CellQuestPro軟件

1、第5章 CellQuest Pro軟件5.1 概述CellQuest Pro是從流式細胞儀上進行數(shù)據(jù)獲取和分析的通用軟件。使用者可由CELLQuest Pro軟件來從事儀器之調(diào)整與設(shè)定，可用以進行細胞檢品的檢驗測量，CELLQuest Pro軟件同時是細胞儀的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)內(nèi)的必要軟件。在數(shù)據(jù)分析方面，CELLQuest Pro軟件提供使用者雙色或多色分析功能，可以定量各類細胞族群的百分比，細胞受染的熒光強度，也可以制作一維直方圖、二維散點圖、二維密度圖、二維等高線圖、及三維圖譜，并且可作文字處理的中間插圖，無需再剪貼拼湊，適用于論文發(fā)表，及會議報告使用。CELLQuest Pro軟件功能強大且

2、靈活，并與Macintosh 的多任務(wù)環(huán)境完全兼容。5.1.1 收取 (Acquisition)即收取并儲存流式細胞儀上數(shù)據(jù)的過程。在收取前，需用您的樣本來最佳化儀器的條件。5.1.2 分析 (Analysis)將收取的數(shù)據(jù)進行進一步分析。在分析時，將讀取數(shù)據(jù)文件，然后可畫Region (區(qū))、 設(shè)置Marker (界限)、和進行統(tǒng)計。在CellQuest中，可畫單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點圖、密度圖和等高圖。5.1.3 從收取到分析 (AcquisitionàAnalysis)在CellQuest中，從收取到分析的功能允許在數(shù)據(jù)收取結(jié)束后可從收取圖轉(zhuǎn)換到分析圖。剛剛收取的數(shù)據(jù)及在收取時

3、限定的格式出現(xiàn)在圖中，如Region, Marker 等。5.2 工具欄工具欄在CellQuest Pro軟件啟動后就會出現(xiàn)，見圖一。工具欄可用來畫圖、選擇區(qū)域、設(shè)置標(biāo)尺和輸入文本等。選擇點擊，可選擇一個或多個目標(biāo)，進行改大小或移動。C： 等高圖(Contour Plot)，點擊，可畫等高圖，可自定義圖的大小。3D：3 維圖，點擊，可畫3維圖，可自定義圖的大小。H： 直方圖，點擊，可畫直方圖，可自定義圖的大小。D： 密度圖，點擊，可畫密度圖，可自定義圖的大小。d： 點圖：點擊，可畫點圖，可自定義圖的大小。H：直方圖 marker：點擊，可在直方圖上定位 marker 的左邊界和右邊界。Q：象限

4、 marker：點擊，可在點圖、密度圖和等高圖上定位 marker ?？s?。狐c擊，然后點擊圖，將放大圖縮小到原大小。圖1 工具欄按鈕放大：點擊，然后點擊圖，將縮小圖放大到原大小。R：矩形區(qū)域,點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊，然后拖動對角線至所需 大小。P：多邊形區(qū)域，點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊形成起始點，然后拖動鼠標(biāo) 畫出多邊形頂點并在起始點處點擊完成多邊形區(qū)域 。H：直方圖區(qū)域，點擊，可在直方圖上定位區(qū)域的左邊界和右邊界。E：橢圓形區(qū)域，點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊，然后拖動對角線至所需大小。箭頭，點擊，然后在實驗文件中點擊，拖出直線。文本：點擊，然后點擊定位插

5、入點并編輯文字。公式欄：點擊，出現(xiàn)的對話框中可以輸入客戶定義的數(shù)學(xué)公式，在實驗文檔上出現(xiàn)的結(jié)果也可以添加注釋。計算器：如果自動復(fù)計算關(guān)閉，點擊進行數(shù)據(jù)復(fù)計算。5.3 CellQuest Pro文件類型5.3.1 FCS數(shù)據(jù)文件是流式細胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式數(shù)據(jù)文件。FCS數(shù)據(jù)文件中自動保存了每個微粒所有的參數(shù)信息和對應(yīng)的儀器條件。當(dāng)Aqusition Control 窗口的set up前未打´ 時，進行獲取后自動保存的文件格式。該文件含有從流式細胞儀獲取的平均2000-10000個顆粒數(shù)的數(shù)據(jù)。一個含有4參數(shù)10000細胞數(shù)的數(shù)據(jù)文件若256道分辨率則文件大小為45kb，若1024道分辨率則

