胡真真-英語(yǔ)翻譯中

1、萬(wàn)古毒素鍵合硅膠整體柱的制備及其在毛細(xì)管電色譜中的應(yīng)用董曉莉，董靖，歐俊杰，朱巖，鄒漢法 固定硅膠載體是作為手性固定相，以分離對(duì)映體的中央大環(huán)抗生素萬(wàn)古霉素。單片石英毛細(xì)管柱的制備是采用溶膠 - 凝膠過程在一個(gè)內(nèi)徑為50毫米的石英毛細(xì)管內(nèi)，然后在對(duì)萬(wàn)古霉素作為一個(gè)手性拆分還原胺化原位的固定化。通過對(duì)映選擇性在非水極性有機(jī)或水的流動(dòng)相中得到了八個(gè)對(duì)映體，其中大部分是高柱效基線分離。有人指出，極性有機(jī)流動(dòng)相（甲醇/乙腈）中的有機(jī)調(diào)節(jié)劑比例控制分辨率和對(duì)映體的效率起到了重要的角色。普萘洛爾對(duì)映體的分離，在無(wú)水流動(dòng)相的柱效和分辨率的可重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1-2.3（N= 5）的行與行注射和7.2-

2、9.6（N= 5）。沙利度胺在水溶液中的流動(dòng)相為柱與柱的測(cè)試分離的可重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1.5，2.8和6.1，10.5。關(guān)鍵字：毛細(xì)管電色譜、拆分對(duì)映體、硅膠整柱、萬(wàn)古毒素DOI 10.1002、elps.2006006051 前言目前，微柱技術(shù)的發(fā)展解決了常規(guī)液相技術(shù)難以解決的問題，具有低進(jìn)樣量，低固定相和流動(dòng)相消耗量，環(huán)保，易于和質(zhì)譜聯(lián)用等特點(diǎn)，因此它已 成為分離科學(xué)研究中的熱點(diǎn)和趨勢(shì)。在手性拆分上的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，例如微柱液相（CLC）40, 148-150、毛細(xì)管電泳（CE）151-156和毛細(xì)管電色譜（CEC）48, 90, 157-164；其中CEC在手性分離上的應(yīng)用尤為突

3、出。CEC 既具有電泳的高效性，亦具有高效液相色譜的高選擇性，成為近幾年發(fā)展最為迅速的色譜技術(shù)，逐漸成為當(dāng)代色譜學(xué)發(fā)展的一個(gè)新方向。很多在液相色譜中應(yīng)用的手性固定相，都已通過電色譜柱技術(shù)應(yīng)用于電色譜中。毛細(xì)管電色譜柱的制備是CEC的心臟，而原位制備的毛細(xì)管整體柱（monolithic column）是CEC中的熱點(diǎn)研究課題。這種色譜柱制備方法簡(jiǎn)單，由于使用的聚合方法中的功能單體多樣化，因此該類柱種類豐富多彩，可根據(jù)需求不同制備出滿足條件的整體柱。此外，毛細(xì)管整體柱還可以避免制作塞子的麻煩，并克服塞子易產(chǎn)生氣泡的不足。目前已有很多手性毛細(xì)管整體柱用于1 / 25CEC分離的報(bào)道50, 66, 1

4、65。作為一類重要的整體柱類型，硅膠整體柱在繼承了硅膠基質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度好，柱效高，壽命長(zhǎng)，表面積大和易于化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，還由于具有獨(dú)立可控的通孔和中孔結(jié)構(gòu)而克服了填充柱柱壓過大的不足，且其非手性特異性作用小，是手性固定相優(yōu)良的載體介質(zhì)，在手性分離中有著廣泛的應(yīng)用。目前，應(yīng)用在硅膠整體柱上的手性固定相包括蛋白類30, 107, 108, 166，環(huán)糊精類111，離子交換型114，配體交換型49, 50和纖維素類110, 167。大環(huán)抗生素是Armstrong等人32首次將其引入到手性固定相作為選擇試劑，它的選擇性較高，成為一類重要的且新興的手性選擇試劑。其發(fā)展極為迅速, 在高效液相色譜(HPL

