試驗(yàn)一人基因組DNA的提取(共8頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第二篇細(xì)胞的遺傳物質(zhì)第一章細(xì)胞內(nèi)核酸的提取人類基因組計(jì)劃的完成以及后基因組學(xué)研究的不斷深入，標(biāo)志著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展已逐步進(jìn)入“基因組醫(yī)學(xué)”的時(shí)代。疾病分子機(jī)制的研究也將為包括疾病的分子診斷、分子治療在內(nèi)容的“分子醫(yī)學(xué)”的發(fā)展提供動力。核酸是遺傳信息以及基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是重要的生物信息分子,也是分子生物學(xué)研究的主要對象。它與生命的正?；顒?，如種族遺傳、生長等有密切聯(lián)系；它與生命的異?；顒?，如腫瘤的發(fā)生、放射損傷以及抗癌、抗病毒藥物的作用機(jī)理等也有密切的關(guān)系。因此，核酸是現(xiàn)代生命科學(xué)體系中重點(diǎn)研究的課題之一。核酸分為DNA和RNA兩大類。核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中

2、基本的操作之一，第一節(jié)真核細(xì)胞基因組DNA的分離與純化DNA主要在細(xì)胞核內(nèi)，核外也有少量稱為核外基因的線粒體DNA等。真核細(xì)胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白體形式存在于細(xì)胞中。真核細(xì)胞基因組DNA提取的主要步驟包括裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是去除體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、多糖、脂類及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的過程。一、裂解細(xì)胞破碎的手段常為超聲波、組織勻漿、液氮破碎以及包埋組織的超薄切片等方法。為了獲得大量完整的DNA，一般采用裂解液等溫和的方法破碎細(xì)胞。裂解液一般都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-

3、100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。去污劑的作用是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及去除與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。鹽的作用，一方面提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，另一方面可抑制核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl) 。裂解體系中還可以加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。二、純化根據(jù)DNA本身的特征使用不同方法進(jìn)行核酸提純。三、DNA提取的實(shí)驗(yàn)步驟（一）材料與設(shè)備1.試劑 消化液（100mm

4、ol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）；pH8.0，25mmol/L EDTA；PBS；TES飽和酚；氯仿；異戊醇； 95%乙醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS；1g/ml RNA酶；2.儀器 培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、微量離心管、滴管；刻度吸管；加樣器；槍頭；離心機(jī)、液氮罐、組織勻漿器、恒溫培養(yǎng)箱（二）主要步驟1.如果材料為組織塊，可將組織塊（約2001000mg）剪碎后，置入液氮中。隨后用冰冷的組織搗碎器搗碎，每100mg組織加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/

5、L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。2.如果材料是懸浮細(xì)胞，收集細(xì)胞于微量離心管中，500g×5min離心；如果材料是貼壁細(xì)胞，棄上清后，胰酶消化收集細(xì)胞，500g×5min離心。隨后用冰冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，500g×5min離心，棄上清，重復(fù)一次，并用一倍體積的消化液重懸細(xì)胞。3.組織或細(xì)胞混懸液移入帶蓋的離心管中，50消化1218h。4.冷卻至4，加等體積15 mo1L TES飽和酚。5.輕輕振搖，使水相和酚層充分混勻。6. 45000rpm8000rpm離心15min20min。此時(shí)

6、DNA溶液在上層，酚位于下層，中間是變性蛋白層。7.用吸管小心吸取上層粘稠溶液，移至另一離心管。注意盡量不要帶出中間蛋白層。8. DNA溶液再加等體積15 mo1L TES飽和酚抽提一次，按6、7離心并吸至另一離心管。9.加等體積氯仿/異戊醇按步驟（5、6）抽提，離心5min。10.吸出DNA溶液后，再步驟（9）抽提一次。11.用吸管將DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0。12.加2.5倍體積95%冷乙醇震搖，可見DNA白色沉淀析出。13.用75%冷乙醇清洗34次。14.室溫干燥或冷凍干燥DNA。15.加適量TE溶液溶解DNA。四、結(jié)果鑒定1紫外分光光度計(jì)檢測：可檢測DNA的純度和含量

