般毒性作用及其實(shí)驗(yàn)與評(píng)鑒方法

1、第六章 一般毒性作用及其試驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法 一般毒性作用：是指毒物對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的綜合毒性效應(yīng)，也稱(chēng)基本毒性作用根據(jù)接觸毒物的時(shí)間長(zhǎng)短可將產(chǎn)生的毒性作用分為急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。第一節(jié) 急性毒性作用及其試驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法 一、急性毒性試驗(yàn)的概念 急性毒性試驗(yàn)是指動(dòng)物機(jī)體一次或24h內(nèi)多次接觸受試物后在短期內(nèi)所產(chǎn)牛的毒性效應(yīng)及反應(yīng)。 觀(guān)察內(nèi)容一般包括行為變化、外觀(guān)改變以及致死效應(yīng)。觀(guān)察時(shí)間一般為7d，觀(guān)察范圍可為728d（遲發(fā)毒性效應(yīng)）。凡經(jīng)口或經(jīng)注射給毒，“一次”的含義是指瞬間將受試物輸入試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；若經(jīng)呼吸或皮膚給毒，“一次”則指在一個(gè)特定的時(shí)間內(nèi)，使試驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)接受受試物的過(guò)程。“24

2、h內(nèi)多次接觸受試物”的概念是指當(dāng)受試物毒性很低，一次接觸還不能達(dá)到充分了解該受試物的毒性作用，或一次不能導(dǎo)入設(shè)計(jì)劑量的受試物時(shí)，需在24h內(nèi)分次染毒。二、急性毒性試驗(yàn)的目的（1）測(cè)定和計(jì)算出受試物的致死量及其他急性毒試參數(shù)，主要獲得受試物對(duì)某種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以某種接觸途徑的LD50值；(2)了解受試物對(duì)動(dòng)物機(jī)體的急性毒性特征，靶器官和劑量一反應(yīng)關(guān)系；(3)研究受試物在動(dòng)物體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律；(4)為下一步的亞慢性、慢性毒性試驗(yàn)及其他毒理學(xué)試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和觀(guān)察指標(biāo)選擇提供依據(jù)。三、急性毒性試驗(yàn)方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和要求(1)品種、品系的選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇的原則是以哺乳動(dòng)物為主，選擇兩種或兩種以上的動(dòng)物

3、，包括嚙齒類(lèi)(rodentspecies)和非嚙齒類(lèi)(nonrodenl species)，其中至少有一種非嚙齒類(lèi)動(dòng)物。嚙齒類(lèi)多選用小鼠和大鼠，非嚙齒類(lèi)常選用犬或猴。(2)性別和年齡或體重的要求對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別一般要求雌雄(早6)各半。如果試驗(yàn)僅為某些特殊試驗(yàn)研究目標(biāo)，也可選用單一性別。如致畸試驗(yàn)可僅選雌性動(dòng)物，對(duì)精子毒性試驗(yàn)可僅選雄性動(dòng)物。 急性毒性試驗(yàn)通常要求剛成年的動(dòng)物。一般按體重選購(gòu)，通常要求小鼠1825g、大鼠180240g、豚鼠200250g、家兔225kg、貓152kg、犬46kg(犬一般為1歲左右)。同次試驗(yàn)小鼠體重相差不超過(guò)4g、大鼠體重相差不超過(guò)10g。一般來(lái)說(shuō)，同一批次

4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重變異范圍不應(yīng)超過(guò)其平均體重的20。2 / 15 (3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量與分組 急性毒性試驗(yàn)一般要求設(shè)57組，每組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)而定。一般大、小鼠每組不少于10只，家兔每組不少于8只，犬等大動(dòng)物每組不少于6只。分組時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照隨機(jī)化的原則。 (4)檢疫和適應(yīng)質(zhì)量控制(包括品種、品系、遺傳和微生物背景)。購(gòu)回的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)前應(yīng)有12周的檢疫觀(guān)察和適應(yīng)期。2染毒方法 靜脈注射>吸人>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射>經(jīng)口>皮內(nèi)注射>經(jīng)皮。同一受試物不同染毒途徑LD50。的大小通常也符合此規(guī)律。(1)經(jīng)口染毒經(jīng)口染毒?？刹捎霉辔浮曃?、吞咽膠