5、C)、薄層色譜( TLC)、毛細(xì)管電泳(CE)、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜(CE-MS)和毛細(xì)管電色譜(CEC)等都有廣泛應(yīng)用，對(duì)其分離機(jī)理的研究也逐步深入168, 169。近年來(lái)它們也成為CEC分離中具有良好應(yīng)用前景的手性選擇試劑97, 170-174，其手性作用機(jī)理是：這些物質(zhì)具有多個(gè)能夠形成氫鍵的手性中心，還存在較多的芳香基團(tuán)，此外其立體結(jié)構(gòu)是一個(gè)大空腔結(jié)構(gòu)，這些都是手性識(shí)別賴以存在的必備條件；大環(huán)抗生素能夠廣泛應(yīng)用的另外一個(gè)重要因素即其溶解性好。它既具有疏水基團(tuán)，又具有親水基團(tuán)，因此易溶于緩沖溶液，微溶于有機(jī)溶劑，這對(duì)于其修飾到手性介質(zhì)形成CSP提供了方便。此外，它們?cè)贑EC 緩沖溶液中具有足夠的

6、穩(wěn)定性。其中萬(wàn)古霉素是抗生素中手性選擇能力最強(qiáng)的抗生素之一97, 172-174，并且常被鍵合到硅膠顆粒表面然后填充到毛細(xì)管中用于CEC研究。填充柱雖然柱容量大，但是制備復(fù)雜，且在CEC分離中容易產(chǎn)生氣泡，因而它們的應(yīng)用受到限制。Kornysova等人將鍵合萬(wàn)古霉素的聚丙烯酰胺整體柱用于CEC手性藥物分離137, 175，但其手性識(shí)別能力卻不盡如人意，只有四種藥物能被拆分。而目前還沒見到過采用萬(wàn)古霉素鍵合的硅膠整體柱用于CEC分離的報(bào)道。利用溶膠-凝膠（sol-gel）技術(shù)制備的硅膠整體柱具有滲透性好，表面積大，機(jī)械強(qiáng)度高，柱壽命長(zhǎng)等點(diǎn)，并且易于改性。因此我們認(rèn)為采用毛細(xì)管硅膠整體柱作為萬(wàn)古霉

7、素CSP的載體能夠充分利用硅膠整體柱良好的骨架結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步提高其手性選擇性及柱床穩(wěn)定性。在本章工作中，我們將萬(wàn)古霉素化學(xué)鍵合到毛細(xì)管硅膠整體柱整體柱表面，并成功地將其用于CEC手性分離。2 材料與實(shí)驗(yàn)2.1實(shí)驗(yàn)部分2.1.1藥品與試劑試劑：正硅酸甲酯（TMOS）購(gòu)自武漢大學(xué)化工廠（武漢）。聚乙二醇（PEG, Mn=10,000）購(gòu)自Aldrich 公司（Milwaukee, WI, USA）。3縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷購(gòu)自Sigma-Aldrich（Gillingham，Dorset，英國(guó)）；尿素購(gòu)自華美生物工程公司；萬(wàn)古霉素購(gòu)于新昌制藥廠。甲醇及乙腈為色譜純；磷酸氫二鈉(分析純，上海新華化

8、工廠)，磷酸二氫鈉(分析純，沈陽(yáng)試劑三廠)，甲醇(分析純)，乙腈(色譜純)，其它所用樣品均為分析純。所有實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA)超純水凈化裝置制備。安息香（benzoin），吲噠帕胺（indapamide）， 托格爾堿（Trgers base），吡喹酮（praziquantel），阿普洛爾（alprenolol）,阿替洛爾（atenolol），美托洛爾（metoprolol），特布他林（terbutaline），吲哚洛爾（pindolol），普萘洛爾（propranolol），華法令（warfarin）和酮基布洛芬（ketoprofe

9、n）購(gòu)自Sigma公司（St. Louis, MO, 美國(guó)）；聯(lián)苯類化合物DDB和DDBA由劉月啟博士提供；四氫巴馬亭（tetrahydropalmatine），雷諾嗪（ranolazine），羥嗪（hydroxyzine）由中國(guó)生物樣品檢定所提供。設(shè)備：Waters 510液相色譜泵(Waters公司，USA)用于沖洗毛細(xì)管柱。恒溫水浴鍋（龍口市科學(xué)儀器公司，中國(guó)）用于加熱毛細(xì)管。氣相色譜儀(依利特公司，大連)用于加熱毛細(xì)管。顯微鏡 XSP-16A用于觀察毛細(xì)管柱。流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液-乙腈。所有溶液均用超純水配制，用0.45 m濾膜過濾。材料:毛細(xì)管為50mm I.D.375mm O.D