6、文件大小為85kb。5.3.2實驗文件實驗中設(shè)置的圖、區(qū)域、門、統(tǒng)計結(jié)果、marker、文字、顏色 等都將保存。數(shù)據(jù)文件不在實驗文件中保存。CellQuest Pro實驗文件的菜單有File菜單下New、open、close、save及save as等(同Microsoft Word)。注意：實驗文件和它的數(shù)據(jù)文件之間存在一定限制。若數(shù)據(jù)文件未改變地址或未被刪除，實驗文件可找到其數(shù)據(jù)文件。若二者聯(lián)系喪失，需將丟失的數(shù)據(jù)文件與其實驗文件放在同一目錄，實驗文件才能找到其數(shù)據(jù)文件。若實驗文件的目錄改變，二者的聯(lián)系不會改變，實驗文件仍可找到其數(shù)據(jù)文件。l 實驗文件可以后打開以恢復(fù)獲取和分析。l 實驗文

7、件可以通用模板儲存以用于常規(guī)獲取和分析。除數(shù)據(jù)文件外所有條件（包括region、gate、statistics）都可以通用模板儲存。l 實驗文件可轉(zhuǎn)化為文具薄。l 在實驗文件中，有3種圖：獲取、分析和獲取到分析。一個實驗文件可含上述3種圖的組合，但獲取圖不能用來分析，分析圖不能用來獲取。5.3.3 儀器條件文件實驗條件文件中包括儀器的電壓，閾值，補償?shù)葍x器條件。這些條件也已經(jīng)自動保存在FCS數(shù)據(jù)文件中的文檔部分。也可以單獨保存成一個儀器條件文件。5.3.4 統(tǒng)計文件所有直方圖、區(qū)域、門和象限統(tǒng)計結(jié)果都可以輸出成表符限制性文檔。這些輸出文件可用于將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到其他應(yīng)用軟件中，如電子表格或數(shù)據(jù)庫。5

8、.4 CellQuest Pro的儀器控制在CellQuest Pro軟件中，儀器的控制選單位于Cytometer菜單中。用CellQuest Pro進行3色分析中，應(yīng)用陰性對照和調(diào)補償用對照進行儀器條件設(shè)置。陰性對照可用不加抗體組或同型對照組。它將用于調(diào)節(jié)FSC、SSC探測器、FSC閾值、設(shè)淋巴細胞區(qū)region、確認FL1/FL2/FL3的設(shè)置及象限設(shè)置。調(diào)補償用對照包括單陽性熒光試劑，如包括下列試劑：CD8 FITC組、CD19 PE組、CD3 PerCP組。調(diào)節(jié)探測器和放大器可使所需信號出現(xiàn)在數(shù)據(jù)圖的適當(dāng)位置。細胞通過激光束時產(chǎn)生光信號，然后轉(zhuǎn)換成電信號，并在散點圖上相對應(yīng)于一個道值。

9、依據(jù)所選的分辨率的不同，道值有0-255、0-1023不同范圍。5.4.1 探測器（Detector）在流式細胞儀中有二種探測器：光電二極管和光電倍增管(PMTs)。 光電二極管對光 的敏感度低于光電倍增管。探測器的調(diào)節(jié)菜單位于Cytometer菜單下Detector/Amps，調(diào)節(jié)窗口如下圖所示。光電二極管用于探測FSC，因為FSC是強信號，可通過電壓而選擇對FSC 信號 的不同放大。E00：將信號放大1(100)倍。E01：將信號放大10(101)倍。E02：將信號放大100(102)倍。E03：將信號放大1000(103)倍。 E-1：將信號放大0.1(10-1)倍。 光電倍增管(PMT

10、s)用于探測SSC、FL1、FL2、FL3, 因為它們是弱信號。 PMTs的電壓調(diào)節(jié) 從150-999。當(dāng)電壓上升時，信號增加，數(shù)據(jù)出現(xiàn)在道值較高處?？赏ㄟ^點擊 ­¯ 來選 擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動(見上圖)。放大器（Amp Gain）：可對信號進行微調(diào)。對FSC、SSC、FL1、FL2、FL3 可設(shè)置放大模式和放大增益。 若放大模式選擇Lin (線性)，放大器的增益可在1-9.99之間調(diào)節(jié)?？赏ㄟ^點擊­¯來選擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。若放大模式選擇Log (對數(shù))，放大器的增益則不可調(diào)節(jié)。對數(shù)常用于分開陰性信號和弱陽性信號。5.4.2閾值 （Thres