5、囊等方式。各經(jīng)口染毒方式各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)視具體情況選用。 灌胃法：將受試物配成一定濃度的溶液或混懸液，經(jīng)胃管或灌胃針一次導(dǎo)入胃內(nèi)。 灌胃容量視實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大小而定。小鼠，一次021mL或0105mL10g體重；大鼠，一次不超過(guò)5mL只，或051OmLl00g體重；家兔，不超過(guò)10mL2kg體重；狗，不超過(guò)50mL10kg體重。 染毒劑量、溶液濃度和灌胃體積之間可采取兩種方式。一種方式為采用等體積不等濃度灌胃，另一種方式為采用等濃度不等體積灌胃。其關(guān)系可表示如下。 等體積不等濃度灌胃：隨各組劑量增加，溶液濃度加大，灌胃體積不變。 等濃度不等體積灌胃：隨各組劑量增加，溶液濃度不變，灌胃體積加大。 灌胃法

6、的優(yōu)點(diǎn)是染毒劑量準(zhǔn)確；缺點(diǎn)是工作量大，操作要求謹(jǐn)慎，一旦灌胃誤人氣管，即可人為導(dǎo)致動(dòng)物死亡。 飼喂法：將受試物拌入飼料或飲水中，讓其自由攝入。需單籠飼養(yǎng)動(dòng)物，每天結(jié)算攝食量或飲水量，來(lái)折算攝入受試物的劑量。 飼喂法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行，符合人類(lèi)接觸受試物的實(shí)際情況。 但也有許多缺點(diǎn)，一方面是動(dòng)物對(duì)受試物的攝入量不夠準(zhǔn)確，與設(shè)計(jì)劑量之間的誤差較大：另一方面是動(dòng)物可能拒食有異味或適口性差的受試物，使攝人量減少，這樣，染毒量就達(dá)不到設(shè)計(jì)劑量，同時(shí)影響動(dòng)物的正常攝食和生長(zhǎng)發(fā)育。此外，易揮發(fā)物、易水解、易氧化等受試物會(huì)因揮發(fā)或變質(zhì)而損失。 吞咽膠囊法：將受試物裝入膠囊內(nèi)，強(qiáng)行放于動(dòng)物舌后咽部，迫使動(dòng)物咽下。

7、此法常用于兔、貓、犬、猴等較大動(dòng)物的染毒。 吞咽膠囊法的優(yōu)點(diǎn)是劑量準(zhǔn)確，尤其適用于易揮發(fā)，易水解、易氧化、有異味的受試物；缺點(diǎn)是經(jīng)口投放膠囊時(shí)動(dòng)物有咬傷人的危險(xiǎn)。 需要注意的是：經(jīng)口染毒前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)禁食一段時(shí)間。家兔、貓、犬、猴可在每日上午喂食前給予受試物，即空腹給藥。大、小鼠一般采用染毒前隔夜禁食，給予受試物后應(yīng)繼續(xù)禁食34h。 (2)經(jīng)呼吸道染毒經(jīng)呼吸道染毒主要用于評(píng)價(jià)以氣體、蒸氣、粉塵、煙霧等形式存在的有毒有害物質(zhì)。呼吸道染毒方式分為吸人和氣管內(nèi)注入兩種方式。吸入又分為靜式和動(dòng)式兩種方式。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最低需氣量，小鼠為345Lh，大鼠為305 Lh計(jì)算，一般50L染毒柜可放入小鼠610

8、只，或大鼠1只，染毒2h。染毒柜體積、放置動(dòng)物種類(lèi)和數(shù)量及放置時(shí)間相互關(guān)系見(jiàn)表61。 (3)經(jīng)皮染毒用于評(píng)價(jià)經(jīng)皮膚接觸的外源性化學(xué)物，如化妝品、農(nóng)藥、外用藥物、環(huán)境污染物及職業(yè)接觸的一些工業(yè)毒物。染毒面積則依據(jù)選用動(dòng)物及受試物的劑量和劑型而定。一般在動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)選定體表10的面積，或家兔可取5cm×6cm，豚鼠取3×4cm，大鼠取152.0cm、小鼠取1015cm直徑的面積。經(jīng)皮吸收染毒也可采用大鼠、小鼠浸尾染毒。 (4)經(jīng)注射途徑染毒 注射染毒途徑有靜脈注射(iv)、肌肉注射(im)、皮下注射(sc)、皮內(nèi)注射(id)和腹腔注射(ip)等。 3劑量設(shè)計(jì)與分組 (1)預(yù)