10、.熔融石英毛細(xì)管，購(gòu)于河北永年光導(dǎo)纖維廠。2.1.2 毛細(xì)管內(nèi)壁的預(yù)處理首先用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗石英毛細(xì)管30 min，然后用去離子水沖洗10min；接著用0.1 mol/L HCl溶液沖洗毛細(xì)管2 h，再用去離子水沖至流出液為中性；最后用甲醇沖洗10 min，并用氮?dú)獯蹈?。圖2.1 對(duì)映體化合物的結(jié)構(gòu)式Fig 2.1 Structures of the tested enantiomers2.1.3 毛細(xì)管硅膠整體柱的制備毛細(xì)管硅膠整體柱的制備參考文獻(xiàn)176的方法。具體過程是：首先將0.88克PEG、0.90克尿素溶于10 mL醋酸溶液（約0.01 mol/L）中，在冰浴中

11、緩慢滴加4.4 mL正硅酸甲酯，攪拌45 min，可觀察到成均一透明的溶膠；然后將此溶膠注入預(yù)處理好的毛細(xì)管中，兩端用橡膠密封后放入40的水浴過夜；再將其置于120的氣相色譜柱溫箱中，使其中的尿素分解成氨，在氨的作用下完成整體柱中孔結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，再依次用水、甲醇沖洗，在室溫下緩慢干燥；待徹底干燥后將整體柱置于氣相色譜柱溫箱中，以1/min 的速率從室溫升到110，保持90min，繼續(xù)以1/min的速率升到330保持900min，除去其中的有機(jī)成分。2.2毛細(xì)管硅膠整體柱表面鍵合萬(wàn)古霉素鍵合反應(yīng)過程如圖 2.2.1所示。先用0.1 mol/L HCl 溶液沖洗毛細(xì)管硅膠柱3 h，接著用去離子水沖至

12、流出液為中性，再用甲醇沖洗10 min，最后用氮?dú)獯蹈?。量?0L的3縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（3-GPTS），溶于200L的無(wú)水甲苯中，將此反應(yīng)液裝入氣壓罐中，用氮?dú)鈮毫κ蛊涑錆M整根硅膠整體柱，然后將此毛細(xì)管柱置于110的氣相色譜儀柱溫箱內(nèi)反應(yīng)10 h，待反應(yīng)完成后用甲醇沖洗30 min，通氮?dú)獯蹈?。為了將環(huán)氧官能團(tuán)進(jìn)一步反應(yīng)得到具有高反應(yīng)活性的醛基，需要將其開環(huán)得到二醇，具體方法為：先用10 mM的HCl 溶液沖洗毛細(xì)管硅膠柱6 h，接著用去離子水沖至流出液為中性，然后將70 mM的高碘酸鈉溶液（溶劑為水/甲醇，4/1，v/v）充分浸潤(rùn)柱床并于室溫下反應(yīng)2 h，反應(yīng)完后用去離子水充分沖洗

13、。至此，環(huán)氧轉(zhuǎn)化醛基的過程已完成。將一定量的萬(wàn)古霉素溶于50 mM的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）中，然后用注射器將此溶液注入表面已生成醛基的硅膠整體柱（長(zhǎng)度為20 cm）中，兩端用橡膠塞密封，室溫反應(yīng)6h。鍵合完成后，由于硅膠整體柱表面仍殘留大量的醛基，故進(jìn)一步采用10 mM的硼氰化鈉溶液沖洗柱床2 h，將殘留的醛基還原成羥基，然后用流動(dòng)相充分平衡1 h待CEC評(píng)價(jià)。圖2.2.1 毛細(xì)管硅膠整體柱鍵合萬(wàn)古霉素的制備過程示意圖Fig 2.2.1 Schematic representation of preparation procedures of vancomycinderivatized

14、 silica monolithic column. (1) Open-tubular capillary; (2) silica monolith; (3) silanols on the surface of silica monolith; (4) glycidylation on the surface of silica monolith; (5) formation of aldehyde group on the surface of silica monolith; (6) formation of vancomycin immobilized silica monolith.