11、hold）：可用來設(shè)置低于該道值的數(shù)據(jù)信號不被處理，只有高于閾值道數(shù)的信號才傳送到計算機進行處理。每次只能有一個參數(shù)設(shè)置閾值 (FSC、SSC、FL1、FL2、FL3)。 在免疫表型中，在FSC上設(shè)閾值。在DNA分析中，在FL2上設(shè)閾值。可通過點擊­¯來選擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。5.4.3熒光補償（Compensation）：當(dāng)樣本用2色或3色熒光染色時需調(diào)節(jié)補償以消除光譜重疊。因為熒光素發(fā)射一定波段的熒光，因此在探測某種特定熒光素的探測器上有來源于另一種熒光素的熒光信號。FITC主要出現(xiàn)在FL1探測器上，但也有部分重疊到FL2探測器上。PE主要出現(xiàn)在FL2探測器上，但也

12、有部分重疊到FL1和 FL3探測器上。補償調(diào)節(jié)如下： FL1-FL2： 從FL1探測器上減去重疊的FL2 FL2-FL1： 從FL2探測器上減去重疊的FL1 FL2-FL3： 從FL2探測器上減去重疊的FL3 FL3-FL2： 從FL3探測器上減去重疊的FL2補償調(diào)節(jié)量依賴于探測器的電壓。當(dāng)補償過后的群體與陰性群體一致時，補償調(diào)節(jié)正確。補償調(diào)節(jié)可通過點擊­¯來選擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。5.4.4儀器狀態(tài)（Status）： 在菜單位于Cytometer菜單中。用來在收取的任何時候查看流式細胞儀的運行狀態(tài)，以利解決儀器運行中出現(xiàn)的問題。測試脈沖：在FACSCalibur中可從

13、Status菜單中選擇FSC：僅FSC探測器上產(chǎn)生的信號、或ALL：所有探測器上產(chǎn)生的信號、或OFF。（注意：只在工程人員指示下可啟動此測試信號。）狀態(tài)：顯示儀器運行模式Not Ready：激光器正在預(yù)熱、鞘液桶空、廢液桶滿。Ready：樣本管插在SIP上且支撐臂位于中位(即管下)，樣本管加壓，儀器在RUN狀態(tài)。Standby：儀器在Standby 狀態(tài)或儀器在Run 狀態(tài)而無樣本管在SIP上或支撐臂位于側(cè)位(即不在管下)或樣本管未完全加壓。Standby時儀器的激光器電源降低。激光器電源：以mW表示，在RUN時，為15mW；在Standby 時，為4-6 mW 。激光器電流：顯示激光器電流值

14、，當(dāng)高于某值時，在顯示屏上會出現(xiàn)提示信息。樣本電壓：顯示樣本壓力和鞘液壓力之間的差異。當(dāng)插上樣本管于上樣區(qū)時，樣本壓力和鞘液壓力之間的差異增加，該樣本電壓降低。鞘液：顯示鞘液桶是空或OK。廢液：顯示廢液桶是滿或OK。5.5 CellQuest Pro的視圖 在實驗文件中，可畫圖和作統(tǒng)計圖。它們在顯示上有三種形式：啟動（Activated）：外方框呈灰色。點擊除方框以外的任何地方即可啟動。每次只能啟動一個圖。 任何命令只針對此啟動的圖。被選擇（Selected）： 在每個角出現(xiàn)黑色方框。點擊圖方框即可選擇該圖。一次可選擇多個圖。任何命令可 影響被選擇的圖?？赏ㄟ^下列2種方式選擇多個圖：撳Shif

15、t鍵同時點擊多個圖方框或在實驗文件中點擊任何對角線拖方框包繞欲選的圖。若需全選，可從Edit 菜單中選擇select all。 只要被選圖才可以更改大小、刪除和移動。去選擇（Deselected）：圖方框的每個角無黑色方框。點擊圖外的任何地方即可去選擇。去選擇的圖不受任何命令影響。 5.6 FACSCalibur儀器的調(diào)試在此練習(xí)中，您將：² 建立CellQuest 實驗文件。² 調(diào)節(jié)FSC、SSC探測器和FSC閾值。² 畫淋巴細胞區(qū)、設(shè)門。² 調(diào)節(jié)FL1、FL2、FL3探測器。² 調(diào)節(jié)熒光補償。FACSComp用標(biāo)準(zhǔn)微球調(diào)節(jié)儀器設(shè)置之后需用樣

16、本優(yōu)化儀器設(shè)置。上述優(yōu)化步驟不僅適用于溶解的全血細胞，而且適用于任何感興趣的細胞。必須記住按上述步驟次序進行。為按上述步驟進行優(yōu)化，需準(zhǔn)備下列樣本：Ø 小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。Ø CD3-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。Ø 小鼠IgG1-FITC/CD8-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC。Ø 小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP/小鼠IgG1-APC。Ø 小鼠IgG1-FITC/小鼠I

