題目：乳酸中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定

1、 分類號：2011屆本科生畢業(yè)論文題目：乳酸中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定Title：Lactic acid streptococcus thermophilus cultured in the separation and identification系 別：化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院專 業(yè)：07級生物技術(shù)學(xué)生姓名：邵志國學(xué) 號：指導(dǎo)老師：郭志華職 稱：講師 2011年4月17號摘 要 目的從乳酸中將嗜熱鏈球菌分離出并進行鑒定。方法 利用MRS培養(yǎng)基將乳酸中的菌種培養(yǎng)，經(jīng)過革蘭氏染色、鏡檢分離出嗜熱鏈球菌，最后選出7株，對它進行菌落形態(tài)的觀察。最后對其進行各種理化鑒定。結(jié)果鏡檢結(jié)果該菌為革蘭氏陽性，經(jīng)過生

2、化鑒定該菌為嗜熱鏈球菌。關(guān)鍵詞：乳酸；嗜熱鏈球菌；分離；鑒定。ABSTRACT objective the streptococcus thermophilus cultured from lactic acid will isolate and evaluations. method Use the media will lactic acid bacteria MRS cultivation, and after gram's staining, isolated anti-bma streptococcus thermophilus cultured, finally chose

3、n for it, seven strains colony morphology observation. Finally the various physical and chemical identification. result microscopy results this for gram-positive bacteria, after biochemical identified the bacteria for streptococcus thermophilus cultured. Keywords: lactic acid; Streptococcus thermoph

4、ilus cultured; Depart; appraisal 目 錄緒論51 試驗材料與方法61.1試驗材料61.2 實驗試劑61.3 實驗方法61.3.1 乳酸菌的篩選61.3.2 乳酸菌的分離純化61.4 理化性質(zhì)的測定72 結(jié)果與討論82.1菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)82.2生化試驗結(jié)果113 小結(jié)12參考文獻13致 謝14緒論乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵的糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。這類細(xì)菌廣泛分布在土壤、植物根莖、湖泊及動物的體內(nèi)。酸菌從形態(tài)上可以分為球菌和桿菌，并且均為革蘭氏染色陽性、在缺少氧氣的環(huán)境中生長良好的兼性厭氧性或厭氧性細(xì)菌。目前，對乳酸菌的應(yīng)用研究，著重于發(fā)酵乳制品、發(fā)酵食品和醫(yī)

5、藥工業(yè)等人類生活密切相關(guān)的領(lǐng)域。乳酸是以新鮮牛乳經(jīng)有效殺菌，用不同乳酸菌發(fā)酵劑制成的乳制品。由于該產(chǎn)品營養(yǎng)價值較高，并能改善腸道正常微生物區(qū)系的穩(wěn)定，因此它已成為深受消費者青睞的營養(yǎng)保健食品。在我國市場上，生產(chǎn)銷售的各種乳酸制品中，作為發(fā)酵劑使用的乳酸菌，通常為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。乳酸的生產(chǎn)是利用原始菌種進行逐級擴大培養(yǎng)方式進行，即活化復(fù)壯再進行擴大培養(yǎng)至乳酸菌的活力都達到可用程度后，投入生產(chǎn)進行發(fā)酵。在發(fā)酵劑的活化過程中，工序多，技術(shù)要求嚴(yán)格，稍有不甚就會污染雜菌，通過對乳酸發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌的分離和鑒定能及時掌握研究進程和生產(chǎn)控制。1 實驗材料和方法1.1 材料和儀器乳酸：采購于超市

6、 伊利；化學(xué)試劑：均為國產(chǎn)分析純。超凈工作臺、酒精燈、接種環(huán)、滅菌鍋等。1.2 實驗試劑 MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，肉膏10 g，酵母提取物5 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g ，KHPO4 2 g，MnSO4.4H2O 0.25 g，MgSO4.7H2O 0.58g， 葡萄糖20g，吐溫80 1ml，瓊脂25g，水1000ml。調(diào)PH6.26.4，121滅菌15min。 PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，鹽溶液4.0 g，蒸餾水100ml。調(diào)PH值6.0左右，113滅菌20min。 蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨5g，Nacl2.5 g，蒸餾水500ml。調(diào)ph值7.

7、0左右，121滅菌20min。 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，KHPO4 2g，蒸餾水1000ml，調(diào)PH值7.07.2，過濾，121滅菌30min。 明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，酵母提取物1.0 g，葡萄糖0.1g，明膠12.0g，鹽溶液4.0ml，蒸餾水100ml，ph值7.0,113115滅菌1520min。 可溶性淀粉培養(yǎng)基：向PY培養(yǎng)基中加入0.5%可溶性淀粉。 1.3 實驗方法1.3.1 乳酸菌的篩選 將乳酸均勻涂布于MRS培養(yǎng)基平板上，37靜置培養(yǎng)48h。1.3.2 乳酸菌的分離純化 挑取培養(yǎng)基上的菌落，劃線分離純化23次，最后選擇單菌落，經(jīng)過鏡檢確認(rèn)為純種

8、，得到7株菌株，4斜面保存。將菌落平板和細(xì)胞形態(tài)在顯微鏡下用照相機照出。1.4 理化性質(zhì)的測定1.4.1 KOH試驗 用滅菌的接種環(huán)加12環(huán)5%的KOH溶液于干凈的載玻片上，調(diào)菌于溶液中，用環(huán)將其混合攪勻，短時間內(nèi)KOH試劑陽性菌會越攪越稠，抬起接種環(huán)會產(chǎn)生拉絲現(xiàn)象，而KOH陰性菌則無拉絲現(xiàn)象。1.4.2 過氧化氫酶測定 用滅菌的接種環(huán)加12環(huán)10%過氧化氫溶液于干凈的載玻片上，挑菌于溶液中，攪拌均勻。觀察產(chǎn)氣泡情況，有氣泡產(chǎn)生，則判斷為過氧化氫酶陽性反應(yīng)。1.4.3 需氧試驗 將分離純化后的各菌株分別接種于高層MRS液體培養(yǎng)基中，37靜置培養(yǎng)2d后，觀察生長情況。1.4.4 淀粉水解試驗 將

