熒光法本法是將分離得的外周血單個核細胞與相應(yīng)的以熒光物質(zhì)標記的 CD 單 克隆抗體作用(直掃法)，或與抗相應(yīng) CD 單克隆抗體作用后，洗去游離的抗 體，繼而加入熒光素標記的抗小鼠 IgG 抗

9、皿清，經(jīng)溫育結(jié)合后，洗去多余 的標記抗體(間接法)，制片后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計算陽性細胞占總 計數(shù)細胞的百分率。如有條件，采用流式細胞儀計數(shù)，結(jié)果客觀準確。2022-2-18lT 細胞亞群檢測采用三色標記單克隆熒光抗體標記單個核細胞懸液，用流式細胞儀進 行檢測分析，可對 T 細胞及亞群作出精確分類。2022-2-18免疫細胞定量檢測，如T淋巴細胞亞群（CD3、CD4、CD8等）檢測，能精確觀察免疫細胞數(shù)值變化，評估免疫狀況。通常采用流式細胞儀法，特別針對CD4細胞檢測，此方法已被稱作“金標準”。T淋巴細胞亞群檢測T淋巴細胞檢測免疫細胞活性檢測，如T淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，根據(jù)淋巴細胞轉(zhuǎn)化程度測定

10、免疫應(yīng)答功能，但功能檢測仍需結(jié)合細胞定量檢測，結(jié)果更可靠。流式細胞儀流式細胞儀T細胞表面標志及其亞群細胞表面標志及其亞群uT細胞有兩大亞群：CD4+ CD8+u根據(jù)具體功能有分不同亞群：Td Ti Th Tc Tsu受抗原或細胞因子激活就是活化的T細胞u不同的活化細胞功能不同：l Tc活化后成CTL主要殺傷被病毒感染的細胞或癌細胞，l Ts活化主要抑制B細胞產(chǎn)生抗體和其他T細胞的分化，起調(diào)節(jié)免疫作用，l Td活化則適當多種淋巴因子導(dǎo)致炎癥，排除抗原，l Th也主要協(xié)助其他免疫細胞發(fā)揮功能，是免疫應(yīng)答必不可少的。2022-2-18T細胞表面標志及其亞群細胞表面標志及其亞群 CD3+CD4+CD8

11、- 輔助性T細胞（help T cell,Th） CD3+CD4-CD8+ 細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+ 調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell,Tr or Treg）2022-2-1817l SmIg、Fc受體、補體受體、EB病毒受體，部分CD分子是B細胞的重要表面標志，其中以SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標。 l CD19/CD5分子：可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞。 B B細胞表面標志細胞表面標志 18 人類N

12、K細胞表面標志主要以CD16、CD56來認定，臨床將CD3-CD56+CD16+淋巴細胞認定為NK細胞。 NK細胞表面標志細胞表面標志 19 流式細胞儀流式細胞儀由激光光源系統(tǒng)，氣控單細胞層流系統(tǒng)，光檢測及信由激光光源系統(tǒng)，氣控單細胞層流系統(tǒng)，光檢測及信息處理系統(tǒng)和細胞分離純化系統(tǒng)組成。息處理系統(tǒng)和細胞分離純化系統(tǒng)組成。 流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)(FCM)(FCM)是一種對處在液流中的是一種對處在液流中的單個細胞單個細胞或其它生物微或其它生物微粒（如細菌）等進行快速定量分析和分選的技術(shù)，它將免疫熒光與細粒（如細菌）等進行快速定量分析和分選的技術(shù)，它將免疫熒光與細胞生物學(xué)、流體力學(xué)、光學(xué)和電子計算機

13、等多種學(xué)科的高新技術(shù)融為胞生物學(xué)、流體力學(xué)、光學(xué)和電子計算機等多種學(xué)科的高新技術(shù)融為一體，進行細胞和分子水平的基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究。一體，進行細胞和分子水平的基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究。 將熒光標記的將熒光標記的單克隆抗體單克隆抗體加入加入PBMCPBMC懸液內(nèi)，使二者特異性結(jié)合，懸液內(nèi)，使二者特異性結(jié)合，通過流式細胞儀自動檢測，既可很快得到通過流式細胞儀自動檢測，既可很快得到T T、B B細胞及其亞群百分率和細胞及其亞群百分率和絕對值的有關(guān)數(shù)據(jù)，又能以每秒高達絕對值的有關(guān)數(shù)據(jù)，又能以每秒高達50005000個細胞個細胞(18(18106 106 細胞細胞/h)/h)的的速度分離和收集無菌的淋巴