17、gG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/CD4-APC。5.6.1 建立分析頁面1. 先開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。2. 啟動CellQuest Pro 軟件3. 點擊實驗文件的右上角的放大鈕，將實驗文件窗口放大。4. 從File菜單中選擇Document size: 出現(xiàn)文件大小對話框。5. 點擊黑矩形右邊的矩形，點擊OK。將文件增至二頁。6. 從工具板中選擇點圖：點擊工具板中點圖圖標(biāo)。7. 在實驗文件的空白區(qū)點擊，然后拖動對角線至所需大小。出現(xiàn)點圖對話框。8. 點擊Plot Type(點圖類型)，選擇aqusition(獲取)。9. X和Y軸默認FSC、SSC10.

18、 在顏色框中點擊Multicolor Gating.。門內(nèi)顆粒將出現(xiàn)顏色。11. 點擊OK。出現(xiàn)FSC/SSC點圖。12. 從Acquire菜單中選擇Connect to Cytometer。出現(xiàn)Acqusition Control 對話框。將其拖至空白區(qū)。13. 從Cytometer菜單中選擇Detectors/Amps。出現(xiàn) Detectors/Amps窗口。將其拖至空白區(qū)。14. 從Cytometer菜單中選擇Threshold。出現(xiàn) Threshold 窗口。將其拖至空白區(qū)。5.6.2 調(diào)出儲存的由FACSComp 生成的儀器條件1、從Cytometer 菜單中選擇Instrument

19、 Settings，出現(xiàn)對話框。2、點擊Open，選擇目錄及文件（如：BD Files Instrument SetteingsCalib File），點擊Open3、點擊Set，點擊Done。 調(diào)節(jié)FSC/SSC探測器（電壓）及FSC閾值在FSC/SSC點圖上調(diào)節(jié)FSC放大器增益和SSC電壓是為了將所感興趣的細胞顯示在圖中。調(diào)節(jié)FSC閾值是為了去除碎片和噪音。所有樣本管都可用來調(diào)節(jié)，一般用同型對照管來調(diào)。1使儀器處于RUN，插上同型對照管2點擊Acqusition Control 窗口中的Acquire（注意Setup前需打叉，即不儲存數(shù)據(jù)）3選擇FSC/SSC為LIN（線形放大），將FSC

20、電壓置于E00，調(diào)節(jié)FSC放大器增益；調(diào)節(jié)SSC電壓；調(diào)節(jié)FSC閾值，觀察圖的改變。 設(shè)置淋巴細胞Region該Region在調(diào)節(jié)熒光探測器時使用。1. 在工具板中選擇多邊形的Region。2. 在FSC/SSC點圖上設(shè)淋巴細胞Region，在Region外點擊，將R1拖至空白區(qū)。3. 移去同型對照管，點擊Acqusition Control 窗口中的Pause。 調(diào)節(jié)FL1、FL2、FL3的探測器（電壓）在上同型對照管時，可能需基于門內(nèi)的淋巴細胞調(diào)節(jié)FL1、FL2、FL3的探測器（電壓）。若必要，將這群細胞調(diào)在所有圖的左下角。用于同型對照的抗體為小鼠抗鑰孔嘁血藍素（KLH）。當(dāng)用于測定人的細

21、胞時，所發(fā)生的結(jié)合是非特異結(jié)合?？贵w的這種非特異結(jié)合現(xiàn)象是由于抗體的Fc端與細胞膜上的Fc受體結(jié)合。這和自發(fā)熒光都是背景熒光。特定抗體Fab端與細胞表面上特定抗原的特異結(jié)合所發(fā)的熒光為陽性熒光。若必要，用同型對照管，在所有 熒光點圖上調(diào)節(jié)FL1/2/3的電壓來調(diào)節(jié)背景熒光。1選擇點圖2在出現(xiàn)的對話框內(nèi)選擇X軸：FL1， Y軸：FL23選擇G1=R14點擊OK，F(xiàn)L1/FL2的點圖出現(xiàn)5點擊FL1/FL2點圖的邊框并將之拖至FSC/SSC圖的右側(cè)6同樣建立一個FL3/FL2的點圖，并選擇G1=R1。如獲取4色樣本，進行下一步。如獲 取3色樣本，跳至第8步。7同樣建立一個FL3/FL4的點圖，并選