9、試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì) 等比劑量設(shè)計(jì) 一般設(shè)57組，各組問(wèn)采用一定的公比設(shè)計(jì)劑量。預(yù)試驗(yàn)的各組劑量組距可拉大一些，如可用4倍公比。 即公比r=4，則組距i=lg4=06。 預(yù)試的目的是要得到死亡率在1090之問(wèn)的致死劑量范圍，即受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以某種接觸途徑的1090致死劑量范圍。再根據(jù)后面介紹的正式試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)方法，計(jì)算正式試驗(yàn)組距(i)或正式試驗(yàn)公比(r)，進(jìn)行正式試驗(yàn)劑量分組。 關(guān)于預(yù)試驗(yàn)，對(duì)于無(wú)資料可參考的受試物，為節(jié)省試驗(yàn)動(dòng)物用量，可用下述“多、快、好、省”的預(yù)試驗(yàn)方法。 3×3法 動(dòng)物均無(wú)死亡，說(shuō)明劑量偏低，劑量可上移增大； 序貫法(上下法) 該法適于快速反應(yīng)試驗(yàn)，簡(jiǎn)便，節(jié)約動(dòng)物

10、。 方法是設(shè)計(jì)一系列等比系列劑量，將動(dòng)物一只一只序貫進(jìn)行。先選擇一個(gè)接近50反應(yīng)的劑量，當(dāng)?shù)谝恢粍?dòng)物不死時(shí)，則用高一級(jí)劑量給予下一只動(dòng)物；反之，第一只動(dòng)物死亡，則用低一級(jí)劑量給予下一只動(dòng)物。如此進(jìn)行下去，可確定致死劑量范圍。（2）正式試驗(yàn)的計(jì)量設(shè)計(jì)計(jì)算組距或公式根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以下式計(jì)算正式試驗(yàn)組距(i)或正式試驗(yàn)的公比(r)。 （a）正式試驗(yàn)組距 （P127） （b）正式試驗(yàn)的公比 正式試驗(yàn)劑量分組 正式試驗(yàn)劑量的公比r或組距i確定后，則可進(jìn)行正式試驗(yàn)分組。分組結(jié)果見(jiàn)表64。正式試驗(yàn)一般分57組，每組動(dòng)物數(shù)小鼠不少于10只，大鼠68只，家兔46只，雄雌各半。4. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 改良寇氏法（實(shí)驗(yàn)設(shè)

11、計(jì)要求及LD50的計(jì)算）。P127 5急性毒性試驗(yàn)的觀(guān)察內(nèi)容 (1)中毒出現(xiàn)的時(shí)間和癥狀 染毒后4h內(nèi)最密切注意觀(guān)察，當(dāng)天進(jìn)行多次觀(guān)察，以后每天注意觀(guān)察。記錄染毒后動(dòng)物的異常表現(xiàn)和出現(xiàn)時(shí)間，對(duì)癥狀進(jìn)行描述，總結(jié)受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性特征。 (2)死亡時(shí)間及死亡數(shù) 觀(guān)察記錄各組動(dòng)物死亡數(shù)和死亡時(shí)問(wèn)。 (3)剖檢、生化及病理學(xué)檢查 對(duì)死亡動(dòng)物及時(shí)解剖，觀(guān)察記錄受試物對(duì)實(shí)質(zhì)臟器的損害，必要時(shí)采取標(biāo)本做病理組織學(xué)檢查，初步確定靶器官，為進(jìn)一步的靶器官確定和毒作用機(jī)制分析提供方向。有些急性毒性試驗(yàn)也要設(shè)計(jì)一些生化檢測(cè)指標(biāo)。 (4)毒代動(dòng)力學(xué)分析 這是專(zhuān)門(mén)的毒代動(dòng)力學(xué)研究而進(jìn)行的工作。按毒代動(dòng)力學(xué)的給毒、