14、細胞，純度可達速度分離和收集無菌的淋巴細胞，純度可達90%90%99%99%，細胞活性亦不，細胞活性亦不受影響，可用于淋巴細胞的各種免疫生物學(xué)功能測定。受影響，可用于淋巴細胞的各種免疫生物學(xué)功能測定。 FACSl流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)在流動的狀態(tài)中檢測細胞或顆粒的各項特性在流動的狀態(tài)中檢測細胞或顆粒的各項特性特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現(xiàn)多參數(shù)分析可檢測的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細胞穿刺液，洗脫液，可檢測的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細胞穿刺液，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞，微生物實體組織，培養(yǎng)細胞，微生物2022-2-18流式細胞術(shù)檢測樣本

15、流式細胞術(shù)檢測樣本0.4um40um流式細胞術(shù)檢測指標流式細胞術(shù)檢測指標l流式細胞術(shù)提供的信息：流式細胞術(shù)提供的信息： - 相對細胞大小相對細胞大小 - 相對細胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度相對細胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度 - 染色過細胞的相對熒光強度染色過細胞的相對熒光強度細胞結(jié)構(gòu)細胞結(jié)構(gòu)=細胞大小細胞大小=細胞粒度細胞粒度=DNA含量與細胞周期含量與細胞周期=RNA含量含量=蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量=染色體分析染色體分析 細胞功能細胞功能=細胞表面細胞表面/胞漿胞漿/核的特核的特異性抗原異性抗原=細胞活性細胞活性=細胞內(nèi)細胞因子細胞內(nèi)細胞因子=酶活性酶活性=激素結(jié)合位點激素結(jié)合位點=細胞受體細胞受體=細胞

16、凋亡細胞凋亡在上述信號基礎(chǔ)上的細胞分選流式細胞儀組成流式細胞儀組成l液流系統(tǒng)：形成層流系統(tǒng)，聚焦細胞l光學(xué)系統(tǒng)：產(chǎn)生和收集光學(xué)信號l電子系統(tǒng)：光信號轉(zhuǎn)化為電信號，進行信號處理25熒光激活細胞分離儀分離法熒光激活細胞分離儀分離法 2022-2-18光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)l激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)包括:- 激光器- 透鏡和反射鏡，將激光引導(dǎo)到檢測區(qū)域l收集光學(xué)系統(tǒng)包括:-濾光片，將產(chǎn)生的光信號引導(dǎo)到對應(yīng)的光學(xué)接收器光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)l激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)包括:- 激光器- 透鏡和反射鏡，將激光引導(dǎo)到檢測區(qū)域l收集光學(xué)系統(tǒng)包括:-濾光片，將產(chǎn)生的光信號引導(dǎo)到對應(yīng)的光學(xué)接收器l懸浮狀態(tài)的細胞l單個流過流動室l細胞被激發(fā)l產(chǎn)生散射

17、光和熒光 信號l信號被采集l轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號l存儲于電腦上 前向散射光 forward angle light scatter FALS、FSC、FS 光學(xué)檢測器在入射光的正前方所收集的低角度光信號,與細胞或顆粒的大小和體積有關(guān)。 側(cè)向散射光 side scatter, SSC 光學(xué)檢測器在入射光的直角處所收集的細胞散射的光信號,與細胞或顆粒的內(nèi)部和表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度有關(guān),如細胞質(zhì)顆粒性、膜不規(guī)則性及核形等。2022-2-18 熒光強度 fluorescence intensity 結(jié)合到細胞或顆粒上的熒光素的量。熒光信號的通道數(shù)越大提示熒光強度越強。在恰當?shù)臈l件下,熒光強度與一個細胞和特定熒光素

18、相結(jié)合的位點數(shù)相關(guān)。 自發(fā)熒光 autofIuorescence 未染色細胞白身發(fā)出的熒光。通常由嘧啶和黃素核苷酸所產(chǎn)生,自發(fā)熒光的強度取決于激發(fā)光的波長,且隨所分析細胞的類型和(或)細胞活化狀態(tài)而改變。通過特殊的標本處理方法可以降低自發(fā)熒光的強度(如用結(jié)晶紫孵育)。2022-2-18 顏色補償 coIor compensation 由于一種熒光素發(fā)射的熒光疊加到其他熒光素發(fā)射的波長范圍內(nèi)而造成熒光信號重疊，通過在其他熒光信號中扣除已測定熒光信號的一部分而糾正顏色重疊造成的計數(shù)錯誤。扣除的熒光量是用恰當?shù)膯稳緦φ諄泶_定的。被校正的信號反映了單熒光信號的發(fā)射情況。 設(shè)門 gate 在流式細胞儀顯