22、擇G1=R1。若無FL4參數(shù)，請確認Detector/Amps 窗口中Four colour前是否選中。8在工具板中選擇象限標(biāo)尺,在FL1/FL2點圖上 以同型對照管的門內(nèi)細胞畫象限, 這些象限指定了陰性/陽性區(qū)域。9點擊FL1/FL2點圖，拖動Marker的柄將它設(shè)定在101處。10從Status窗口選擇Quadrant Stas（象限統(tǒng)計）。11在其余的圖上，重復(fù)8-10步。12插上同型對照管13點擊Aqusition Control窗口中的Restart。14若必要，調(diào)節(jié)FL1、FL2的電壓（在Detector/Amps 窗口中），使這群細胞調(diào)在所有圖的左下角。調(diào)節(jié)后未調(diào)節(jié)15若必要，調(diào)

23、節(jié)FL3的電壓（在Detector/Amps 窗口中），使這群細胞調(diào)在所有圖的左下角。注意：勿調(diào)節(jié)FL4的PMT電壓，其電壓值有FACSComp設(shè)定。16點擊Aqusition Control窗口中的Pause。17移去同型對照管。18. 關(guān)閉Detector/Amps 和Threshold窗口 調(diào)節(jié)熒光補償優(yōu)化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重疊。若3色樣本，必要時需調(diào)節(jié)FL2-%FL1，F(xiàn)L1-%FL2，F(xiàn)L3-%FL2，F(xiàn)L2-%FL3的補償。若4色樣本，必要時需也要調(diào)節(jié)FL3-%FL4，F(xiàn)L4-%FL3 。選擇適當(dāng)?shù)脑噭┯脕碚{(diào)節(jié)補償很重要。每種熒光素的補償應(yīng)用染色最強的細胞群來設(shè)置。如一個Pane

24、l中有：CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC，則FITC的補償應(yīng)用CD8-FITC來設(shè)置。補償?shù)恼{(diào)節(jié)依賴于由同型對照管設(shè)定的探測器電壓。一旦電壓設(shè)定，補償用單陽性管調(diào)節(jié)。1從Cytometer 菜單中選擇Compensation2插上CD3-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC管。3點擊Aqusition Control窗口中的Restart。4若必要，調(diào)節(jié)FL2-%FL1使FITC+細胞在FL1/FL2點圖的右下象限。5移去此管，插上小鼠IgG1-FITC/CD8-PE/小鼠IgG1-PerCP/小鼠IgG1-APC管。6點擊Aqusi

25、tion Control窗口中的Pause、Restart。7若必要，調(diào)節(jié)FL1-%FL2使PE+細胞在FL1/FL2點圖的左上象限。調(diào)節(jié)后未調(diào)節(jié)8若必要，調(diào)節(jié)FL3-%FL2使PE+細胞在FL3/FL2點圖的左上象限9移去此管，插上小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP/小鼠IgG1-APC管。10查看FL2-%FL3的補償，應(yīng)為0.0%,若必要，調(diào)節(jié)該補償。若作3色，跳至14步。11查看FL4-%FL3的補償，應(yīng)為0.0%,若必要，調(diào)節(jié)該補償。12移去此管，插上小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/小鼠IgG1-PerCP/CD4 -APC管。13查看FL3

26、-%FL4的補償，應(yīng)為0.0%,若必要，調(diào)節(jié)該補償。14關(guān)閉Compensation窗口。15點擊Aqusition Control窗口中的Pause、Abort。16移去樣本管，插上雙蒸水管。17將儀器處于Standby狀態(tài)。5.7 實驗練習(xí)：3色/4色預(yù)獲取在此練習(xí)中，您將：² 設(shè)定Acquisition（獲?。┖?Storage（儲存）的條件。² 設(shè)定文件儲存參數(shù)² 創(chuàng)建試劑組合5.7.1 設(shè)置Acquisition & Storage 窗口在此窗口可設(shè)定獲取和儲存的顆粒數(shù)及類型。也可設(shè)定儲存的參數(shù)及其分辨率。1從Acquire 菜單中選擇Acqui

27、sition & Storage，出現(xiàn)Acquisition & Storage窗口2在Acquisition Gate 中選擇默認設(shè)置：Accept 、All獲取的數(shù)據(jù)首先由獲取的門處理，落在門內(nèi)的所有顆粒被接受或放棄。然后數(shù)據(jù)按Collection Criteria 窗口中的設(shè)置處理。3在Collection Criteria中選擇默認設(shè)置：Event Count，10000，All可設(shè)置獲取終止的條件：Event Count：獲取的顆粒數(shù) Time：獲取時間4在Storage Gate中選擇默認設(shè)置：All5在Resolution （分辨率）中選擇默認設(shè)置：10246點擊