7、。一般而言核酸在260nm時(shí)吸光度最大，而蛋白質(zhì)在280nm時(shí)吸光度最大。取2l DNA溶解液，適量稀釋，紫外分光光度計(jì)測定260nm、280nmOD值，計(jì)算OD260/OD280比值，比值在1.72.0:1之間，說明DNA純度可。在260nm處，1OD雙鏈DNA的濃度為50mg /ml，據(jù)此可計(jì)算DNA的濃度（mg /ml）=50×(OD260) × 稀釋倍數(shù)。2電泳檢測：可檢測核酸的完整性和大小。取2l DNA溶解液與適量上樣緩沖液混合后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后紫外光下觀察，拍照；如果觀察到一條清晰的電泳帶，無明顯的拖尾，說明DNA完整性好。第二節(jié)真核細(xì)胞總R

8、NA的分離提取RNA是基因表達(dá)產(chǎn)物，由以下幾類分子組成，rRNA（占細(xì)胞總RNA的80%85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占1015%）、mRNA（占15%）。其中mRNA是分子生物學(xué)的主要研究對象，分離制備mRNA是克隆基因，分析基因表達(dá)以及建立cDNA文庫的首要步驟。真核細(xì)胞總RNA分離提取的目的是要獲得高純度的具有充分長度的RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的關(guān)鍵是盡量減少RNA酶的污染。RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性的RNA酶外，環(huán)境中也存在RNA酶。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性

9、。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。一、RNA提取 的關(guān)鍵真核細(xì)胞RNA的提取過程有四個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即樣品（細(xì)胞或組織）的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；其中最關(guān)鍵的是抑制酶活性。提取的RNA可以用于核酸雜交、cDNA合成以及體外翻譯等。二、組織RNA提取的基本步驟1.儀器：勻漿器、低溫離心機(jī)、離心管。2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、DEPC溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧化氫、甲酰胺、RNA上樣緩沖液

10、。3.主要步驟（1）取組織50100mg，加0.8ml Trizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。（2）加0.2ml氯仿，充分震蕩混勻，靜置3min，4，12000g×15min離心。棄沉淀。（3）取上清，加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻。20靜置2h，4，12000g×10min離心。（4）棄上清，取沉淀，加入1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4，7500g×5min離心。（5）棄上清，沉淀真空干燥10min。（6）加40l DEPC溶液，充分溶解RNA。4.結(jié)果鑒定（1）紫外分光光度計(jì)檢測：取RNA溶解液，按一定比例稀釋后，紫外分光光度計(jì)測定26

11、0nm、280nmOD值，計(jì)算OD260/OD280比值，如果比值在1.72.0：1之間，說明RNA純度可。標(biāo)準(zhǔn)樣品當(dāng)OD2601時(shí)，RNA濃度約為40g/ml，根據(jù)下述公式計(jì)算RNA濃度：RNA濃度（g/ml）OD260×稀釋倍數(shù)×40。（2）電泳檢測：1%甲醛變性膠電泳觀察RNA質(zhì)量，電泳槽及制膠板先用3%過氧化氫浸泡過夜；制1%甲醛變性凝膠板：4.5l RNA，2ul 5×甲醛膠電泳緩沖液，3.5l 37%甲醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65變性15min后，迅速置冰浴中；再加入2l RNA上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6V/cm電壓，電泳12h；暗室內(nèi)紫外光

12、下觀察，拍照；如果觀察到清晰的18S、28S RNA電泳帶，無大量小分子RNA，說明RNA無明顯降解，樣品70保存?zhèn)溆?。三、注意事?xiàng)1、所有玻璃器皿160180高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿經(jīng)0.1% DEPC液浸泡后，經(jīng)高溫（15磅，20min）處理滅活RNA酶，所用試劑均用DEPC水配制，然后高壓處理。2、實(shí)驗(yàn)用水要經(jīng)DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。3、實(shí)驗(yàn)操作過程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。第三節(jié) 質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取與純化細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈共價(jià)閉合環(huán)狀、大小約1kb200kb 的DNA，存在于質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的可自主復(fù)制的遺傳成份。通常情況下