12、采樣、分析、建模及參數(shù)計(jì)算設(shè)計(jì)試驗(yàn)和分析。具體原理和方法見(jiàn)本書(shū)第四章。觀(guān)察內(nèi)容較為單純，只做死亡記錄和毒性特征觀(guān)察即可。若同時(shí)要為下一步的毒理機(jī)制研究鑒定基礎(chǔ)，就需進(jìn)行剖檢、生化及病理學(xué)檢查。四、急性毒性的分級(jí)與評(píng)價(jià)四急性毒性分級(jí)和評(píng)價(jià)1、急性毒性分級(jí)對(duì)于不同類(lèi)型毒物分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)稍有差異。農(nóng)藥使用四級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，工業(yè)毒物常用五級(jí)分級(jí)標(biāo)我國(guó)食品毒理學(xué)則采用國(guó)際六級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。各類(lèi)毒物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表68表6-11。毒性危險(xiǎn)性分級(jí)見(jiàn)表612。2急性毒性評(píng)價(jià) 1） 如果劑量達(dá)10 gkg體重以上，仍不引起死亡者，可認(rèn)為該受試物急性毒性試驗(yàn)是安全的，不必測(cè)定其LD50；2）如果急性毒性L(fǎng)D50或7d在喂養(yǎng)

13、試驗(yàn)的最小有作用劑量小于人的可能攝入量的10倍者，則表明該化合物急性毒性較大，應(yīng)予以放棄，不再繼續(xù)試驗(yàn)：如急性毒性L(fǎng)D，。大于人可能攝入量的10倍者，該物質(zhì)有可被使用的希望。3）盡可能詳盡描述中毒特征、癥狀表現(xiàn)、出現(xiàn)時(shí)間、死亡前兆、毒性作用的發(fā)生、發(fā)展、恢復(fù)經(jīng)過(guò)，以及體重、剖檢和病理學(xué)變化等。從而較全面地對(duì)急性毒性做出評(píng)價(jià)。第二節(jié) 亞慢、性毒性作用及其試驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法 一、亞慢性毒性試驗(yàn)的概念 亞慢性毒性試驗(yàn)：是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)多日接觸較大劑量外來(lái)化合物所引起的毒性作用。 試驗(yàn)期通常為36個(gè)月，或一般為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命期的110130。如用小鼠，試驗(yàn)期通常為3個(gè)月，大鼠36個(gè)月，狗412個(gè)月。 二、亞

14、慢性毒性試驗(yàn)的目的 (1)進(jìn)一步探索受試物的毒作用特點(diǎn)和靶器官； (2)了解受試物有無(wú)蓄積作用，是否產(chǎn)生耐受性； (3)分析受試物的劑量一效應(yīng)關(guān)系； (4)初步估計(jì)出不出現(xiàn)毒性作用的最大耐受量(即最大無(wú)作用劑量NOEL，或稱(chēng)未觀(guān)察到損害作用劑量NOAEL)和出現(xiàn)毒性的最小有作用劑量(即MED，也稱(chēng)最低觀(guān)察到損害作用的劑量LOAEL)；(5)為慢性毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)和觀(guān)察指標(biāo)提供依據(jù)； (6)為受試物的毒理機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料。 三、亞慢性毒性試驗(yàn)方法 1試驗(yàn)動(dòng)物的選擇和要求 (1)品種、品系的選擇 一般要求選擇兩種以上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒類(lèi)和非嚙齒類(lèi)動(dòng)物。常用動(dòng)物有小白鼠、大白鼠、犬、貓，也有

15、家兔。對(duì)于重要的受試物甚至可選用靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物猴。 小白鼠品系常選用昆明種、NIH或IcR；大白鼠品系常選用wistar和sD；犬的品系常選用Beagle大。 (2)性別和年齡的要求 對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的性別要求一般為雌雄各半。為了某種特殊試驗(yàn)?zāi)康目蛇x用單一性別。 年齡選擇的一般原則是離乳不久的動(dòng)物。一般以體重為標(biāo)準(zhǔn)，小鼠為1518g，大白鼠50100g(68周齡)，貓12kg。同組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重相差不應(yīng)超過(guò)平均體重的10，組間平均體重相差不超過(guò)5。 (3)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，小動(dòng)物每組一般不少于20只；較大動(dòng)物每組一般為610只，不少于6只，如犬、猴每組不少于6只。若試驗(yàn)過(guò)程需處死動(dòng)物，則每組動(dòng)物