28、Parameter Saved，出現(xiàn)對話框7若無第二根激光器，不選P6（FLX-A）、P7（FLX-W）。只有被選參數(shù)才儲存在Data file中。若3 色分析，F(xiàn)SC-H、SSC-H、FL1-H、FL2-H、FL3-H需儲存。8點擊此對話框的OK9點擊Acquisition & Storage窗口的OK5.7.2 設(shè)置Parameter Description1從Acquire 菜單中選擇Parameter Description，出現(xiàn)Parameter Description對話框。2點擊Directory后的Change鍵，出現(xiàn)對話框，選擇或創(chuàng)建文件夾。3點擊Parameter

29、Description對話框File后的Change鍵 ，出現(xiàn)文件名編輯窗口。5在Custom Prefix中：輸入文件名6在File Name Suffix中選擇File Count7在File Count 中：確認輸入的為18點擊此對話框的OK9在Parameter Description對話框中輸入您想保存的Patient ID，Sample ID，Comments等信息。10選擇或輸入所有參數(shù)名選擇：點擊右側(cè)的箭頭，選擇已設(shè)定的參數(shù)名。輸入：在P1后的空格中輸入?yún)?shù)名。11將Parameter Description對話框拖至適當(dāng)位置以不妨礙視野，勿關(guān)閉。5.7.3 編輯Reagent

30、 Panel編輯 Panel允許您將所定義的試劑進行組合，以便為實驗的每管自動選擇參數(shù)名?？删庉?色或4色的Panel。3色Panel：小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP 4色Panel：小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP/小鼠IgG1-APC CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC CD3-FITC/ CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC1從Acquire 菜單中選

31、擇Edit Panel，出現(xiàn)Edit Panel對話框2點擊Panel 上的Add，new panel 就出現(xiàn)在Panel list 中，輸入panel 名3選擇該panel（變黑），點擊Tube 上的Add，Tube1就出現(xiàn)在tube list中，輸入tube 名4選擇該tube（變黑），在label list 中為該管選擇參數(shù)名：如：P1：Forward ScatterP2：Side ScatterP3：Mouse IgG1 FITCP4：Mouse IgG1 PEP5：CD45-PerCPP7：Mouse IgG1 APC（若4色）5點擊Tube 上的Add，Tube2就出現(xiàn)在tube

32、list 中，輸入tube 名（如：3/8/45）6重復(fù)第4步。點擊OK7可在Parameter Description對話框中選擇剛剛編輯的試劑Panel。5.8 實驗練習(xí)：數(shù)據(jù)獲取在此練習(xí)中，將獲取數(shù)據(jù)。此前已用樣本細胞優(yōu)化過條件，獲取和儲存的門及顆粒數(shù)已設(shè)定、文件的儲存已設(shè)定。1從Acquire 菜單中選擇Counter，出現(xiàn)Counter計數(shù)框。2在Acqusition Control窗口 中不選Setup。3使儀器處于RUN狀態(tài)。4插上第一管（同型對照管），快速將支撐臂復(fù)位。5點擊Acqusition Control窗口 中Acquire6該管獲取完后，會出現(xiàn)“嘟”聲，然后插上下一管

33、（在Reagent Panel中也為第 二管）7重復(fù)5-6步，直到Reagent Panel中最后一管。8選擇Acqusition Control窗口 中的Setup。9使儀器處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Acqusition Control窗口和Counter計數(shù)框。5.9 儲存、恢復(fù)儀器設(shè)置優(yōu)化后的儀器設(shè)置條件可儲存以備以后重新設(shè)置和打印。可從Cytometer菜單中選擇Instrument Setting。5.9.1 儲存儀器設(shè)置1從Cytometer菜單中選擇Instrument Setting。出現(xiàn)Instrument Setting窗口。2點擊save，出現(xiàn)文件保存對話框，選擇文件目

34、錄及文件名，點擊save。3在Instrument Setting窗口中點擊Done。5.9.2 恢復(fù)儀器設(shè)置1從Cytometer菜單中選擇Instrument Setting。出現(xiàn)Instrument Setting窗口。2點擊open，出現(xiàn)文件打開對話框，選擇文件目錄及文件名，點擊open。3在Instrument Setting窗口中點擊Set、Done。5.10 儲存實驗?zāi)０逦募贑ellQuest Pro中，您設(shè)置的含有圖、門、標(biāo)尺（Marker）和統(tǒng)計的實驗文件可以模板文件儲存，以后可打開進行數(shù)據(jù)獲取和分析。從File菜單中選擇save，出現(xiàn)文件保存對話框，選擇或創(chuàng)建文件目錄及文