13、可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過分裂傳遞到后代。質(zhì)粒是目前最常用的克隆的載體分子之一，獲得大量純化的質(zhì)粒DNA是克隆的前提條件。一、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理 堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)不同。在PH1212.5時(shí),線性DNA會完全變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA只是氫鍵斷裂，經(jīng)酸中和后，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA可迅速準(zhǔn)確的復(fù)性。而線性DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，只能聚合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后與變性的蛋白質(zhì)、RNA一起沉淀下來。上清液中的質(zhì)粒DNA可用乙醇沉淀出

14、來。二、基本步驟1材料：含質(zhì)粒的大腸桿菌2試劑：溶液（ 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）)、溶液（0.2N NaOH，1% SDS）用時(shí)臨時(shí)配制。pH 4.8的醋酸鉀（KAc）緩沖液（5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml）、 TE緩沖液（10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)）、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）、 5×TBE（Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加dd

15、H2O 至1000ml）。10mg/ml溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、10mg/ml RNase A（RNA酶A）、6×上樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液）。3儀器：離心機(jī)、電泳儀、水平式電泳槽 4.主要步驟 （1）挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。（2）取1.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。（3）將細(xì)菌沉淀重懸于100l預(yù)冷的溶液中，劇烈振蕩。（4）加200l新鮮配制的溶液于離心管中，

16、顛倒數(shù)次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲?，并將離心管放置于冰上2-3min，使膜充分裂解。（5）加入150l預(yù)冷的醋酸鉀（KAc）緩沖液，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。（6）加入450l的苯酚/氯仿/異戊醇混合液，振蕩混勻，4離心12000g × 10min。（7）小心移出上清于另一微量離心管中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，4離心12000g×15min。（8）加入1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2次，4離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。（9）沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/m

17、l），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存?zhèn)溆谩?.結(jié)果鑒定：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。方法同前核酸DNA的鑒定。第四節(jié)線粒體DNA的提取線粒體DNA是染色體遺傳物質(zhì)，哺乳類動物的線粒體DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA。它變異快、結(jié)構(gòu)相對簡單，經(jīng)母系遺傳，對真核生物基因組的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控機(jī)理等方面都起著重要作用。近年來被廣泛用于近緣種間或種內(nèi)種群間親緣關(guān)系的研究。線粒體DNA最早是用氯化銫梯度離心方法獲得，該法提取的線粒體DNA純度高，但所需儀器設(shè)備昂貴，實(shí)驗(yàn)周期長，限制其在群體遺傳研究中的應(yīng)用。繼而出現(xiàn)了Triton法、堿變性法與改進(jìn)高鹽沉淀法等線粒體DNA的提取方法。一、堿

18、變性法線粒體DNA提取的原理 線粒體DNA的結(jié)構(gòu)與質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu)相似，均為共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA，實(shí)驗(yàn)原理與質(zhì)粒DNA提取相同 。二、主要實(shí)驗(yàn)步驟1、材料：新鮮小鼠肝組織2、儀器：玻璃勻漿器、高速離心機(jī)、離心管、吸管3、試劑：50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0、1%SDS、0.2N NaOH、3M NaAc pH4.8、95%乙醇、75%乙醇、TE緩沖液4、主要步驟（1）取50mg新鮮小鼠肝組織，加1ml冷勻漿液，用玻璃勻漿器勻漿，隨即以1000g×3min， 4，離心，棄沉淀。（2）取上清，12000g×10min，4，離心，沉淀即為粗線粒體。（3）將沉淀溶于100ml（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0）溶液中，充分混勻。（4）加200ml新鮮配制的（1%SDS，0.2N NaOH）溶液，輕輕搖勻，冰浴5min。（5）再加150ml（3M NaAc pH4.8）溶液，輕輕搖勻，冰浴5min。12000g