16、數(shù)要相應(yīng)增加。 (4)檢疫和適應(yīng)2染毒方法 亞慢性毒性試驗(yàn)染毒方法選擇的原則是：盡量選擇和人類(lèi)接觸途徑相似的方式。食品毒理試驗(yàn)一般以經(jīng)口染毒為主，多采用飼喂法，每日染毒，連續(xù)給予。試驗(yàn)期間，每日定時(shí)定量染毒，稱(chēng)量當(dāng)日給食量和次日結(jié)余量，結(jié)算每日攝入量，自由飲水。采用飼喂法時(shí)，保證受試物在飼料中混勻，并應(yīng)有在飼料中穩(wěn)定性的資料和相應(yīng)措施。對(duì)于有異味、易揮發(fā)、易水解、易氧化等受試物，可采用灌胃或膠囊吞咽法。3劑量設(shè)計(jì)與分組 (1)試驗(yàn)設(shè)組 亞慢性毒性試驗(yàn)一般至少應(yīng)設(shè)4個(gè)組，分別為高劑量、中劑量、低劑量3個(gè)劑量組和1個(gè)空個(gè)對(duì)照組(陰性對(duì)照)。 (2)劑量設(shè)計(jì) 亞慢性毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)至關(guān)重要，直接關(guān)系

17、到試驗(yàn)的成敗。 劑量設(shè)計(jì)的原則 劑量設(shè)計(jì)的原則是：高劑量組盡量控制為受試動(dòng)物在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)既不發(fā)生死亡，又能引起明顯的毒性反應(yīng)，或僅有個(gè)別動(dòng)物死亡，但死亡率不超過(guò)10；低劑量組應(yīng)無(wú)中毒反應(yīng)，相當(dāng)于未觀(guān)察到損害作用劑量(NOAEL)；中劑量組較理想的設(shè)計(jì)應(yīng)相當(dāng)于觀(guān)察到最小損害作用劑量LOAEL)。劑量設(shè)計(jì)的依據(jù) 高劑量組：通常以急性毒性試驗(yàn)的閾劑量作為亞慢性毒性試驗(yàn)的最高劑量，或以該受試物L(fēng)D50的12015為最高劑量。 中、低劑量組：高劑量確定之后，一般以310倍公比等比設(shè)計(jì)3組劑量。 一般適宜設(shè)計(jì)范圍在該化合物L(fēng)D50的110180之間做等比設(shè)計(jì)。也可參考臨床人擬用量的10、30和100倍設(shè)

18、計(jì)劑量(大鼠)，非嚙齒類(lèi)可用臨床人擬用量的5、15倍和50倍設(shè)計(jì)劑量。 4觀(guān)察指標(biāo) (1)一般性指標(biāo) 包括每日采食量、體重變化(定期稱(chēng)重)、外觀(guān)體征(包括被毛光澤、精神狀態(tài)、呼吸動(dòng)作、分泌物、排泄物、飲食、活動(dòng)、行為等)、異常表現(xiàn)和中毒癥狀等。 采食量和體重變化可用于進(jìn)一步分析食物利用率。食物利用率是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每攝入100g飼料所增長(zhǎng)的體重克數(shù)。食物利用率的分析有助于了解產(chǎn)生體重變化的原因。例如，如果受試物通過(guò)影響食欲而導(dǎo)致進(jìn)食量減少，體重增長(zhǎng)會(huì)受影響，但食物利用率不一定降低；如果受試物并非影響食欲而體重增長(zhǎng)受影響，則可能是受試物干擾了食物的吸收或代謝，使食物利用率發(fā)生了改變。 (2)生理生化