19、示的象限圖上基于一組參數(shù)(如熒光對SSC、FSC/SSC等)來確定的所要分析的目的細胞群。對限定區(qū)內(nèi)的目的細胞群通過其他參數(shù)(如熒光參數(shù))進一步分析其表達情況。2022-2-18數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集l三種數(shù)據(jù)：三種數(shù)據(jù)： - 前向散射光FSC - 側(cè)向散射光SSC - 各種熒光散射光FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3，F(xiàn)L4l當使用激光光源時，在前向方向（和激光行進的方向相同）上可用前向散射光接收通道前向散射光接收通道接收到一定量的散射光l前向散射光的強度是和細胞或其他檢測顆粒的大小、形狀密切相關(guān)的數(shù)據(jù)采集-前向散射光l當激光光源被使用時，側(cè)向也有一定量的散射光產(chǎn)生， 可以用9090o o 角的側(cè)向散射光檢測

20、通道角的側(cè)向散射光檢測通道來采集l側(cè)向散射光的強度和細胞或其他檢測顆粒的顆粒密度、內(nèi)部復(fù)雜程度密切相關(guān)數(shù)據(jù)采集-側(cè)向散射光外周全血細胞散射光雙參數(shù)點外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖圖 顆粒雜質(zhì)、氣泡對檢測的影響l細胞標記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長的激發(fā)光來激發(fā)，同時發(fā)出特定波長的光l熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將由特定的熒光通道來接收l特定檢測是通過光學(xué)濾片和透鏡來控制的數(shù)據(jù)采集-熒光信號l熒光強度是和細胞上標記上的熒光染料的量正相關(guān)數(shù)據(jù)采集電壓電壓l 信號放大方式：log、linl 信號類型：A,W,Hl 電壓的調(diào)節(jié):根據(jù)陰性對照管來調(diào)節(jié)閾值閾值l可以以任意參數(shù)及多個參數(shù)的組合作為

21、閾值l大多數(shù)樣本都可以設(shè)定FSC/SSCl閾值以下的信號不存儲l根據(jù)陰性對照管來調(diào)節(jié)l目的是將不需要的雜質(zhì)信號，噪音信號，無用的細胞信號等扣除，使收集到的都是有用信號補償補償l 補償方式：任意兩個通道之間，可以采用手動或自動補償。l 補償?shù)恼{(diào)節(jié):根據(jù)單染對照管來調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析l 流式數(shù)據(jù)流式數(shù)據(jù) 直方圖直方圖 散點圖散點圖 等高線圖等高線圖 密度圖密度圖 三維圖三維圖 統(tǒng)計數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)直方圖直方圖l 直方圖直方圖(Distribution Histogram) 橫坐標代表熒光信號或散射光信號相對強度橫坐標代表熒光信號或散射光信號相對強度，單位是，單位是對數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標。對數(shù)，可

22、以是線性或?qū)?shù)坐標。 縱坐標一般是細胞數(shù)?？v坐標一般是細胞數(shù)。散點圖散點圖l 散點圖散點圖(Dot Plot) X坐標為該細胞一參數(shù)相對含量，坐標為該細胞一參數(shù)相對含量，Y坐標為該細胞另一坐標為該細胞另一參數(shù)的含量，可以將細胞亞群分開。參數(shù)的含量，可以將細胞亞群分開。等高線圖和密度圖等高線圖和密度圖三維圖三維圖統(tǒng)計數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)l Eventsl 百分比l 平均熒光強度l 熒光中位值l CVl SDl 數(shù)據(jù)獲取與分析電壓閾值補償 獲得數(shù)據(jù) 畫圖設(shè)門統(tǒng)計 熒光素標記的單克隆抗體 采用熒光素直接標記的單克隆抗體(單抗)，稱直標抗體。選擇直標抗體是淋巴細胞亞群分析的關(guān)鍵步驟,要考慮所選抗體對細胞的反應(yīng)