15、在這里值得一提的是，用CEC評(píng)價(jià)該固定相時(shí)發(fā)現(xiàn)被測(cè)試的對(duì)映體化合物的響應(yīng)都很低，檢測(cè)靈敏度低不利于本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行。這是由于本法制備的鍵合萬(wàn)古霉素硅膠整體柱的柱床表面存在大量的萬(wàn)古霉素分子，而它是一種強(qiáng)紫外吸收的物質(zhì)，因此導(dǎo)致柱上紫外檢測(cè)時(shí)響應(yīng)太低。而且硅膠基質(zhì)的整體柱在制作檢測(cè)窗口時(shí)不能采用灼燒的辦法將窗口的固定相除去。在本工作中，為了解決硅膠整體柱上檢測(cè)靈敏度低的問題，我們利用Teflon的接頭將16 cm長(zhǎng)的鍵合萬(wàn)古霉素的硅膠柱與一段15 cm長(zhǎng)的空毛細(xì)管連接，然后將空毛細(xì)管有效長(zhǎng)度處用刀片刮去毛細(xì)管外壁的聚酰亞胺涂層1-2 mm，制成電色譜柱檢測(cè)窗口(如圖2.2.2所示)。將毛細(xì)管柱裝入

16、毛細(xì)管電泳儀的卡盒之后，按分離要求切去兩端多余毛細(xì)管。Teflon tubingDetection window圖2.2.2毛細(xì)管柱檢測(cè)窗口示意圖Fig 2.2.2 Schematic representation of new prepared vancomycin monolith coupled with fused silica capillary2.3 電色譜實(shí)驗(yàn)電色譜實(shí)驗(yàn)在P/ACETM System MDQ (Beckman, Fullerton, CA, USA)上完成。檢測(cè)器為紫外二極管陣列檢測(cè)器（UV-PDA），色譜柱的總長(zhǎng)為31 cm，有效長(zhǎng)度為16 cm，通過一個(gè)Tef

17、lon的接頭與一段15 cm長(zhǎng)的空管相連接，內(nèi)徑都是50 m。實(shí)驗(yàn)前先用流動(dòng)相沖洗30 min，用電壓平衡時(shí)，在開始的10 min內(nèi)電壓緩慢地從0 V增加到10 kV，然后電壓穩(wěn)定在10 kV。選用丙酮為死時(shí)間標(biāo)記物。采用電動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間為1 s，進(jìn)樣電壓為5 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，操作電壓5-25 kV。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的容量因子（k1，第一個(gè)流出的對(duì)映體），手性分離因子（），分離度（Rs）以及柱效（N1，plates/m）的計(jì)算公式如下： 其中t1，t0分別為樣品第一個(gè)流出峰的保留時(shí)間和分離系統(tǒng)的死時(shí)間；w1，w2分別為兩個(gè)對(duì)映體峰的半峰寬；L為色譜柱長(zhǎng)度（cm）3 結(jié)果與討論3.1整體

18、柱的表征圖1是在內(nèi)徑為50 m毛細(xì)管中制成硅膠整體柱橫截面的掃描電鏡圖。從圖中可以清楚看出硅膠整體柱具有均勻連續(xù)的網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)，硅膠床層既具備大的貫穿孔（ 2 m），提供硅膠整體柱的高滲透性；在骨架的表面還存在許多中孔，它是整體柱高比表面積的保證，而這是提高手性分離度的重要因素。此外還可以觀察到床層通過化學(xué)鍵鍵合牢牢的連接在毛細(xì)管內(nèi)壁上，這為整體柱的穩(wěn)定性提供了保證。(a)(b)圖 1 鍵合萬(wàn)古霉素硅膠整體柱的電鏡掃描圖Fig 1 SEM photographs of monolithic silica inside a capillary at magnifications of (a) 1

19、500 and (b) 5000.在萬(wàn)古霉素鍵合的硅膠整體柱的性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，首先考察了電壓對(duì)電流的影響，結(jié)果如圖2所示。在流動(dòng)相為MeOH/ACN/HAc/TEA（80/20/0.1/0.1, v/v/v/v）的條件下，當(dāng)電壓由1 kV增大到20 kV時(shí)，電流也隨之線性增大（相關(guān)系數(shù)為0.9990）。該結(jié)果表明在此電色譜條件下柱內(nèi)的焦耳熱可忽略不計(jì)，這為快速分離提供了保障。圖2 萬(wàn)古霉素鍵合毛細(xì)管硅膠整體柱電流和分離電壓的關(guān)系Fig 2 Dependence of applied voltage on the current. Experimental conditions: Experim