19、指標(biāo) 包括血、尿常規(guī)和相關(guān)生化指標(biāo)。尿液檢查指標(biāo)包括外觀(guān)、pH值、尿蛋白、尿糖、尿潛血、尿沉渣等。對(duì)血液生理生化指標(biāo)分析對(duì)于毒作用靶器官、毒物體內(nèi)代謝、毒理機(jī)制明認(rèn)識(shí)利進(jìn)一步研究都有重要意義。 （3）分子生物學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo) 細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)（包括酶）和核酸的損傷、其中有些或?yàn)榉沁z傳性損傷、或?yàn)橹滤佬該p傷、或發(fā)生細(xì)胞凋亡、或引起免疫功能異常。選擇相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，有利于深入探討有害作用的機(jī)理和對(duì)安全性的評(píng)價(jià)，也有利于提出有效的防護(hù)措施。 (4)分析劑量一效應(yīng)關(guān)系 (5)病理解剖學(xué)和病理組織學(xué)檢查 為進(jìn)一步研究毒作用的靶器官提供線(xiàn)索和方向。 病理組織學(xué)檢查則可從組織和細(xì)胞水平深入研究毒物損害作用的性

20、質(zhì)和程度，毒作用的靶器官和靶細(xì)胞。如果結(jié)合電鏡超微結(jié)構(gòu)分析及免疫組織化學(xué)和酶組織化學(xué)分析，可從亞細(xì)胞水平，甚至分子水平揭示毒效應(yīng)的本質(zhì)，為進(jìn)一步的毒理機(jī)制研究提供依據(jù)。 (6)其他指標(biāo)檢查 其他指標(biāo)檢查包括血壓、血流、動(dòng)脈管壁彈性、血液電解質(zhì)的變化、心電圖、神經(jīng)反射、記憶、氧化損傷等。選擇哪些指標(biāo)這要根據(jù)受試物的毒性資料，前期毒性試驗(yàn)的觀(guān)察和分析提示，選取需進(jìn)一步檢查分析的項(xiàng)目。 5各國(guó)對(duì)亞慢性毒性試驗(yàn)測(cè)試指標(biāo)的比較各國(guó)對(duì)亞慢性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)并未完全統(tǒng)一，都有自己的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表513)，但大體上比較一致。在選用動(dòng)物數(shù)方面，F(xiàn)DA和中國(guó)每組為20只，其余為10只。除EPA外，一

21、般均在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)做血液和臨床生化分析。一般不做尿液分析，組織器官病理檢查大致相同。中國(guó)的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)與美國(guó)FDA的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)較為接近。第三章 蓄積性毒性作用及其實(shí)驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法一、蓄積性毒性作用的概念 對(duì)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物多次間隔給予小劑量物，當(dāng)給予受試物的時(shí)間間隔合劑量超過(guò)機(jī)體的解毒和排泄能力時(shí)，導(dǎo)致受試物在體內(nèi)蓄積，并由此而引起的毒性作用，稱(chēng)為蓄積性毒性作用 1蓄積性毒性作用的分類(lèi) 蓄積性毒性作用一般包括物質(zhì)蓄積和功能蓄積兩種情況，這兩種蓄積作用可能同時(shí)存在，兼而有之。 (1)物質(zhì)蓄積(material accumulation)：是指機(jī)體少量反復(fù)多次接觸毒物后，該毒物在機(jī)體內(nèi)逐漸積累。可以用一定的分析方

22、法檢測(cè)出體內(nèi)該物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的增加過(guò)程，這種積累隨著時(shí)間延長(zhǎng)而含量增加，當(dāng)達(dá)到中毒閾值時(shí)而產(chǎn)生毒性作用。 (2)功能蓄積(functional accumulation)：是指機(jī)體少量反復(fù)多次接觸化學(xué)毒物或其他形式的危害物，每次引起的輕微功能損害逐漸積累，當(dāng)積累到一定程度時(shí)出現(xiàn)毒性效應(yīng)，而這時(shí)用檢測(cè)手段卻查不出體內(nèi)毒物的存在或增加。 2蓄積毒性作用產(chǎn)生的因素 蓄積毒性作用的產(chǎn)生主要與以下因素有關(guān)。 (1)與接觸劑量大小和時(shí)間問(wèn)隔有關(guān) 如果動(dòng)物接觸毒物的劑量大、間隔時(shí)間短，則易出現(xiàn)蓄積性；相反，如劑量小、問(wèn)隔時(shí)間長(zhǎng)，則不易出現(xiàn)蓄積性。 (2)與毒物本身的性質(zhì)有關(guān) 如血漿蛋白、脂肪組織、肝