35、件名，點擊save。5.11 練習(xí)：數(shù)據(jù)分析在每管中增加第二、三、四色可增加獲得的信息并降低獲取的管數(shù)。如聯(lián)合CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC在一管，CD3-FITC/ CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC在第二管，即可評價%T細胞、%Th、%Ts、%NK、%B等。若二色分析，則需6管。在此練習(xí)中，您將：Ø 用CD45設(shè)淋巴細胞門Ø 用點圖分析3色、4色數(shù)據(jù)Ø 在CellQuest Pro使用批分析Ø 生成一個含統(tǒng)計分析的輸出文件Ø 將分析文件以模板形式保存5.11.1 畫Region

36、CD45表達在所有白細胞表面，淋巴細胞表達最強。當(dāng)CD45/SSC作圖時，淋巴細胞可與溶解的紅細胞、碎片、嗜堿粒細胞很好地區(qū)分開來。1創(chuàng)建一個新的CellQuest Pro實驗文件（File菜單下的New）2從工具板中選擇點圖，出現(xiàn)點圖對話框3點擊Select File，選擇一定目錄下的第一管的數(shù)據(jù)文件：3色：小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP4色：小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE/CD45-PerCP/小鼠IgG1-APC4X軸參數(shù)：FL3-H， Y軸參數(shù)：SSC-H5點擊Multicolor gating 6點擊OK 7在淋巴細胞群上畫一個多邊形的R

37、egion。8重復(fù)2-3步；9X軸參數(shù)：FL1-H， Y軸參數(shù)：FL2 H10選擇G1=R111點擊Multicolor gating ，OK5.11.2 限定象限marker1. 在小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE（同型對照）的FL1-H/FL2-H點圖上設(shè)定象限marker（），使得門內(nèi)細胞群在左下象限。2. 使該點圖處于激活狀態(tài)，從Stats 菜單中選擇Quadrant Stats（象限統(tǒng)計）。該點圖分為4個象限，UL：左上，僅FL2+UR：右上，F(xiàn)L1+和FL2+ LL：左下，F(xiàn)L1-和FL2-LR：右下，僅FL2+小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-PE（同型對照）的FL

38、1-H/FL2-H點圖上，幾乎所有的細胞應(yīng)在LL象限。3. 若需要，可編輯象限統(tǒng)計的內(nèi)容，從Stats 菜單中選擇Edit Quadrant Stats。5.11.3 分析四色1. File菜單下的選擇文件大小,文件大小對話框出現(xiàn)。2. 垂直或水平點擊鄰近的空白四邊形，點擊OK，文件成2頁。3. 創(chuàng)建一個FL1-H/FL4-H點圖（小鼠IgG1-FITC/小鼠IgG1-APC）4. 設(shè)定象限marker，使得同型對照管門內(nèi)細胞群在左下象限。5. 使該點圖處于激活狀態(tài)，從Stats 菜單中選擇Quadrant Stats（象限統(tǒng)計）。5.11.4 批分析其余數(shù)據(jù)1. 從Batch菜單中選擇Set

39、up，出現(xiàn)Batch Setup對話框。2. 在Plot and Stats to Process框中選擇ALL在Pause after each file increment 框中選擇for -seconds，輸入5選擇Print after each file increment 選擇Export Statisticnew file（選擇或創(chuàng)建目錄及文件名）選擇 File increment ：13. 點擊OK，從Batch菜單中選擇RUN，出現(xiàn)Batch Control框。5.11.5 分析數(shù)據(jù)在此部分，將計算淋巴細胞、T細胞、B細胞、NK細胞的百分數(shù)。1從同型對照管的FL1-H/FL2

40、-H點圖上得出門內(nèi)細胞%LL（左下象限）。若 4色，從同型對照管的FL1-H/FL4-H點圖上得出門內(nèi)細胞%LL（左下象限）。2從第二管的數(shù)據(jù)中得出CD3+細胞百分數(shù)，CD3+CD8+Tc細胞百分數(shù)若4色，從第二管的數(shù)據(jù)中可得出CD3+CD4+Th細胞百分數(shù)3從第三管的數(shù)據(jù)中得出CD3-CD16+56+NK細胞百分數(shù)若4色，從第三管的數(shù)據(jù)中可得出CD19+B細胞百分數(shù)5.11.6 將分析文件以模板形式保存通用模板可用于常規(guī)獲取或分析，所有條件包括region、marker、statistic等都儲存下來。1點擊點圖，從Plot 菜單中選擇Format dot plot，出現(xiàn)點圖對話框，選擇No