20、ental conditions: column, a 16 cm 50 m ID monolithic silica column modified with 10 mg/mL vancomycin attached to a 15 cm 50 m ID empty fused-silica capillary via a Teflon-tubing union; mobile phase, MeOH/ACN/HAc/TEA (80/20/0.1/0.1, v/v/v/v)； applied voltage, 10 kV; injection, 5 kV 1 s.電滲流是評(píng)價(jià)一根電色譜柱的第

21、一要素。制備的萬(wàn)古霉素固定化硅膠整體柱在極性有機(jī)流動(dòng)相（MeOH/ACN/HAc/TEA, 80/20/0.1/0.1, v/v/v/v）的條件下，產(chǎn)生由陽(yáng)極到陰極的電滲流，以丙酮作為電滲流標(biāo)記物測(cè)得EOF達(dá)1.2310-4 cm2V-1s-1，在極性有機(jī)流動(dòng)相的環(huán)境下該EOF可認(rèn)為是較大的。連續(xù)五次進(jìn)丙酮樣品考察整體柱的穩(wěn)定性，測(cè)得其保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于0.82，說明保留值重現(xiàn)性良好，萬(wàn)古霉素硅膠整體柱具有可靠的穩(wěn)定性。另外，還對(duì)制備的整體柱在反相模式的流動(dòng)相（含20乙腈的10 mM磷酸三乙胺緩沖液，pH6.5）條件下，測(cè)得其EOF大小為1.3810-4 cm2V-1s-1，

22、連續(xù)五次測(cè)得的RSD為0.75，綜上所述，我們制備的萬(wàn)古霉素硅膠整體柱無(wú)論在極性有機(jī)模式還是反相模式下都能產(chǎn)生較高的電滲流，而且重現(xiàn)性良好，為該整體柱手性固定相能夠在CEC中進(jìn)行評(píng)價(jià)提供了必要的前提。3.2 鍵合條件的優(yōu)化為了將萬(wàn)古霉素固定在50 m內(nèi)徑的毛細(xì)管硅膠整體柱表面，首先在其表面先鍵合一層含環(huán)氧官能團(tuán)的硅烷化試劑，然后將其酸化氧化成醛基，醛基可以和萬(wàn)古霉素上的伯氨基發(fā)生還原反應(yīng)，得到鍵合了萬(wàn)古霉素的硅膠整體柱。為了獲得更好的穩(wěn)定性，重復(fù)性以及分離能力，我們對(duì)鍵合反應(yīng)中萬(wàn)古霉素的反應(yīng)濃度進(jìn)行了考察。分別采用5 mg/mL，10 mg/mL 和15 mg/mL的萬(wàn)古霉素反應(yīng)液和已衍生醛基

23、的硅膠整體柱進(jìn)行柱上反應(yīng)，然后分別考察了在所制備的電色譜柱上對(duì)映體化合物的拆分。圖2.6列出了propranolol和alprenolol分別在5 mg/mL，10 mg/mL和15 mg/mL萬(wàn)古霉素反應(yīng)液改性的電色譜柱上的分離圖。從圖中可以看出，對(duì)映體的保留時(shí)間和分離度都隨萬(wàn)古霉素反應(yīng)濃度的增大而增大，但是當(dāng)反應(yīng)濃度一再提高到15 mg/mL時(shí)，保留時(shí)間和分離度的變化甚微，說明此時(shí)萬(wàn)古霉素的鍵合量已經(jīng)達(dá)到飽和。由于硅膠整體柱上的醛基位點(diǎn)也有限，一味提高萬(wàn)古霉素的濃度來(lái)增大鍵合量反而浪費(fèi)樣品量。綜上所述，利用還原胺化反應(yīng)來(lái)固定萬(wàn)古霉素時(shí)，反應(yīng)濃度采用10 mg/mL即可。 圖2.6 prop