23、臟、腎臟、骨骼等就是某些毒物的常見(jiàn)儲(chǔ)存庫(kù)。 (3)與動(dòng)物種屬的代謝特點(diǎn)有關(guān) 二、蓄積性毒性試驗(yàn)的目的 外源化學(xué)物的蓄積性毒性作用是產(chǎn)生慢性毒性作用的基礎(chǔ)，是食品中外來(lái)化學(xué)物安全性評(píng)價(jià)的重要依據(jù)之一。進(jìn)行蓄積性毒性試驗(yàn)的主要目的有以下幾個(gè)方面。 (1)了解受試驗(yàn)是否具有蓄積作用，以及蓄積性大小如何。 (2)根據(jù)受試驗(yàn)物有無(wú)蓄積作用，評(píng)定該化合物是否可能引起潛在的慢性毒性危害。 (3)為制定有毒物質(zhì)在食品中的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，為安全系數(shù)的選擇提供參考。 (4)確定該受試物可否用于食品供人類(lèi)長(zhǎng)期食用。 三、蓄積性毒性試驗(yàn)方法和蓄積性評(píng)價(jià) 蓄積性毒性試驗(yàn)的方法有多種，常用的方法有蓄積系數(shù)法和生物半減期法

24、。 1蓄積系數(shù)法 (1)概念 在一定期限內(nèi)，以低于一定的致死劑量每日給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒，計(jì)算多次染毒使半數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)毒性效應(yīng)(或死亡)的總累積劑量與一次染毒該化合產(chǎn)生相同效應(yīng)(或死亡)的劑量之比值，此比值稱(chēng)為蓄積系數(shù)，常用K表示。 蓄積性的大小常根據(jù)蓄積系數(shù)K值來(lái)分級(jí)。K值越小，表明蓄積性越大；反之，K值越大，表明蓄積性越小。如果K=1，說(shuō)明該化合物每次染毒后在體內(nèi)全部蓄積，其蓄積毒性就很大。通常認(rèn)為K=5，表明蓄積性很小。 (2)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法 常用的蓄積性毒性試驗(yàn)方法有固定劑量法、遞增劑量法和20d法。2生物半減期法 (1)概念 生物半減(衰)期(fiological halflife，f。，：

25、)是指化學(xué)物質(zhì)吸收入體內(nèi)以后，在體內(nèi)每減少50(一半)所需的時(shí)間。對(duì)同一化合物在同一種動(dòng)物體內(nèi)，這一時(shí)間是恒定的。 化學(xué)物在體內(nèi)生物半減期的長(zhǎng)短，直接影響著該化合物在體內(nèi)的蓄積性。蓄積的速率和量與機(jī)體單位時(shí)間內(nèi)吸收該物質(zhì)的速率及清除速率有關(guān)。如果吸收速率大于清除速率，則該物質(zhì)在體內(nèi)蓄積的量會(huì)不斷增加；反之，如果清除速率大于吸收速率，則該物質(zhì)在體內(nèi)的量會(huì)不斷減少。一般來(lái)說(shuō)，在一定劑量范圍內(nèi)，即便是化合物以等時(shí)間間隔恒速吸收人體內(nèi)，其在體內(nèi)的蓄積量也并不是呈無(wú)限地增加，而是有一個(gè)極限。這是因?yàn)槲镔|(zhì)以小劑量等問(wèn)隔恒速吸收入體內(nèi)的同時(shí)，也存在著清除過(guò)程，當(dāng)吸收與清除過(guò)程達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，蓄積量就不再增加