23、性。 單抗 CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。2022-2-18 單抗對細胞的反應(yīng)性 CD45表達于所有白細胞; CD3表達于T淋巴細胞; CD4表達于T輔助/誘導(dǎo)淋巴細胞(CD4+T細胞)和單核細胞; CD8表達于細胞毒T細胞(CD8- T)和NK細胞; CD19表達于B淋巴細胞; CD16表達于NK細胞、單核巨噬細胞、粒細胞和樹突狀細胞等; CD56表達于NK細胞和細胞毒T細胞。 單抗對淋巴細胞亞群的鑒定CD4、CD8、CD16和CD56單抗均不能特異性標記淋巴細胞某一亞群。采用CD45和(或)CD3作為設(shè)門抗體,同時兼做質(zhì)控試劑。CD3+ T細胞標記為CD3

24、 +,CD4+T細胞標記為CD3 + CD4+ CD8+ T細胞標記為CD3+ CD8+B細胞標記為CD3 -CD19 +NK細胞標記為CD3 - CD56+ 或 CD3 CD(16+56)+2022-2-18 直標抗體常用熒光染料 異硫氰酸熒光素(FITC) 藻紅蛋白(PE/RD1) 藻紅蛋白偶聯(lián)物(PECY5) 多甲藻葉綠素蛋白(PerCP) 藻紅蛋白-德州紅偶聯(lián)物(ECD) 別藻青蛋白(APC) 除別藻青蛋白(APC)外,其他熒光染料均采用488nm的激發(fā)光源激發(fā),最大發(fā)射波長分別為525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。 別藻青蛋白(APC)的激發(fā)光源為630nm,

25、最大發(fā)射波長為660nm。2022-2-18 溶血素 使用與儀器相匹配的溶血素(內(nèi)含固定液),并嚴格按照使用說明和注意事項進行操作。如果使用沒有固定作用的溶血劑(如氯化銨和低滲緩沖液等),染色后標本需要保存在4 ,并在1h內(nèi)完成上機 固定液 0.1%-2.0%多聚甲醛或甲醛緩沖液是常用的固定液,用于對感染的標本在分析前進行滅活,能夠滅活HIV 等病毒的3個-5個對數(shù)級的病毒載量。在染色過程中的最后一次離心后,用含有多聚甲醛或甲醛緩沖液(Ph7.0-7.4)處理,4 保存待測。2022-2-1856流式細胞分析儀流式細胞分析儀1973年BD公司公司與Stanford University合作開發(fā)

26、世界上第一臺商用流式細胞儀FACSI。1980年北京師范大學(xué)引進中國第一臺流式細胞儀FACSIII。實驗應(yīng)用 流式細胞儀主要有兩個最基本的用途： 可以定量分析鑒定活細胞表面表達的特異分子， 進行特定的活細胞群的分離和純化。2022-2-18 免疫細胞群的分類 靜止淋巴細胞之間從其外觀形態(tài)難以區(qū)分，都是以致密的核及少量細胞質(zhì)組成的小而圓的細胞為特征。然而，這些細胞確是由功能各異的不同細胞亞群所組成，各種細胞群表達各自特殊的表面分子。 B淋巴細胞上表達有特異的膜表面免疫球蛋白（mIg），而成熟的T淋巴細胞表面表達特異的CD3分子。 T淋巴細胞又可進一步按其表達的不同表面標志細分成不同的亞群，如CD

27、4+CD8-和CD4-CD8+亞群。因此，可由這些特征性的表面標志，將細胞分為不同的群或亞群。2022-2-18 免疫細胞的分化發(fā)育 免疫細胞分化發(fā)育的不同階段，其表面標志也在不斷地發(fā)生著變化。 如胸腺細胞（發(fā)育過程中的T淋巴細胞），在發(fā)育的不同階段從不成熟到成熟，其表面標志經(jīng)歷了從雙陰性（CD4-CD8-）到雙陽性（CD4-CD8-），直到單陽性（CD4+CD8-或CD4-CD8+）的過程。正常生理狀態(tài)下，發(fā)育不同階段的胸腺細胞以一定的比例存在于胸腺中。通過檢測這些標志，即可判定某些因素（基因突變等）對胸腺細胞發(fā)育的影響。2022-2-18 免疫細胞的分子表達 免疫細胞的不同因素的影響下，其表達的分子也會發(fā)生變化。通過檢測這些分子的變化，可分析細胞功能以及細胞分化狀態(tài)等。 靜止的T淋巴細胞不表達或低水平表達CD69分子；而一經(jīng)活化，其表達CD69分子數(shù)量明顯增加。 可通過檢測這些活化標志的變化來判定細胞狀態(tài)以及研究影響細