24、ranolol和alprenolol在不同電色譜柱上的分離譜圖Fig 2.6 Electrochromatograms for separation of propranolol (a) and alprenolol (b) on different columns. Experimental conditions: column, 16 cm 50 m ID monolithic silica column modified with 5 mg/mL (1), 10 mg/mL (2) or 15 mg/mL (3) vancomycin solution attached to a 15

25、cm 50 m ID empty fused-silica capillary via a Teflon-tubing union; applied voltage: 10 KV；injection, 5 kV 1 s;2.2.3 極性有機(jī)模式和反相模式拆分對(duì)映體極性有機(jī)流動(dòng)相的首次應(yīng)用是在HPLC的CD177和抗生素32的手性固定相上。在無(wú)水極性有機(jī)環(huán)境下，一些非手性選擇性的相互作用特別是疏水相互作用都能被大大減弱。因此，在這種模式下的手性選擇性往往比反相模式下的高，特別適用于有機(jī)聚合物基質(zhì)的手性固定相。極性有機(jī)流動(dòng)相往往是以氫鍵作用較弱的乙腈為主要溶劑，另外輔以甲醇，三乙胺或醋酸為改進(jìn)添加

26、劑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在大環(huán)抗生素的手性固定相上，低乙腈高甲醇結(jié)合少量醋酸和三乙胺的流動(dòng)相更有利于手性拆分173。另外，此種流動(dòng)相和反相流動(dòng)相相比會(huì)導(dǎo)致較低的電流，因此在CEC應(yīng)用中能盡可能避免氣泡的產(chǎn)生，使得評(píng)價(jià)能夠順利進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)首先采用極性有機(jī)相模式考察萬(wàn)古霉素鍵合的硅膠整體柱的手性拆分能力，所用流動(dòng)相條件和結(jié)果等色譜數(shù)據(jù)列于表2.1。在所測(cè)試的八種對(duì)映體中，有六種為堿性藥物，它們是一類用于治療高血壓的受體阻滯劑。從表中可以看出制備的萬(wàn)古霉素手性固定相具有較好的手性識(shí)別能力。六種堿性藥物在極性有機(jī)流動(dòng)相條件下都能實(shí)現(xiàn)基線分離且達(dá)到了很高的柱效，最高可達(dá)217000塔板數(shù)/米。萬(wàn)古霉素鍵合的硅膠

27、整體柱分離-阻滯劑的典型電色譜圖如圖2.7所示，它們均能夠被基線分離，而且分析速度快，6 min之內(nèi)全部完成分離。該六種堿性藥物的pKa都大于9，在現(xiàn)有流動(dòng)相下都帶正電荷，它們的電泳方向和電滲流方向是一致的，因此它們的出峰都在死時(shí)間之前。這說明在該整體柱上的手性分離中，電泳機(jī)理也起著一定的作用。傳統(tǒng)的HPLC中，萬(wàn)古霉素手性固定相拆分-阻滯劑也很常見150, 178，但是它存在分離時(shí)間過長(zhǎng)，拖尾嚴(yán)重以及系統(tǒng)平衡時(shí)間過長(zhǎng)等缺陷。而在本實(shí)驗(yàn)中，六個(gè)-阻滯劑都能獲得很好的拆分，并且分離時(shí)間短，在6min之內(nèi)全部出峰，在流動(dòng)相中添加了三乙胺之后拖尾現(xiàn)象也不明顯。表1 對(duì)映體化合物在極性有機(jī)相和反相模式

28、下拆分的電色譜數(shù)據(jù)Table 1 Racemic coumpounds separated in the non-aqueous polar organic and aqueous mobile phases. CompoundsMobile phaset1(min)t2(min)N1(plates/m)N2(plates/m)RsPropranolola4.114.31116 300111 4002.01Pindolola4.274.43208 700217 4001.85Metoprolola4.014.17145 000106 9001.35Atenolola5.565.85107 20

29、0 63 5001.31Terbutalinea4.664.87 83 300 53 4001.14Alprenolola3.303.45 58 750 52 0001.08Thalidomideb8.9810.22 48 500 49 6502.93Benzoinb10.3810.58129 300 82 2000.57Experimental conditions: column, a 16 cm 50 m ID monolithic silica column modified with 10 mg/mL vancomycin attached to a 15 cm 50 m ID em