9、各菌株分別接種到可溶性淀粉培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)12天。然后向培養(yǎng)液中加入34滴盧戈氏碘液，如不顯色表示淀粉水解陽性反應(yīng)，顯藍黑色或藍紫色時，表示淀粉水解或水解不完全，為陰性反應(yīng)。1.4.5 明膠液化 試驗菌株接種后適溫培養(yǎng)，觀察結(jié)果時需經(jīng)低溫處理。如對照管（未接種）凝固而接種管液化則為陽性反應(yīng)，同時凝固或者液化為陰性反應(yīng)。1.4.6 吲哚試驗 向培養(yǎng)2d后的含菌蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加34滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置1min3min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚試劑，在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。1.4.7 V-P試驗 將各菌株接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)2

10、d后，向培養(yǎng)物內(nèi)加入510滴40%的KOH，然后加入等量的5% -萘酚溶液，用力振蕩，再放入37溫箱中保溫15min30min，以加快反應(yīng)速度。若培養(yǎng)物成紅色，則為V-P反應(yīng)陽性。1.4.8 產(chǎn)葡聚糖測試 將菌株接種于加有10%蔗糖的MRS斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)24d，如斜面培養(yǎng)物形成粘稠狀菌苔，表明產(chǎn)生葡聚糖，為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。1.4.9 碳水化合物產(chǎn)酸試驗 采用PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在其中加入碳水化合物，終濃度達到1%，管內(nèi)培養(yǎng)基高度約45cm。滅菌后接入菌株各1環(huán)，37培養(yǎng)2d。取未加入碳水化合物的培養(yǎng)基作為對照，結(jié)晶紫試劑比較顏色的變化記錄產(chǎn)酸的強弱。2 結(jié)果與討論 2.1 菌落形

11、態(tài)和細(xì)胞 分離到的7株菌，菌落乳白色、灰色或略顯黃色；大而平坦或小而厚，菌落濕潤且大及邊緣整齊。 鏡檢細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式及革蘭氏鑒定結(jié)果見表一 表一 7株菌的形態(tài)特征及大小Table 1 7 strains bacteria the morphological characteristics and size編號染色大小/um形態(tài)排列方式1G+1.0*(1.0-1.5)橢球單個或呈短鏈2G+1.0*(1.0-1.3)橢球單個或成對或呈短鏈3G+1.0*(1.0-1.4)橢球單個或呈短鏈4G+1.0*(1.0-1.3)橢球單個或呈短鏈5G+1.0*(1.0-1.4)橢球單個或呈短鏈6G+1

12、.0*(1.0-1.5)橢球單個或呈短鏈7G+1.0*(1.0-1.5)橢球單個或成對或呈短鏈從表一看出，從酸奶中分離出的7株 為嗜熱鏈球菌 符合乳酸菌的特性。下面附平板和細(xì)胞的照片 嗜熱鏈球菌的細(xì)胞形態(tài)Streptococcus thermophilus cultured cell type嗜熱鏈球菌的菌落形態(tài) Streptococcus thermophilus cultured colony morphology2.2 生化試驗檢測結(jié)果 對篩選的7株菌進行進一步的試驗鑒定結(jié)果見表2、表3。從表2、表3可見，所有7株菌種都能水解淀粉，KOH試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗均為陰性，

13、但對于多種糖的利用情況不同。表2 7株菌株的生化試驗結(jié)果 Table 2 7 strains isolated biochemical test result項目1 234567KOH試驗-淀粉水解+接觸酶試驗-需氧試驗好氧好氧兼性厭氧微好氧微好氧微好氧微好氧明膠試驗-吲哚試驗-V-P試驗-+-產(chǎn)葡聚糖-+注：“+”表示陽性反應(yīng)：“-”表示陰性反應(yīng)。表3 7株菌的碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗結(jié)果Table 3 7 strains bacteria carbohydrates ferment produce acid test results碳水化合物1 234567葡萄糖+麥芽糖+乳糖+-+-蔗糖+

14、注：“+”表示陽性反應(yīng)：“-”表示陰性反應(yīng) 小結(jié)市售的乳酸中的乳酸菌多為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌其中球菌較少。采用常規(guī)的革蘭氏染色、形態(tài)觀察的方法對分離到的菌株進行簡單鑒定,該方法操作簡單、快速、實驗結(jié)果可靠。分離到的嗜熱乳酸鏈球菌菌株經(jīng)活化后可以應(yīng)用到生產(chǎn)中。參考文獻1陳曉平,劉華英,魏曉川.自然發(fā)酵酸菜汁中乳酸菌的分離篩選與鑒定研究J.食品科學(xué).2006(2):91-93.2楊曉暉,籍保平,李博,等.泡菜中優(yōu)良乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能的研究J.食品科學(xué).2005(5):130-133.3黃秀梨.微生物學(xué)實驗指導(dǎo)M.北京:高等教育出版社,1999:58-594鄧放明,李羅明,尹華.碎鮮辣椒發(fā)酵制品發(fā)酵用乳酸菌的選育與接種發(fā)酵試驗J.食品科學(xué).2005(3):106-108.5黃君紅,成潔珊,陳青荷.乳酸菌生長最佳培養(yǎng)基的篩選J,中國釀造.2001(2):9-11.致謝在本論文完成之