26、，即達(dá)到蓄積的極限值。 (2)蓄積性規(guī)律 (3)蓄積的極限值 化學(xué)物在體內(nèi)消除按一室模型一級(jí)速率過(guò)程，其公式為 dcdt=-Kec(4)蓄積性評(píng)估 3蓄積率測(cè)定法 蓄積率(cumulative percent)測(cè)定法，常用的動(dòng)物為小鼠或大鼠。首先將受試動(dòng)物分成蓄積試驗(yàn)驗(yàn)組和對(duì)照組兩大組，每組動(dòng)物數(shù)6070只。蓄積性試驗(yàn)組動(dòng)物每次以一定劑量(低于最小最死量)按同一染毒途徑預(yù)先給受試物，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間之后，按常規(guī)方法測(cè)定蓄積性實(shí)驗(yàn)組和對(duì)組的LD50。并按下式計(jì)算蓄積率。 蓄積率應(yīng)標(biāo)明預(yù)先給受試物的時(shí)間及劑量。在相同時(shí)間及劑量條件下，蓄積率越大則表示該物質(zhì)在體內(nèi)的蓄積作用越強(qiáng)；反之，蓄積性則越弱。第四

27、節(jié) 慢性毒性作用及其試驗(yàn)與評(píng)價(jià)方法 一、慢性毒性試驗(yàn)的概念 慢性毒性試驗(yàn)(chronic toxicity test)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期小劑量反復(fù)接觸受試物所引起的毒性效應(yīng)，亦稱(chēng)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。 二、慢性毒性試驗(yàn)的目的 慢性毒性試驗(yàn)是對(duì)化學(xué)物一般毒性評(píng)價(jià)的最后階段，主要目的如下。 (1)確定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期接觸受試物的毒性下限，即造成損害作用的最低劑量(LOAEL)，或慢性毒性的閾劑量和最大無(wú)作用劑量(NOEL)，即未觀(guān)察到造成損害作用的最大劑量(NOAEL)。 (2)為制定外來(lái)化學(xué)物質(zhì)在食品中的安全限量，如人體ADI值，以及為危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)與管理提供毒理學(xué)依據(jù)。 (3)進(jìn)一步研究慢性毒作用特點(diǎn)、毒作用靶

28、器官及毒理機(jī)制，為將動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果外推到人的安全系數(shù)選擇提供參考。三、慢性毒性試驗(yàn)方法 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和要求 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇基本同亞慢性毒性試驗(yàn)。一般多用小白鼠、大白鼠、犬和猴。年齡要求一般為初斷乳，如小白鼠出生后3周(體重約1015g)，大白鼠出生后34周(體重約5070g)，犬一般選用46月齡。性別要求雌雄各半。動(dòng)物數(shù)量要求比亞慢性毒性試驗(yàn)多，試驗(yàn)中途如需處死動(dòng)物，則需相應(yīng)增加動(dòng)物數(shù)量。一般要求試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每個(gè)劑量組每一性別嚙齒類(lèi)動(dòng)物數(shù)不少于10只，非嚙齒類(lèi)動(dòng)物數(shù)不少于4只。檢疫和適應(yīng)要求同急性和亞慢性毒性試驗(yàn)。 2染毒方法 染毒方法和途徑盡量選擇和人類(lèi)接觸途徑相似的方式。由于試驗(yàn)期長(zhǎng)，一般采

29、用經(jīng)口染毒，多采用飼喂法。 3劑量設(shè)計(jì)與分組 (1)試驗(yàn)設(shè)組 一般設(shè)高、中、低3個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組，共4組。 (2)劑量設(shè)計(jì) 慢性毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)的原則是，高劑量組不能出現(xiàn)明顯中毒，但要有輕微毒性反應(yīng)；中劑量組應(yīng)為慢性毒性作用的閾值劑量；低劑量組應(yīng)為慢性毒性的最大無(wú)作用劑量組。具體確定依據(jù)如下。 以該受試物的亞慢性毒性作用閾劑量或LOAEL為參考依據(jù)設(shè)計(jì) 高劑量組：以亞慢性毒性作用的閾劑量，或其1512的劑量。 中劑量組：以亞慢性毒性作用閾劑量的110150劑量。 低劑量組：以亞慢性毒性作用閾劑量的1100劑量。 以該受試物L(fēng)D，。為參考依據(jù)設(shè)計(jì) 高劑量組：以L(fǎng)D，。的110為高劑量。 中劑量組：以L(fǎng)D，。的l100為中劑量。 低劑量組：以L(fǎng)D，。的11000為低劑量。