30、pty fused-silica capillary via a Teflon-tubing union; mobile phase, (a) MeOH/ACN/HAc/TEA (80/20/0.1/0.1, v/v/v/v); (b) 10 mM triethylamine phosphate buffer containing 20% ACN at pH 6.5; applied voltage, 10 kV; injection, 5 kV 1 s; .兩個(gè)中性化合物安息香和沙立度胺的拆分是在反相流動(dòng)相（含20乙腈的10mM磷酸三乙胺緩沖溶液，pH 6.5）下實(shí)現(xiàn)。沙立度胺的分離度較高（

31、Rs2.93），而安息香獲得部分分離（Rs0.57）。同時(shí)也考察了反相模式下-阻滯劑的分離，但是其分離柱效較低，且拖尾嚴(yán)重，拆分未能實(shí)現(xiàn)。說明該手性固定相在極性有機(jī)環(huán)境下更有優(yōu)勢(shì)，這可能是由于極性有機(jī)流動(dòng)相對(duì)消除非特異性相互作用有著重要作用。圖3 對(duì)映體化合物在極性有機(jī)相和反相模式下的電色譜拆分譜圖Fig 3 Electrochromatograms for separations of enantiomers under non-aqueous and aqueous mobile phases. Experimental conditions were the same as descri

32、bed in Table 2.1.參照2.1.4節(jié)的鍵合萬(wàn)古霉素的方法，我們也進(jìn)一步考察了鍵合萬(wàn)古霉素的聚(GMA-co-EDMA)毛細(xì)管電色譜整體柱在CEC手性分離中的效果，但是無(wú)論在極性有機(jī)模式還是反相模式-阻滯劑和沙立度胺都未能拆分?？赡茉?yàn)橛袡C(jī)聚合物整體柱的比表面積小不利于手性選擇試劑鍵合量的提高，且有機(jī)基質(zhì)的強(qiáng)疏水性導(dǎo)致非手性特異性作用增大，而手性相互作用減弱136。而硅膠整體柱具有高比表面積，高柱效以及非特異性作用弱的特點(diǎn)，因此選擇硅膠整體柱作為萬(wàn)古霉素手性固定相的基質(zhì)優(yōu)勢(shì)明顯，這與文獻(xiàn)114報(bào)道的極為吻合。組合化學(xué)的蓬勃發(fā)展使得人們可以在短時(shí)間內(nèi)制備出大量對(duì)映體化合物，這對(duì)手性

33、分離提出了更高的要求，即速度快，制備容量大。而CEC法的特點(diǎn)即分離速度快，只需提高流動(dòng)相線速度即提高分離電壓便能大大縮短分離時(shí)間，但在常規(guī)的使用顆粒型填料的HPLC中，一味提高泵壓會(huì)導(dǎo)致柱壓的增大和峰展寬，反而降低了手性分離的效果。毛細(xì)管硅膠整體柱即能避免上述問題?；诠枘z整體柱良好的通透性，柱壓力不再是一個(gè)很大的限制；且整體柱有別于填充柱的一大特點(diǎn)就是其具有良好的動(dòng)力學(xué)性能，即在高的線速度下仍能保持較高的柱效，為實(shí)現(xiàn)快速分離中仍能保持分離效果提供了良好的保證。圖4 propranolol的快速分離電色譜圖Fig 4 Electrochromatogram for fast separatio

34、n of propranolol. Experimental conditions: applied voltage, 20 kV; other conditions were the same as described in Table 2.1.圖4是propranolol在高電壓下進(jìn)行快速分離的色譜圖，分離時(shí)間只需2.5min，且柱效也很高。這種高柱效一方面是由于EOF的塞狀流型，另外可能是由于硅膠整體柱良好的動(dòng)力學(xué)性能使得對(duì)流傳質(zhì)加快，這兩方面都有助于降低峰展寬從而提高柱效。所制備的萬(wàn)古霉素固定相的評(píng)價(jià)主要是在極性有機(jī)模式下進(jìn)行的，因此對(duì)這種流動(dòng)相中的溶劑的組成對(duì)分離的影響進(jìn)行了考察，包