41、 file，點擊OK。2用同樣方法將其余點圖都改成No file。3從File 菜單選擇Save as，輸入模板名，點擊Save。5.11.7 創(chuàng)建文具簿（stationery pad）實驗文件可轉(zhuǎn)化為文具簿 ，可反復(fù)用作相同的文件。1選擇目錄和模板2從File 菜單選擇Get info，所選模板的info 窗口出現(xiàn)。3在右下角選擇stationery pad。4關(guān)閉info 窗口。此時，文件圖標(biāo)變成文具簿圖標(biāo)，當(dāng)您打開文具簿文件時，原文件不變，而生成一個備份。5.11.8 將統(tǒng)計改為電子表格將在分析中儲存的輸出文件改為電子表格。1從Apple 菜單中選擇Microsoft Excel，一張空

42、白表格將出現(xiàn)。2從File 菜單選擇Open，出現(xiàn)對話框。3選擇統(tǒng)計文件的目錄及文件名，并打開。4在Text Import Wizard窗口，點擊finish，查看結(jié)果。5從File 菜單選擇Quit。5.12 Regions 和Gating（畫門）Region是將某一群體細胞區(qū)分開以分析或分選。有4種Region：長方形、橢圓形、多邊形及直方圖Region。5.12.1 設(shè)置Region 1選擇文件目錄及文件名。2在工具板中選擇適當(dāng)形式的Region，在FSC/SSC點圖上將淋巴細胞圈上。3將Region的符號R1移至Region旁。5.12.2 改變Region須首先選擇Region（在R

43、egion邊界上任何處點擊），然后才能改。 重新定義Region大小 ：在Region邊界上點擊一次，在Region的4角各出現(xiàn)一個柄點，點擊并沿X或Y軸拖動即可。 重新定位Region：點擊并拖動Region的邊界即可旋轉(zhuǎn)Region：先選擇Region，然后從Gate 菜單中選擇Rotate Region，拖動Region的柄點即可旋轉(zhuǎn)。從Gate 菜單中選擇Stop Rotate Region即可停止。重新定位頂點：改變多邊形Region的一種方法。在Region邊界上雙擊，或在Region邊界上點擊一次、然后從Gate 菜單中選擇Edit Ploygon。點擊并拖動Region的頂點即

44、可。從Gate 菜單中選擇Stop Edit Region即可停止。刪除Region：在點圖上選擇Region，然后撳DEL鍵或從Edit 菜單中選擇clear即可。但要真正刪除Region，必須從Gate 菜單中選擇Region List中刪除。Region的復(fù)制、粘貼也從Region List中進行。 5.12.3 用Region 統(tǒng)計來分析數(shù)據(jù)1在FSC/SSC點圖上設(shè)一多邊形淋巴細胞Region，為R1。2設(shè)一橢圓形單核細胞Region，為R2。3設(shè)一長方形粒細胞Region，為R3。4激活點圖，從Stats菜單選擇Region Stats（Region 統(tǒng)計）。5.12.4 門門由一

45、個或多個Region組合而成。設(shè)門可以限定分析或分選的細胞群。在CellQuest Pro 中，默認G1=R1，G2=R2，但可以根據(jù)需要設(shè)定合適的門。 反向設(shè)門：反向設(shè)門可以用于顯示在某一圖上的細胞群在另一圖上的位置。在熒光圖上畫一Region，用該Region在另一圖（常常是FSC/SSC）上的位置。1在FL1/FL2點圖中，在CD3-CD4+細胞群上畫R4.2激活FSC/SSC點圖，從Plot菜單上選擇Format Dot Plot3在對話框中選擇G4=R4，點擊OK，可觀察在FSC/SSC上R4細胞所在位置。5.12.5 多色門 1激活FSC/SSC點圖，從Plot菜單上選擇Format Dot Plot 2在對話框中選擇Multicolor Gating，選擇No gate，點擊OK，3 在另外二個點圖上重復(fù)1、2步，點圖上淋巴細胞呈紅色、單核細胞呈綠色、粒細胞呈橘黃色。4從Gate 菜單中選擇Gate list，為G1選擇黃色，關(guān)閉此對話框，可見淋巴細胞呈黃色。更改Gate list中門的次序：門內(nèi)細胞群的顏色是依Gate list中的門的次序而定，可更改Gate list