35、括甲醇含量以及酸堿添加劑的含量對(duì)對(duì)映體保留時(shí)間，分離度以及柱效的影響。由于propranolol能夠成功的基線分離并且具有較高的柱效，因此選擇它作為標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)考察各種影響，當(dāng)然考察的結(jié)果在其他一些手性樣品的拆分中也有體現(xiàn)。圖5是流動(dòng)相中甲醇含量對(duì)分離的影響結(jié)果圖。隨著甲醇含量的增加，propranolol的分離度和柱效隨之增加。同時(shí)，保留時(shí)間先減小后增加，但變化不明顯。當(dāng)流動(dòng)相中甲醇含量占到80時(shí)，分離度達(dá)到最大值。這可能是由于流動(dòng)相中添加較多甲醇時(shí)，一些非特異性的氫鍵相互作用能夠被削弱，從而提高手性分離度。該結(jié)果說明流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例（MeOH/ACN）對(duì)這種萬(wàn)古霉素鍵合的硅膠整體柱的手

36、性拆分能力及柱效有著重要的影響，并且當(dāng)流動(dòng)相中含甲醇/乙腈（80/20，v/v）時(shí)，該手性固定相的分離度及柱效達(dá)到最佳值。圖 5 流動(dòng)相甲醇含量對(duì)消旋體propranolol在萬(wàn)古霉素鍵合硅膠整體柱上分離的影響Fig 5 Effect of MeOH concentration in the polar organic mobile phase on the (a) resolution and efficiency of propranolol and (b) retention time of the propranolol first-eluting enantiomer. All ot

37、her experimental conditions were the same as described in Table 2.1.同時(shí)，也對(duì)極性有機(jī)流動(dòng)相中的酸堿添加劑的比例進(jìn)行了考察。保持有機(jī)溶劑比例（MeOH/ACN，80/20，v/v）不變，改變醋酸/三乙胺（HAC/TEA）的比例，分離結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，酸堿比例對(duì)該電色譜柱的手性分離影響不是很大。圖6 HAc/TEA比例對(duì)propranolol分離的影響Fig 6 Influence of HAc/TEA ratio in non-aqueous mobile phas on the (a) resolution a

38、nd efficiency of propranolol and (b) retention time of the propranolol first-eluting enantiomer. All other experimental conditions were the same as described in Table 2.1.重復(fù)性和穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)一根色譜柱的重要指標(biāo)?？疾炝酥苽涞娜f(wàn)古霉素硅膠整體柱的重復(fù)性以及不同批次間的重復(fù)性。分別采用表2.1中有機(jī)極性流動(dòng)相和反相流動(dòng)相，以propranolol和thalidomide為標(biāo)準(zhǔn)樣品考察它們的色譜性能重復(fù)性。連續(xù)進(jìn)樣五次，propr

39、anolol的保留時(shí)間，柱效和分離度的RSD分別為0.78，1.1和2.3%，而thalidomide為0.72，1.5和2.8%。在制備的五根整體柱之間，測(cè)得propranolol和thalidomide的分離度，柱效和保留時(shí)間的RSD分別為4.3%，7.2%，9.6%和5.2%，6.1%，10.5%。說明這種整體柱的制備方法具有良好的重現(xiàn)性。我們還在極性有機(jī)和反相模式下考察了該柱的穩(wěn)定性，連續(xù)進(jìn)樣五十次以上，沒有觀察到明顯的分離度或柱效下降，也沒有觀察到柱床有明顯的收縮或溶漲現(xiàn)象，表明電色譜柱在所采用的流動(dòng)相模式下具備良好的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，這再次體現(xiàn)硅膠整體柱作為CSP載體的優(yōu)勢(shì)。4 本

40、章小結(jié) 制備了萬(wàn)古霉素鍵合的毛細(xì)管硅膠整體柱并將其用于對(duì)映體化合物的電色譜分離。優(yōu)化條件下制備的整體柱在極性有機(jī)和反相流動(dòng)相下都具有較高的電滲流，且具有較高的手性識(shí)別能力和柱效，8種對(duì)映體化合物在柱上得到了分離，其中絕大部分達(dá)到基線分離。采用高線速度實(shí)現(xiàn)了對(duì)propranolol的快速手性分離。通過對(duì)流動(dòng)相組成的考察，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相有機(jī)溶劑的比例對(duì)手性分離有著重要影響。該手性固定相的色譜重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均讓人滿意。5 參考文獻(xiàn)1 Lmmerhofer, M., Svec, F., Frchet, J. M. J., Lindner, W.,Trends Anal. Chem. 2000, 19, 6

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